脂質(zhì)組學在脂質(zhì)膳食營養(yǎng)與健康研究中的應用,營養(yǎng)學論文內(nèi)容摘要：綜述了脂質(zhì)組學研究中的脂質(zhì)分析方式方法、常用的脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫、數(shù)據(jù)處理方式方法及脂質(zhì)組學在膳食營養(yǎng)與健康研究中的應用進展。本文關(guān)鍵詞語：脂質(zhì)組學,質(zhì)譜,膳食營養(yǎng),應用進展基于當代營養(yǎng)學的脂質(zhì)組學研究旨在探究膳食營養(yǎng)的作用機制,探究膳食脂類對體內(nèi)脂質(zhì)代謝通路的影響,客觀準確地鑒定出從健康到疾病發(fā)展經(jīng)過潛在的脂類生物標志物,進而制定出預防疾病、保持健康的膳食指南,對促進人類健康具有重要意義[1]。本實驗室曾對食用油甘油三酯質(zhì)譜分析方式方法的研究進展,食用植物油中甘油三酯色譜分析方式方法研究進展[2],長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯分析方式方法研究進展[3],磷脂分析方式方法與應用研究進展[4],以及基于化學衍生技術(shù)的游離脂肪酸的質(zhì)譜檢測方式方法研究進展[5]分別進行了綜述。本文就脂質(zhì)組學研究中的脂質(zhì)分析方式方法、脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫、數(shù)據(jù)處理方式方法及脂質(zhì)組學在膳食營養(yǎng)與健康研究中的應用進行了綜述與瞻望。1脂質(zhì)組學脂質(zhì)組學最早由Han和Gross[6]于2003年提出,包括脂質(zhì)組分析方式方法、數(shù)據(jù)處理方式方法和生物學意義闡述,研究范圍包括脂質(zhì)分子與蛋白質(zhì)、糖類等互相作用和與基因表示出調(diào)控之間的關(guān)系。越來越多的研究表示清楚,脂質(zhì)是調(diào)控細胞功能的關(guān)鍵物質(zhì),脂質(zhì)組學已成為基礎(chǔ)醫(yī)學和轉(zhuǎn)化醫(yī)療研究的重要領(lǐng)域[7,8],挑選用于預防或治療疾病的潛在生物標志物,為疾病的預防、診斷和監(jiān)控方式方法提供指導。2脂質(zhì)分析方式方法2.1樣品前處理方式方法2.1.1液液萃取(LLE)提取脂質(zhì)最經(jīng)典的液液萃取方式方法是Folch法[9,10]。Bligh-Dyer(BD法)[11]對Folch法進行改良,在氯仿、甲醇混合液中參加水或乙酸等緩沖劑,使得極性脂和非極性脂能更好地分離,BD法尤其適用于細胞懸液和組織勻漿中脂類的提取。另一種液液萃取方式方法是采用正己烷∶異丙醇(v/v,3∶2)作為提取溶劑[12],與Folch法相比,此種方式方法毒性更小,但由于提取效率不高未被廣泛應用。2020年,L9fgren等[13]用丁醇和甲醇來提取血漿中總脂,該法能夠在1h內(nèi)完成96個樣本中脂質(zhì)提取,并能很好分離甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)、磷脂(PL)、神經(jīng)酰胺(CM)等。2020年,Chen等[14]用甲基叔丁基醚單一溶劑同時提取脂質(zhì)及脂質(zhì)代謝物,甲基叔丁基醚有超強的選擇性,基質(zhì)中的不溶物能夠離心除去。近年來,無創(chuàng)檢測技術(shù)日益成熟,2021年,Jia等[15]用甲醇提取出皮膚角質(zhì)層中的483種鞘脂,而華而不實193種是潛在的區(qū)分不同年齡的標志物。除此之外,對于排泄物中脂質(zhì)的提取,由于提取步驟繁瑣,低豐度脂質(zhì)不易獲取等局限,也在進一步開發(fā)中[16]。除此之外,近年來出現(xiàn)了一些提取速度快、效率高的新方式方法,如超聲輔助液液萃取[17,18]、超臨界流體萃取[19]等,也開場應用于脂質(zhì)提取。