中醫藥研究常用分子生物學技術

教學參考資料唐炳華、王繼峰:醫學分子生物學(第一版）,中國中醫藥出版社,2006年胡維新:醫學分子生物學（第一版）,科學出版社,2007年T.A.Brown著，魏群等譯：基因克隆和DNA分析（第五版），高等教育出版社，2003年王艷明、周坤福、徐力：分子生物學與中醫藥研究，上海中醫藥大學出版社，2000年RobertF.Weaver：MolecularBiology（3rded），

McGraw-HillPress.2005[美]J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯：分子克隆實驗指南（第三版），科學出版社，2002年朱玉賢、李毅、鄭曉峰：現代分子生物學（第三版），高等教育出版社，2007年

教學參考資料盧圣棟：現代分子生物學實驗技術，高等教育出版社，1993年J.D.WatsonetalMolecularBiologyoftheGene

5thTheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.2003Lewin,B.,GENES

Ⅷ.UniversityPress,Oxford.2004孫乃恩孫東旭朱德煦：分子遺傳學（第二版），南京大學出版社，1997年網址：（參見教材P274表7-3）第一章緒論一、什么是分子生物學分子生物學已廣泛滲透到醫學科學的各個領域，成為現代醫學的理論基礎。微生物學臨床各學科細胞學免疫學病理學藥理學生理學分子生物學二、分子生物學的主要研究內容

（一）分子生物學理論1、核酸的分子生物學：研究核酸的結構及其功能。分子遺傳學（moleculargenetics）是其主要研究內容包括①核酸/基因組的結構，②遺傳信息的復制，③轉錄與翻譯，④核酸存儲的信息突變與修復，⑤基因表達調控和基因工程技術的發展和應用等。遺傳信息傳遞的中心法則（centraldogma）是其理論體系的核心。二、分子生物學的主要研究內容

（一）分子生物學理論：1、核酸的分子生物學：研究核酸的結構及其功能。（二）

分子生物學技術1、基本技術分光光度技術；電泳技術（瓊脂糖凝膠電泳，醋酸纖維素薄膜電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電聚焦，λ噬菌體的限制性內切酶酶切片段）；放射性同位素技術；色譜技術（層析法，吸附色譜法，分配色譜法，離子交換色譜法，凝膠色譜法，親和色譜法，高效液相色譜法）；細胞培養等二、分子生物學的主要研究內容（二）

分子生物學技術2、核酸操作技術核酸的提取和純化；DNA、RNA合成技術；DNA重組技術；核酸雜交技術；DNA序列測定技術等。3、實用蛋白技術蛋白質的提取和純化；蛋白質測定；蛋白質印跡技術；蛋白質質譜分析技術等。二、分子生物學的主要研究內容分子生物學中的兩項最重要的實驗技術

分子生物學的誕生和發展中的瓶頸基因克隆（DNA重組，基因工程）

(Geneclone,DNArecombination,geneengineering)

基因轉移載體的發現vectorDNA操作工具酶的發現DNAmanipulation

基因合成和基因測序sequencePCR技術(polymerasechainreaction)三、分子生物學的發展簡史

（一）準備和醞釀階段

19世紀后期到20世紀50年代初，是現代分子生物學誕生的準備和醞釀階段。在這一階段產生了兩點對生命本質的認識上的重大突破：

1、確定了蛋白質是生命的主要基礎物質2、確定了生物遺傳的物質基礎是DNA1944年O.T.Avery等證明了肺炎球菌轉化因子是DNA1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用DNA35S和32P分別標記T2噬菌體的蛋白質和核酸

,證明遺傳物質是DNA。（二）現代分子生物學的建立和發展階段

這一階段是從50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結構模型作為現代分子生物學誕生的里程碑，開創了分子遺傳學基本理論建立和發展的黃金時代。

