南方醫科大學基因工程研究所生物化學與分子生物學教研室周玨宇常用分子生物學技術的原理及應用Thepopulartechnologyinmolecularbiology:principleandapplication一、分子雜交與印跡技術二、PCR技術的原理與應用三、核酸序列分析四、基因文庫五、生物大分子相互作用研究技術六、遺傳修飾動物模型的建立和應用主要內容2第一節

分子雜交與印跡技術

Molecularhybridization

&blottingtechnology3核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)

在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術的原理4實質是核酸分子的變性與復性過程5核酸分子雜交技術是依據DNA雙鏈堿基互補、變性和復性原理，用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針檢測樣本中是否存在與其互補的同源核酸序列。6雜交分離、變性、轉移、固化DNA片段標記核酸探針制備待測核酸樣品制備核酸探針分子雜交操作程序預雜交加入標記核酸探針漂洗除去未參與雜交的標記探針檢測雜交信號7（一）印跡技術利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術。8帶有放射性核素、生物素或熒光染料標記的，且序列已知的，與目的基因互補的核酸序列被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術9二、印跡技術的類別及應用（一）DNA印跡(SouthernBlotting)（二）RNA印跡(NorthernBlotting)（三）蛋白質的印跡(WesternBlotting)用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。10英國人Southern(1975)發明，將瓊脂糖中的DNA轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上進行DNA分子雜交分析的方法。

Southern印跡EdwinSouthern11是經典的RNA分析法，用于組織細胞中總RNA或mRNA的定性和定量分析。過程類似于Southernblotting。

Northern印跡12Northern印跡分析原理示意圖13Nouthern印跡檢測miRNA的表達14蛋白質水平上檢測細胞或組織中特定基因的表達活性的最常用的方法（定性和半定量分析）。Western印跡15蛋白質樣品的制備SDS分離蛋白質轉膜特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質（抗原）印跡雜交再經偶聯了可檢測標記信號的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯辣根過氧化物酶的Ig）最后經與酶的底物反應而顯影、成像，經掃描后獲取免疫印跡信息Westernblot基本程序161718辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗可以使加入的化學發光底物發生氧化降解，發射波長為428nm的光，并可通過X光膠片感光記錄下來。

19SDSpurifiedrecombinanthumanCK2α(重組人酪蛋白激酶2α)subunitanditsWesternblotting用已知的特異抗體檢測目的基因蛋白重組人酪蛋白激酶2α

20三種印跡技術的比較21放射自顯影照片22其他：斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA芯片(DNAchip)23斑點印跡(dotblotting)將RNA或DNA變性后直接點在尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的寡核苷酸探針與之雜交。用途：特定基因的定性分析。2425原位雜交（insituhybridization，ISH）將標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，進而檢測特異的DNA或RNA序列。可對細胞或組織中原位表達的mRNA進行區域定位。優點：不需提取核酸，故可完整保持組織或細胞的形態，因而更能準確地反映組織細胞的功能狀態。26小鼠大腦皮層mRNA原位雜交細胞原位雜交27miRNA的原位雜交2829DNA芯片將多種已知序列的DNA排列在一定大小的固相支持物上用于檢測細胞或組織樣品中的核酸種類的技術。3031疊加圖：綠色代表下調；紅色代表上調；黃色無差異。正常樣品Cy3標記待測樣品Cy5標記疊加石奕武，胡維新等：多發性骨髓瘤的基因表達譜分析，湖南醫科大學學報，2003，28（3）：201－205321.芯片的制備

Geneprobes（cDNA、DNA）substrate

Ready-to-usemicroarrayOligoprobesAGCTorarrayer33SamplecellsExtractRNAorDNA2)RTorPCRamplification3)FluorescentlabelingReferencecellsSamplereadycombineLabeledRNAorDNA(Sample)LabeledRNAorDNA(Reference)

2)1)3)1)2)3)2.基因表達譜雙色標記343.分子雜交1)hybridizeApplysample2)rinse354.檢測分析Laser1Laser2Detector1Detector2Scanner芯片的掃描365.圖像處理Detector1Detector2False-colordifferentialimage376.圖像分析383940第二節