2.1.2固相萃取(SPE)固相萃取能很好地分離純化和富集含量較低的脂質(zhì),邊娟等[20]采用TiO2/SiO2復合填料的固相萃取柱,快速高效地去除中性脂、游離脂肪酸,特異性地吸附磷脂。本實驗室采用磁性納米Fe3O4萃取材料,通過對其外表改性后,建立了基于新型磁固相萃取技術(shù)的痕量游離脂肪酸的快速富集純化及分析方式方法[21]。吳琳等[22]將氧化鎂復合弗羅里硅土填充的Florisil固相萃取柱對經(jīng)Sn-1,3專一性脂肪酶水解的藻油、微生物油脂、植物油、魚油和海豹油的產(chǎn)物進行分離富集。TrinidadPerez-Palacios等[23]用氨丙基修飾的SPE柱,實現(xiàn)了磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)四類磷脂的分離。王湘等[24]采用氨丙基的硅膠基質(zhì)SPE柱成功對大鼠肝臟脂質(zhì)中的PE進行了純化和富集。利用具有氧化鋯涂層的HybridSPE萃取柱中的氧化鋯與磷脂的磷酸根基團之間的路易斯酸堿作用,已成功地應用于生物樣本中磷脂的純化和富集[25]。ZicaiJia等[26]采用硅膠固相萃取柱從海參中分離出腦苷脂(一種鞘糖脂),結(jié)合色譜質(zhì)譜技術(shù)鑒定出89種腦苷脂,并分析了飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例及羥基脂肪酸的含量。2.2質(zhì)譜檢測技術(shù)2.2.1直接進樣質(zhì)譜技術(shù)(1)鳥槍法:鳥槍脂質(zhì)組學最早由Han和Gross[9]在2003年提出,該方式方法是根據(jù)脂質(zhì)分子極性基團在不同pH下帶電傾向不同,結(jié)合ESI源的正負離子切換形式,到達分離的目的,分離后進行定性定量分析。鳥槍法結(jié)合化學衍生的方式方法不僅檢測靈敏度大大提高,并能根據(jù)輕/重標記實現(xiàn)相對定量和絕對定量[27]。本實驗室采用丙酮及氘帶丙酮標記PE,結(jié)合質(zhì)譜雙中性丟失掃描對不同脂質(zhì)膳食的大鼠肝臟組織中45種PE進行了定性和相對定量分析[24]。ChunyanWang等[28]用三甲基硅重氮甲烷將磷脂酰肌醇衍生后,能準確地分析小鼠腦部組織中磷脂酰肌醇分子中磷酸基的位置和脂肪酸鏈構(gòu)造。本實驗室采用N,N-二乙基乙二胺(DEEA)為衍生試劑,成功對游離脂肪酸進行了衍生,提高了游離脂肪酸離子化效率,結(jié)合主成分分析,能區(qū)分不同工藝來源的冷榨菜籽油,并能夠有效監(jiān)控菜籽油中游離脂肪酸的含量變化,對食用油脂品質(zhì)及其摻偽保真具有重要意義[29]。(2)基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MAL-DI-MS):MALDI源常與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用,進行脂質(zhì)分析與質(zhì)譜成像研究。ShelleyN.Jackson等[30]利用銀納米材料修飾的MALDI基質(zhì),對小鼠心臟中的脂質(zhì)進行成像分析。在正離子形式下鑒定出29種脂類,在負離子形式下鑒定出24種脂類。2.2.2色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)直接進樣質(zhì)譜具有分析速度快的優(yōu)勢,但在分析基質(zhì)復雜的生物樣本時,會產(chǎn)生基質(zhì)效應。結(jié)合色譜的分離優(yōu)勢與質(zhì)譜的鑒定優(yōu)勢,能夠有效降低其他組分可能對目的化合物產(chǎn)生的基質(zhì)效應,同時復雜體系經(jīng)色譜分離以后進入質(zhì)譜檢測器,能提高質(zhì)譜掃描數(shù)據(jù)的可靠性。氣相色譜(GC)常用于脂肪酸等小分子量脂質(zhì)的組成分析[31]。