1、中心法則的建立Watson和Crick就提出DNA復制的可能模型。1956年A.Kornbery首先發現DNA聚合酶。1958年Meselson及Stahl用同位素標記和超速離心分離實驗為DNA半保留模型提出了證明。1968年Okazaki（岡畸）提出DNA不連續復制模型。（二）現代分子生物學的建立和發展階段1972年證實了DNA復制開始需要RNA作為引物

1958年Weiss及Hurwitz等發現依賴于DNA的RNA聚合酶

1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA雜交證明mRNA與DNA序列互補

60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質的遺傳密碼

1970年Temin和Baltimore又同時從雞肉瘤病毒顆粒中發現以RNA為模板合成DNA的反轉錄酶

（三）初步認識生命本質并開始改造生命的深入發展階段

70年代后，以基因工程技術的出現作為新的里程碑，標志著人類深入認識生命本質并能動改造生命的新時期開始。其間的重大成就包括：

1、重組DNA技術的建立和發展1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等發現的限制性核酸內切酶為基因工程提供了有力的工具；1972年Berg等將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功，轉化大腸桿菌，使本來在真核細胞中合成的蛋白質能在細菌中合成,打破了種屬界限；1、重組DNA技術的建立和發展1977年Boyer等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽

1979年美國基因技術公司用人工合成的人胰島素基因重組轉入大腸桿菌中合成人胰島素。

1、重組DNA技術的建立和發展我國已有人干擾素、人白介素2、人集落刺激因子、重組人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹瀉疫苗等多種基因工程藥物和疫苗進入生產或臨床試用。1982年Palmiter等將克隆的生長激素基因導入小鼠受精卵細胞核內，培育得到比原小鼠個體大幾倍的“巨鼠”。1991年美國向一患先天性免疫缺陷病（遺傳性腺苷脫氨酶ADA基因缺陷）的女孩體內導入重組的ADA基因，獲得成功。

1994年我國用導入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治療了乙型血友病的患者。

2、分子生物學技術的應用和發展

⑴癌基因的發現⑵基因診斷⑶基因組文庫的建立⑷基因工程生產人胰島素⑸轉基因動物⑹人類基因治療⑺基因工程抗體技術的建立和發展⑻DNA芯片技術（基因芯片、生物芯片）3、基因組研究的發展

1977年Sanger測定了ΦX174-DNA全部5375個核苷酸的序列；

1978年Fiers等測出SV-40DNA全部5224對堿基序列；

20世紀80年代λ噬菌體DNA全部48,502堿基對的序列全部測出；

1996年底許多科學家共同努力測出了大腸桿菌基因組DNA的全序列長4x106堿基對。

1990~2003年人類基因組計劃（HumanGenomeProject）實施并基本完成。4、基因表達調控機理

1961年，Jacob，F.和Monod，J.提出了操縱子模型，打開了人類認識基因表達調控的窗口。20世紀70年代以后才逐漸認識了真核基因組結構和調控的復雜性。

1977年最先發現猴SV40病毒和腺病毒中編碼蛋白質的基因序列是不連續的，揭開了認識真核基因組結構和調控的序幕。

1981年Cech等發現四膜蟲rRNA的自我剪接，從而發現核酶（ribozyme）。

20世紀80-90年代，使人們逐步認識到真核基因的順式調控元件與反式轉錄因子、核酸與蛋白質間的分子識別與相互作用是基因表達調控根本所在。

6、小分子RNA研究進展1993年，LeeRC等發現線蟲（C.elegans）lin-4基因編碼的長度為22~61b的小分子RNA關閉線蟲不同發育階段mRNA轉錄的作用，這是繼核酶以后，內源性RNA參與基因調節的又一證據。小分子RNA(miRNA或siRNA）具有調控基因表達的功能。miRNA可以通過部分互補結合到目的mRNA的3′非翻譯區，抑制蛋白質合成。這種結合并不誘導目的mRNA的降解。siRNA能誘導細胞內基因沉默，與長雙鏈RNA有同源序列的mRNA被降解，從而抑制基因的表達。二十一世紀生物學的新熱點及領域