PCR技術的原理與應用

（PolymeraseChainReaction，PCR）41聚合酶鏈反應（PolymeraseChainReaction，PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。421971年，Khorana（美國MIT教授，1968年諾貝爾醫學獎得主）：“經過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因。”核酸體外擴增最早設想被遺忘原因：（1）很難進行測序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等發現了II型限制酶，體外克隆基因已成為可能。431976年，臺籍科學家錢嘉韻（AliceChien）從黃石國家公園的嗜熱菌Thermus

aquaticus中分離出熱穩定的TaqDNA聚合酶。1985年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的KaryMullis發明PCR反應，Saiki等首次應用PCR法成功地擴增了人-珠蛋白的DNA，并應用于鐮刀狀紅細胞貧血的產前診斷。44451988年Saiki開始將耐熱性TaqDNA聚合酶應用于PCR，整個反應只加一次酶即可，擴增特異性和效率都明顯改善，操作大為簡化。1989年被譽為的“分子年”，PCR為十大科技發明之首。1993年，Mullis榮獲諾貝爾化學獎。46patentsoldbyCetuscorp.toLaRochefor$300milliondependsonthermo-resistantDNApolymerase(e.g.Taqpolymerase)andathermalcycler47TheNobelPrizeinChemistry1993"forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry"MichaelSmithLaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"485Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA一、PCR技術的工作原理55

555

5

5549Cycle355

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525～30次循環后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。5030次循環后靶序列擴增的數量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,82451理論擴增率：2n遞增（n為循環次數），25～30循環，目標DNA可增加109倍。實際擴增率：(１＋Ｘ)n，X為PCR的實際擴增率，平均約為75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴增產物的增加，逐漸由指數形式變為線性形式，所以實際上進行30個循環后，擴增倍數一般可達106～107。以上“變性、退火、延伸”三部曲為PCR一輪循環。52

53

PCR反應條件變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C54模板DNA引物TaqDNA聚合酶4種dNTP含Mg2+的緩沖液。PCR的反應體系55DNA

RNA：總RNA、mRNA、tRNA、

rRNA、病毒RNA基因組DNA質粒DNA

（一）模板（template）56模板DNA的來源：

—微生物中提取DNA—從細胞中提取DNA：血細胞、絨毛、尿樣、毛發、精斑、口腔上皮細胞

—固定和包埋的組織標本：脫蠟、蛋白酶K消化模板DNA的濃度：

0.1～2ug/100ul體系

—PCR產量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高

—模板DNA濃度過高導致非特異性產物增加

57（二）引物（primers）人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer58引物：決定PCR反應的特異性PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增59基本原則是最大限度地提高擴增效率和特異性，同時盡可能抑制非特異性擴增。引物設計的原則60①引物長度：

15-30bp，常用20bp左右—引物的有效長度不能大于38bp，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴增產物的特異性②引物擴增跨度：以500bp為宜—特定條件下可擴增長至10kb的片段61③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜

—G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶

—ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不應超過3個連續的G或C④避免引物內部出現二級結構和引物間互補

—特別避免3′端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異性的擴增條帶6263⑤引物3′端的堿基要求嚴格配對（不能做任何修飾）—特別是最末及倒數第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗⑥引物5′端可修飾

—引物5′端限定著PCR產物的長度，但對擴增特異性影響不大；引物5′端堿基可不與模板DNA

互補而呈游離狀態；引物5′端最多可加10個堿基而對PCR反應無影響

643’5’3’5’限制性內切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標記（放射性元素或非放射性物質，如生物素、地高辛等）。65⑦引物的特異性：—引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性⑧引物量：—每條引物的濃度0.1~0.5μM，以最低引物量產生所需要的結果為好—引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會66引物設計軟件PrimerPremier5.0OligoPrimerexpressprimer3MethPrimer67（三）DNA聚合酶（DNApolymerase）Thermusaquaticus68目前有兩種TaqDNA聚合酶供應天然酶：從水生嗜熱桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應約需酶量1-2.5U/100ul體系濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少69DNA聚合酶

Klenow片段

T4DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（應用最廣）其他DNA聚合酶：TthDNA聚合酶

VentDNA聚合酶

PfuDNA聚合酶等70特性：熱穩定性：92.5℃、95℃、97.5℃時，半衰期分別為130min、40min、5-6min延伸效率：75-80℃時，150個核苷酸/s校正功能：TaqDNA聚合酶沒有3’-5’外切酶活性，

Vent

、Pfu等具有3’-5’外切酶活性71（四）dNTP的質量與濃度在PCR反應中，dNTP應為50～200μM，濃度過低會降低PCR產物量注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配高濃度的dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性