高溫氣相色譜固定相的出現(xiàn),使得氣相色譜分析高沸點化合物成為可能,但高溫對不飽和物相對較高的脂質(zhì)具有毀壞作用,因而不合適分析含有長鏈多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)。GC還能有效分離脂肪酸同分異構(gòu)體和不飽和脂肪酸雙鍵的順反構(gòu)造,將不同極性氣相色譜串聯(lián)的全二維氣相色譜法,是分析多不飽和長鏈脂肪酸的有效方式方法[32]。液相色譜(HPLC)封閉的環(huán)境能有效避免脂類降解,幾乎所有類別的脂質(zhì)分子均能夠通過高效液相色譜實現(xiàn)分離[33]。正相色譜(NPLC)根據(jù)脂質(zhì)頭部基團極性的不同實現(xiàn)分離,適用于強極性脂類的分離,但由于流動相的強揮發(fā)性和強極性易引起保存時間的漂移,與質(zhì)譜串聯(lián)時不能很好地兼容,并會降低電噴霧電離源的霧化效率[34]。銀離子色譜(Ag-HPLC)作為一種特殊的正相色譜,基于銀離子與TAG不飽和脂肪酸中雙鍵之間的弱絡合吸附作用將雙鍵數(shù)和雙鍵位置不同的TAG分離。正相色譜常與反相色譜(RPLC)以互補的分離方式存在,RPLC常用于分離含同一類頭部極性基團而脂肪酰基鏈不同的脂質(zhì)分子,適用于弱極性和中等極性脂質(zhì)的分離,具有高選擇性和分離重現(xiàn)性好等優(yōu)勢,是應用最多的脂質(zhì)分離手段,但其對強極性脂質(zhì)保存和選擇性差,不利于極性脂的分析。使用RPLC色譜柱分析TAG時,TAG的保存時間與TAG的當量碳數(shù)(ECN)相關(guān),保存強度與ECN值成正比,一樣ECN值的TAG不能在RPLC中實現(xiàn)很好地分離,且RPLC對于TAG的位置異構(gòu)體選擇性差[35]。NChristinat等[36]用RPLC-MS成功分析了人血漿中的中長鏈游離脂肪酸,直鏈脂肪酸及含支鏈的異構(gòu)體,并能分離w-3和w-6不飽和脂肪酸的雙鍵位置異構(gòu)體。近年來,親水作用色譜被用于脂質(zhì)的分離,親水作用色譜(HILIC)[37]使用的流動相與RPLC的流動相系統(tǒng)類似,但HILIC的分離順序與NPLC類似,克制了NPLC法保存時間飄移的缺陷,重現(xiàn)性良好,并提高了色譜與質(zhì)譜的兼容性。Chaozhu等[38]利用HILIC二醇柱成功分離了血漿中的七大類磷脂。二維液相色譜能有效減少復雜生物樣本中低豐度代謝物的未檢出現(xiàn)象,并能有效區(qū)分同分異構(gòu)體和同位素峰,分辨率和峰容量較一維色譜都有了很大的改善,已廣泛應用于脂質(zhì)組學研究中[39]。二維液相色譜聯(lián)用有離線和在線兩種形式,離線形式[40]可單獨對每一維的色譜條件進行優(yōu)化,本實驗室建立了基于RPLC、Ag-HPLC的離線二維色譜聯(lián)用方式方法,并將其用于TAG的分離鑒定[52],但操作繁瑣、所需時間長、重現(xiàn)性差。在線形式[41,42,43]自動化程度高、重現(xiàn)性好、耗時短,但由于分離時間短會使分辨率有所降低,且要兼顧色譜之間的兼容性。本實驗室采用同時具有疏水互相作用和絡合作用的混合形式色譜柱構(gòu)建了在線/離線單柱二維液相色譜高效分離系統(tǒng)[44],解決了傳統(tǒng)二維液相色譜在線聯(lián)用設(shè)備成本高及存在溶劑不兼容的問題,華而不實,在線單柱二維液相色譜系統(tǒng)采用混合梯度溶劑進行分離,1次進樣即可完成TAGs的快速分離鑒定,有效提高TAG檢測通量5~10倍;離線單柱二維液相色譜系統(tǒng)具有更高層次的峰容量和檢測靈敏度,有效提高檢測靈敏度10~20倍,解決了甘油三酯類復雜化合物檢測通量低、靈敏度低的技術(shù)瓶頸問題。除此之外,近年來具有分離效率高、分離形式多、樣品用量少、通量高等優(yōu)點的毛細管電色譜[49]和分離速度快、選擇性高、適用于復雜樣品體系分離的超臨界流體色譜[50]也開場應用于脂質(zhì)分離。