結構生物學（StructuralBiology）

生物大分子的高級三維結構與功能的統一生物大分子之間的互作→基因的社會學分子發育生物學（MolecularDevelopingBiology）基因表達，基因互作

器官發生胚胎形成個體發育五、分子生物學技術在中醫藥研究中的應用

（一）在中醫基礎理論研究中的應用1、證本質的研究近年來運用分子生物學技術對腎的實質、活血化瘀理論及中藥抗衰老機理進行研究例①沈自尹等采用RT-PCR法進行了“補腎健脾活血三類復方對下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸及促腎上腺激素釋放因子（CRF）基因表達的影響”的研究，其目的是從分子水平來闡述藥物對腎陽虛證的主要調節點。例②陳可冀等應用斑點印跡雜交、原位雜交、和3H-TdR摻入細胞DNA等技術，證明活血化瘀類中藥都可抑制血管壁血小板衍化生長因子（PDGF）基因及血管壁原癌基因c-mycmRNA的表達水平，從而抑制動脈平滑肌細胞增生，阻止動脈粥樣硬化。研究表明，活血化瘀類中藥干預基因調控、抑制原癌基因表達。例③沈小珩采用分子生物學技術對二仙湯及其拆方影響老年大鼠肝組織超氧化物岐化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性及其基因表達水平的觀察發現，老年大鼠氧化脂質（LPO）含量明顯提高，超氧化物岐化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性降低，而且與這類編碼這類酶的基因表達水平密切相關，用二仙湯及其拆方治療后，大鼠氧化脂質（LPO）含量明顯降低，提高了超氧化物岐化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性。五、分子生物學技術在中醫藥研究中的應用

（一）在中醫基礎理論研究中的應用2、治則治法的研究科研人員用抑癌扶正行氣活血法治療經二乙基亞硝胺誘導的肝癌大鼠，采用DD-PCR（差異顯示技術）和Northernbolt對治療后大鼠肝組織進行檢測，發現肝癌組織若干癌基因轉錄水平降低。（見P8）五、分子生物學技術在中醫藥研究中的應用

（二）在中醫臨床上的應用吳志奎等進行了“補腎生血方對β-地中海貧血基因水平的影響”的研究，結果發現，補腎生血藥能明顯提高β-地中海貧血患者血紅蛋白（Hb）和抗堿血紅蛋白（HbF），提高血紅蛋白的珠蛋白鏈比。起作用機制可能是補腎生血藥能提高珠蛋白鏈γ/β+γ比值，促進γ-珠蛋白基因的表達，誘導HbF合成，從而代償了β-珠蛋白基因功能缺陷。五、分子生物學技術在中醫藥研究中的應用

（三）在針灸研究中的應用1、針刺鎮痛與C-fos、C-jun、CC-k基因的研究2、耳針與表皮生長因子RACTH的研究3、電針抗癇與CCK基因表達的研究4、電針與抗腦缺血與C-fos原癌基因表達的研究5、針刺抑制老年大鼠與垂體細胞因子基因表達6、電針對細胞凋亡的影響7、針刺對脊髓背角內生長期相關蛋白GAP43表達的影響8、針刺對雌性大鼠垂體雌激素受體mRNA表達和血雌二醇（E2）水平影響的研究9、“醒腦開竅”針法對實驗性腦梗死大鼠腦細胞核糖核酸的影響（四）在中藥研究中的應用1、鑒定中藥材及藥用植物資源保護常用DNA分子標記法，其是指以DNA多態性為基礎的遺傳標記。

DNA分子遺傳標記常用的方法是RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA——隨機引物擴增多態DNA)是1990年由Williams等發展起來的。分子標記主要應用：

遺傳育種

生藥鑒定和藥材道地性

五、分子生物學技術在中醫藥研究中的應用

2、獲取有效成分一是