72（五）PCR緩沖液（PCRbuffer）一般組成：50mMKCl,10-50mMTris-HCl（室溫PH8.3），1.5mMMgCl2

附加成分：牛血清白蛋白、明膠、非離子去污劑（如Tween20，濃度0.05%）二甲亞砜（DMSO）73Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應產物減少74二、PCR技術的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因的體外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析75巢式PCR（nestedPCR）逆轉錄PCR（RT-PCR）原位PCR（insituPCR）熒光定量PCR（qPCR）三、幾種重要的PCR衍生技術76其他PCR技術名稱主要用途簡并引物擴增法擴增未知基因片斷巢式PCR提高PCR敏感性、特異性，可分析突變復合PCR同時檢測多個突變或病原反向PCR擴增已知序列兩側的未知序列，致產物突變單一特異引物PCR擴增未知基因組DNA單側引物PCR通過已知序列擴增未知cDNA錨定PCR分析具有不同末端的序列增效PCR減少引物二聚體，提高PCR特異性固著PCR有利于產物的分離cDNA末端快速擴增擴增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色體基因原位PCR研究表達基因的細胞比例臆斷PCR鑒定細菌或遺傳作用通用引物PCR擴增相關基因或檢測相關病原77（一）巢式PCR（nestedPCR）TwosetsofprimersareusedintwosuccessivePCRs.78原理：先在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板合成互補的cDNA（complementaryDNA），再以cDNA為模板進行PCR反應。是一種快速、簡便、敏感性極高的檢測mRNA表達的方法。（二）逆轉錄PCR（RT-PCR）798081（三）原位PCR技術(insituPCR)原位PCR技術就是將PCR技術的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起來，從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。

保持了兩項技術的優勢又彌補了各自的不足。是細胞學診斷中一種嶄新的檢測技術。82細胞或組織固定：經固定和乙醇通透化處理后適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進入；PCR擴增細胞內目的片段；原位雜交檢測擴增產物。83multidrugresistanceassociated-protein(mrp)genemultidrugresistanceassociatedprotein84（四）實時PCR技術(realtimePCR)實時PCR(real-timePCR)技術通過動態監測反應過程中的產物量，消除了產物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。兩種方法：SYBRgreen（熒光染料摻入法）和Taqmanprobe（探針法）。

85實時熒光定量PCR常規定量PCR技術：

—對PCR擴增反應的終產物進行定量

—重復性差

—半定量實時定量PCR技術：對PCR擴增反應中每一輪循環的產物進行定量

86同一個樣品重復96次起點定量與終點定量終點定量起點定量起始DNA量是樣本中本來的量，更有意義； 終點DNA量經過PCR“加工”，不是所需要的數據起點定量誤差小，終點定量誤差大87PCR方程只在指數期成立Log[DNA]循環數線性增長期平臺期y=x(1+e)n指數增長期88熒光定量PCR技術基本原理熒光擴增曲線圖Ct值閾值標準定量曲線

89熒光擴增曲線：每個循環收集一個熒光強度信號，通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到熒光擴增曲線。90什么是CT值熒光信號有統計學意義顯著增長（即穿過閾值線）時的循環次數從基線到指數增長的拐點所對應的循環次數半對數圖譜線性圖譜91什么是閾值（threshold）基線范圍閾值標準偏差基線信號的標準偏差x10熒光域值是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-15前15個循環的熒光信號為熒光本底信號92標準定量曲線CT值與起始DNA濃度的關系CT值lg起始DNA濃度CT=-klgX0+b93與DNA結合時發光游離時不發光

1.SYBRGreenI染料法SYBRGreenI是一種DNA小溝結合染料94在PCR過程中染料與DNA結合發光聚合完成聚合開始95熔解曲線

(Dissociationcurve)[導數圖譜][原始數據]只有染料法才需要做熔解曲線探針法沒有必要總的DNA雙螺旋結構降解一半的溫度稱為熔解溫度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。96染料法小結成本低：不需要探針適合初步篩查：先用SYBR篩查，再用探針法熔解曲線：鑒定PCR有無雜帶、引物二聚體無模板特異性：不能分辨主帶與雜帶，是總信號不能做多重檢測：每孔只能檢測一個目標基因靈敏度低：適合于5000拷貝以上的基因定量97