3脂質(zhì)組數(shù)據(jù)分析及脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫同代謝組研究類似,脂質(zhì)組數(shù)據(jù)處理同樣需經(jīng)過原始數(shù)據(jù)預處理、特征峰提取、脂質(zhì)定性、多元統(tǒng)計分析和生物學意義挖掘等經(jīng)過[51]。3.1脂質(zhì)組數(shù)據(jù)處理脂質(zhì)組學數(shù)據(jù)處理主要包括信號濾噪、代謝特征提取、色譜與質(zhì)譜匹配、缺失值過濾與補值、信號歸一化、化合物定性定量等步驟。ChunyanWang等[28]采用Xcalibar軟件自動化快速挑選出肥胖小鼠與正常小鼠大腦中磷脂酰肌醇的差異,但采用不同的數(shù)據(jù)處理軟件所得到的分析結(jié)果也存在差異,對于非靶向的代謝組學分析,采取兩種以上的數(shù)據(jù)處理方式,結(jié)果會愈加準確。YanhuaChen等[52]比擬了開源軟件XCMS、MZmine以及ABSciex開發(fā)的MarkerView這三種軟件對宮頸癌代謝物的LC-MS/MS數(shù)據(jù)分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)鑒定出的14種生物標志物中,只要兩種生物標志物被三種軟件同時鑒定。當下,尚未見一種方式方法能夠無偏向性地定量和定性分析生物樣品內(nèi)所有的內(nèi)源性脂質(zhì),一些豐度低、不穩(wěn)定但具有生物活性的脂質(zhì)信息常因分析方式方法靈敏度缺乏而丟失。除此之外,由于商品化的脂質(zhì)標準物質(zhì)數(shù)量有限且價格昂貴,遠遠不能知足對數(shù)目龐大的內(nèi)源性脂質(zhì)分子的研究需求。MasanoriArita等[53]在ESI-MS/MS負離子形式下對人類和小鼠中21類鞘脂進行數(shù)據(jù)采集,使用MS-Finder軟件進行碎片離子匹配注釋進而進行鞘脂鑒定。3.2脂質(zhì)組數(shù)據(jù)多元統(tǒng)計分析脂質(zhì)組數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計分析主要牽涉數(shù)據(jù)標尺化處理、形式辨別與特征變量選取[54,55]。同時因組學數(shù)據(jù)的復雜性與研究目的的多元性,需要研究人員靈敏地采用不同的統(tǒng)計方式方法進行數(shù)據(jù)分析。附表中列出了常見的用于脂質(zhì)組學的數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)處理軟件。4脂質(zhì)組學在脂質(zhì)膳食營養(yǎng)與健康研究中的應用4.1脂質(zhì)組學在膳食營養(yǎng)研究中的應用4.1.1脂質(zhì)組學在膳食多不飽和脂肪酸(PUFA)的營養(yǎng)研究中的應用研究表示清楚,低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)/高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、總膽固醇、甘油三酯水平均是監(jiān)測心血管疾病的指標。PUFA尤其是w-3PUFA具有降低血清中膽固醇和甘油三酯作用,抑制LDL-C的合成并提高HDL-C水平,而HDL-C能維持內(nèi)皮的血管反響性、抑制內(nèi)皮細胞凋亡、提高抗氧化應激能力、減少血管及動脈中的黏附因子相關(guān)基因的表示出作用[56,57,58,59]。除此之外,在阿爾茲海默癥的研究中,發(fā)現(xiàn)患者腦組織中二十二碳六烯酸(DHA)含量明顯降低,且患者肝臟合成DHA的能力也遭到影響[60]。在孕婦的飲食中補充二十碳五烯酸(EPA)和DHA能降低炎癥反響合理調(diào)控免疫能力,預防嬰兒的過敏癥[61]。SusannaL.Lundstro等[62]分析了在哮喘病患者與健康人的膳食中添加n-3PUFA后血漿中脂質(zhì)氧化物的變化,通過LC-MS/MS分析得出了87個脂質(zhì)氧化物,歸結(jié)到環(huán)氧化酶、脂肪氧化酶、細胞色素P450等的代謝通路,發(fā)現(xiàn)EPA會影響細胞色素和15-環(huán)氧化酶的改變,DHA會影響細胞色素P450的變化。w-3PUFA能改變細胞膜磷脂的組成、中斷脂筏的成效而到達抗炎的作用,并抑制核轉(zhuǎn)錄因子-如B的信號轉(zhuǎn)導,減少炎癥基因的表示出,促進抗炎因子NR1C3的表示出及G蛋白與GPR120受體的結(jié)合[63]。4.1.2脂質(zhì)組學在膳食植物固醇的營養(yǎng)研究中的應用研究發(fā)現(xiàn),植物固醇具有消炎、調(diào)節(jié)代謝、預防前列腺疾病、抗癌等成效[64,65],其降低血液中LDL-C的詳細機制尚不清楚,有研究揣測,由于植物固醇與膽固醇的競爭性抑制了膽固醇在人體中的吸收,植物固醇和膽固醇須先溶解成微粒團才能被人體吸收,植物固醇的構(gòu)造決定了它比膽固醇的疏水性強,因而植物固醇較膽固醇更易進入微粒團,進而減少對膽固醇的吸收[66,67]。JingnanChen等[68,69]在飼料中添加富含7-烯膽(甾)烷醇、麥角固醇、豆固醇等的藻類固醇,分別以含量為0.06、0.30g/kg飼喂雄性金黃地鼠,結(jié)果顯示,與對照組相比,實驗鼠血漿中膽固醇的濃度分別降低19.5%和34%。研究發(fā)現(xiàn),藻類植物固醇和-谷甾醇同樣具有降低血漿膽固醇的成效。膳食藻類固醇下調(diào)了腸道的輔酶A酯、膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶2(ACAT2)和肝臟羥甲基戊二酸單酰輔酶A復原酶(HMG-CoA),上調(diào)了肝臟中LDL受體,增加類固醇的排泄和降低膽固醇的吸收和合成。除此之外,植物固醇還能抑制宮頸癌細胞株SiHa的生長[69]、降低CRP水平[70]。4.2脂質(zhì)組學在健康狀態(tài)紊亂研究中的應用傳統(tǒng)用于診斷心血管疾病的生物標志物常為膽固醇總量、甘油三酯、HDL-C及LDL-C水平,隨著脂質(zhì)組學的發(fā)展,脂質(zhì)分子已成為重要的生物標志物,如高血脂癥患者血漿中甘油三酯、短鏈脂肪酸、游離脂肪酸、神經(jīng)酰胺、磷脂酰膽堿水平升高,而溶血性卵磷脂(LPC)(16∶0)水平下降。LPC(16∶0)的減少與其在過氧化物酶體增殖物激活受體的調(diào)節(jié)作用是一致的,游離脂肪酸與內(nèi)皮依靠性一氧化氮產(chǎn)生及核因子B信號的活性有關(guān),神經(jīng)酰胺會控制組織內(nèi)的營養(yǎng)素的吸收及合成代謝。脂質(zhì)分子變化的高靈敏性有利于早期診斷和有效預防[71]。ChristinStegemann等[72]致力于建立用質(zhì)譜技術(shù)分析動脈粥樣硬化斑塊的平臺,分析了26個患者的斑塊中150種脂質(zhì)分子,發(fā)現(xiàn)斑塊中長鏈多不飽和脂肪酸膽固醇酯和鞘磷脂的含量明顯增高。系統(tǒng)層面上認知動脈粥樣硬化有利于研究遺傳信息與表現(xiàn)型之間的聯(lián)絡,更好地運用脂質(zhì)分子信號來實現(xiàn)早期診斷、風險評估和個性化治療[73]。脂類在細胞信號轉(zhuǎn)導和組織生理學研究中具有重要作用,且腦部的脂質(zhì)決定了細胞膜中蛋白質(zhì)的分布位置和功能,因而能夠影響神經(jīng)元中的突觸通量[74]。脂質(zhì)代謝紊亂與很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān),包括精神分裂癥和神經(jīng)退行性疾病,如阿爾茲海默癥,帕金森綜合征、尼曼-匹克氏病等[75]。MWang等[76]總結(jié)了基于鳥槍法的多維質(zhì)譜平臺的神經(jīng)退化疾病和腦部損傷患者大腦組織中各類磷脂、鞘脂、TAG的分析方式方法,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷與預防奠定基礎(chǔ)。瞻望先進的脂