TaqMan探針的結構3'5'RQ3'3'5'5'3'5'5'2.熒光標記探針法98TaqMan探針定量原理reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.聚合probeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.鏈取代Q3'3'5'5'3'5'5'3.探針被切斷R3'5'5'3'5'5'4.聚合完成QRR=報告基團ReporterQ=淬滅基團Quencher3'99當某個熒光基團的發射譜與另一個熒光基團的吸收光譜重疊，且兩個基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，這個過程稱為熒光共振能量轉移(FRET)，實際相當于短波長熒光基團釋放的熒光被屏蔽。

F?rsterresonanceenergytransferthroughspace(F?rsterAnn.Phys.1948)熒光共振能量轉移(FRET)100Taq酶的5’→3’外切活性101TaqManMGB探針FAM

MGB完全配對，有信號FAM

MGB一個堿基不配對，沒有信號MGB探針能夠分辨1個堿基的差別102TaqManMGB探針原理AGGCCTTGAGAGATATRGCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACAGGCCTTGAGAGATATR||||||||||||||||QQ(non-fluorescentquencher)NFQQMGB

(minorgroovebinder)NFQMGBR報告熒光非熒光淬滅基團小溝結合物提高探針Tm值103降低背景熒光：MGB探針的淬滅基團NFQ，本身不產生熒光，可以大大降低本底信號的強度。提高Tm值，探針設計更短：MGB修飾基團，可以將探針的Tm值提高10°C左右，使MGB探針可比普通TaqMan探針設計得更短，既降低了成本，也使探針設計成功率大為提高。104兩種探針比較TAMRA0.00.20.40.60.81.01.21.40510152025303540CycleNumberRnMGBTAMRA探針：長38-mer:ACTTTTCTGTAAGTAGATATAACTTTTCAAAAAGACAGMGB探針：長17-mer:CTGTAAGTAGATATAAC105Loop能和靶序列互補Stem是由互補序列組成分子信標（Molecularbeacon）3.TaqMan探針的衍生形式工作原理發夾形的寡聚核苷酸探針

內部淬滅的熒光團106RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標技術107Oligo1:FluoresceinOligo2:

LCRed640FRETProbesExcitationEmissionTransfer熒光能量傳遞雜交雙探針108探針法小結NoBlots!NoGels!既靈敏又特異：PCR與分子雜交的結合

雙倍放大：PCR放大與熒光放大的結合109110第三節

核酸序列分析

Nucleicacidsequenceanalysis111分子生物學的三大核心技術DNA序列分析—DNA測序，1977聚合酶鏈式反應—DNA擴增，1985DNA重組技術—基因克隆，1973112核酸序列分析的基本原理化學裂解法(Maxam-Gilbert法)末端合成終止法(Sanger法)DNA序列測定是基因診斷最確切的方法。113一、化學裂解法(Maxam-Gilbert法)基于某些化學試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發生專一性斷裂的特性，精確地控制反應強度，使一個斷裂點僅存在于少數分子中，不同分子在不同位點斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經電泳分離。分析前，用同位素標記DNA的5′末端，經放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。114Maxam-Gilbert化學降解測序法

115

(Sanger雙脫氧鏈終止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT1′3′OHαβγ5′雙脫氧核苷三磷酸脫去二、DNA鏈末端合成終止法116117DNA單鏈模板

末端終止117118119雙脫氧末端終止法

讀出模板互補序列dNTP

凝膠電泳

較大片段

較小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反應混合物Klenow酶

未知序列的單鏈DNA

讀出待測序列CTGACTTCGACAAAGAA5′3′

放射性標記的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3′5′CTGACTTCGACAA5′3′120121122TheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA""fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids"PaulBergWalterGilbertFrederickSanger1/2oftheprize1/4oftheprize1/4oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USAHarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom

123DNA自動測序法設計原理：以Sanger法為基礎熒光標記物：不同顏色的熒光分別代表A、G、C、T電泳電信號顯示124

同位素標記到熒光標記，平板電泳到毛細管電泳多色熒光標記毛細管電泳

單色熒光標記平板電泳同位素標記平板電泳ACGTACGT測序圖譜TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T125ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5′TGAATGA3′ACGCT126ABI3730DNA測序儀127DNA自動測序結果舉例128表示一個SNP位點，該位點出現了雙峰，對應的核苷酸分別為C和T，因此該位點為CT雜合型，如果該位點只有一個峰C或者T，則該位點基因型為CC或TT純合型129目前所用測序技術的缺點1、原理基于DNA鏈終止法，故測序長度受限，目前為1000nt左右。2、測序反應費時費力科學家們完成第一個人類基因組測序整整花了13年的時間，耗費了30億美元的費用。3、測序準確度不高

DNA聚合酶造成的堿基錯配，DNA序列判讀錯誤。4、測序基于PCR反應，需要引物，并且有些結構復雜的難于進行PCR反應的片段不能測序。130下一代測序技術又稱為二代測序技術，其代表技術為羅氏公司(Roche)的454測序儀(RocheGSFLXsequencer),Illumina公司的Solexa基因組分析儀(IlluminaGenomeAnalyzer)和ABI的SOLiD測序儀(ABISOLiDsequencer)。131①可實現大規模并行化分析②不需電泳，設備易于微型化③樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本

優勢：測序策略主要基于循環芯片測序法（Cyclic-arraysequencing），即制備DNA文庫，單分子擴增，在固相載體上形成DNA簇陣列，并行地利用DNA聚合酶或者連接酶進行酶促反應，同時讀取反應產生的特異性熒光信號，最終得到超大量的DNA序列信息。132舉例：Solexa測序HiSeq2000133基本流程：

①將基因組DNA隨機切割成為小片段DNA；②在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然后變性得到單鏈模板文庫；③將帶接頭的單鏈小片段DNA文庫固定于固體表面；④對固定片段進行克隆擴增，從而制成polony芯片。⑤針對芯片上的DNA，利用聚合酶或連接酶進行一系列循環反應，通過讀取堿基連接到DNA鏈過程中釋放出的光學信號而間接確定堿基序列。134Solexa測序：在一個反應中同時加入4種核苷的標簽，采用邊合成邊測序（SBS－sequencingbysynthesis）。完成人類基因組草圖不同測序儀的比較圖135單分子測序技術被稱為第三代測序技術

主要策略：

①通過摻入并檢測熒光標記的核苷酸，來實現單分子測序，如單分子實時技術（singlemoleculerealtimetechnology，SMRT）；②利用DNA聚合酶在DNA合成時的天然化學方式來實現單分子測序；③直接讀取單分子DNA序列信息。

136基因文庫

GeneLibrary第四節137基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)

基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。138一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區和非編碼區）以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構建基因組文庫的載體有噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。139cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經逆轉錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。二、cDNA文庫140141第五節

生物大分子相互作用研究技術ThemethodofProtein-proteinandProtein-DNAintraction142酵母雙雜交各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉換效應分析噬菌體顯示系統篩選等等一、蛋白質相互作用研究技術143標簽融合蛋白結合實驗是一個基于親和色譜原理的分析蛋白質體外直接相互作用的方法。（一）標簽蛋白沉淀標簽融合蛋白結合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結合、分析兩種分子結合的具體結構部位及篩選細胞內與融合蛋白相結合的未知分子。

144標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖145（二）免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原間專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。原理：如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。

146實驗流程示意圖147缺點為：1.可能檢測不到低親和力和瞬間的Pr-Pr相互作用2.兩種Pr的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；3.必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。148（三）酵母雙雜交技術的基本原理和用途149酵母轉錄因子（Gal4）與BD-fusion誘餌（bait）與AD-fusion獵物或靶蛋白（preyortargetprotein）報告基因（reportergene）

LacZ（編碼β-半乳糖苷酶）檢驗這兩種蛋白表達后能否激活酵母中的報告基因。150ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZreportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZreportergeneGAL4UASPromoterlacZreportergeneXDNA-BDX-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的顯色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下會產生藍色產物，所以可以輕易的檢測出LacZ基因的表達。

151酵母雙雜交系統的應用證明兩種已知基因序列的蛋白質可以相互作用的生物信息學推測。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質分子的相互作用功能結構域或關鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達質粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因的表達文庫，篩選未知的相互作用蛋白質。152或稱凝膠遷移變動實驗(gelshiftassay)，最初用于研究DNA結合蛋白與相應DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經成為轉錄因子研究的經典方法。目前也被用于研究RNA結合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質相互作用分析技術（一）電泳遷移率變動測定（EMSA）153細胞蛋白質提取物標記的DNA片段蛋白質與DNA結合蛋白質-DNA復合物電泳遷移滯后凝膠電泳顯影滯后條帶表明DNA是與蛋白質結合的區域只能確定DNA序列中含有蛋白結合位點凝膠遷移實驗結果示意圖154染色質免疫沉淀技術(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究體內DNA與蛋白質相互作用的主要方法。（二）染色質免疫沉淀法155原理：在活細胞狀態下用化學交聯試劑固定蛋白質-DNA復合物，并將