結核病實驗室診斷柳正衛浙江省疾病預防控制中心1結核病防治臨床診治實驗檢測隨訪督導藥品供應23結核病診治中最困擾您的是什么？我能給臨床提供哪些檢測結果呢？我需要哪些檢測來輔助我的診治呢？45臨床醫生患者實驗室提供的信息越充分，越能配合治療提供的信息越充分，診治的效果越明顯提供的信息越充分，實驗室檢測針對性更強6檢測報告大多數是基于體外檢測的結果對一份檢測報告，應結合具體情況綜合判斷臨床也應掌握檢測的原理與結果的意義，便于診治和有疑義時的解釋工作臨床也應關注實驗室的質量控制體系7結核分枝桿菌電子顯微鏡下結構89一條結核桿菌在體內的繁殖情況天數結核桿菌數天數結核桿菌數天數結核桿菌數1295121713107224101024182621443811204819524288416124096201048576532138192212097152664141638428268416×103712815327683534535×10682561665536424396800×10610萋尼氏染色涂片鏡檢固體羅氏培養普通PCR擴增檢測別離培養涂片鏡檢分子診斷肺結核診斷熒光染色涂片鏡檢液體培養熒光定量PCR擴增檢測恒溫擴增檢測金胺O染色AFB(×40物鏡)金胺O染色AFB(×20物鏡)抗酸桿菌(acid-fastbacilli，AFB)鏡檢11LED顯微鏡12感染性肺結核病人的特征5,000bacilli/1mL:涂片陽性10,000bacilli/1mL:95%可能陽性痰涂片陽性的病人是主要的傳染源痰涂片陰性的病人15~20%具有傳染性13抗酸菌數量與鏡檢陰性幾率比較CFU/ml痰標本直接涂片(－)幾率150088.5300081.31500019.63000017.31500001.63000000---Mundy14留痰次數對痰檢陽性的關系即時痰；晨痰；夜間痰；1998年Nelson等報道：采用229位患者不同時間采集的干酪樣和粘液樣痰標本，進行AFB鏡檢，雖然清晨痰的陽性率最高(47.0％)，即時痰的陽性率最低(41.7％)，但結果在臨床診斷的符合率和可靠性上均無顯著性差異。15Threesputumsmearsareoptimal16不同痰液涂片陽性率表

〔僅供例如〕

性質 例數 陽性數 陽性率

干酪樣痰 55 36 65.5%

血性痰 46 16 34.8%

粘液性痰 529 56 10.6%

水樣痰 92 7 7.6%

1718痰涂片檢查登記本

實驗序號日期姓名性別年齡痰標本來源標本鏡檢結果簽名備注初診患者(門診序號)隨訪患者(患者登記號)標本性狀結果日期實驗室流水號

********090031A陰性

**外單位送檢標本請注明來源及就診者相關信息，以便追蹤。

2B3C數字+

09002********083201D**2319分枝桿菌別離培養結核桿菌培養檢查是目前結核病診斷的“黃金標準〞，如病人標本中檢出結核菌，可100%確診為結核病，并且具有傳染性。理論上可檢出一條菌，實際工作中只有約1/3肺結核病人為陽性；且用時較長，需4~8周左右；無法鑒定結核與非結核分枝桿菌。靈敏度略高于涂片，可以鑒定死菌與活菌，可進一步做菌種鑒定和藥敏試驗，為結核病流行病學及臨床治療提供用藥依據。20液體培養基營養好，細菌生長快，利于快速診斷。米氏7H9液體培養基液體變色培養基底層有顆粒狀沉淀，上清無色透明顯色劑：四唑鎓鹽→復原成粉紅色甲臢21

結核桿菌快速培養儀檢測BACTECMGIT960全自動快速分枝桿菌培養鑒定藥敏儀BacT/ALERT3D全自動培養儀熒光物質包埋在7H9液體培養管的底部，分枝桿菌生長過程中，O2被消耗，底物產生熒光，儀器通過測定熒光強度，用生長指數來表示測定結果，培養時間通常需要7~42天。分枝桿菌生長過程中代謝產生CO2，CO2的產生使瓶底顏色感受器產生不同的顏色變化。通過比色傳感器來測定，CO2產生的速率和總量與細菌生長的速率和總量一致。22BACTECMGIT分枝桿菌熒光判讀器23分子生物學診斷利用分子生物技術作為結核菌快速檢測、分型、抗藥性菌株檢測及測定突變，是不可阻擋之趨勢，但現階段仍無法取代傳統之涂片抗酸性染色及培養，特別是藥物敏感性試驗。24PCR檢測診斷條件臨床上若痰涂片為陽性，其敏感度為80%至95%，特異度90%至98%，相反地若涂片陰性但培養陽性時，其敏感度為48%至53%，但特異度仍維持在95%，現有之資料顯示臨床醫師在決定是否要以PCR作診斷時，必須按病人之臨床表現而定，但仍無法取代傳統之培養。25核酸擴增檢測〔NAA〕檢測規定一般收集三個不同的采集日期的標本，并分別做涂片染色鏡檢及結核菌培養。取第一個涂片鏡檢呈陽性的檢體進行NAA；如果有需要，那么再收集另一套檢體做確認。如果第一套檢體涂片鏡檢及NAA檢查皆呈陽性，那么可推斷為結核感染。若涂片染色呈現陽性，但是NAA檢查呈陰性，那么必須檢查是否因PCR反響中含有核酸復製的抑制物所引起。若無抑制物的影響，且重復另一套檢體的結果亦呈陰性，那么可推測病人可能感染非結核分枝桿菌〔NTM〕若涂片染色呈陰性，但NAA檢查呈陽性的情形，那么必須再做另一套檢體，如果得到相同結果，那么可推論此病人極可能感染結核病。如果兩者皆為陰性，那么表示這個病人并沒有結核病感染。然而，單靠NAA結果并不能將病人為活動性結核的可能性完全排除，最后診斷仍需要仔細評估臨床癥狀的嚴重度與感染結核病的可能性，以及是否接受藥物治療等因素考慮進去。尤其是當分子檢驗結果與臨床癥狀不一致時，病人的臨床病情是否高度疑心結核感染是判讀NAA結果與決定后續處置的重要依據。26LAMP試驗檢測結果圖：綠色為陽性橙色為陰性

27改進羅氏比例法線性探針檢測基于液體的藥敏檢測傳統藥敏檢測耐藥基因突變檢測耐藥性檢測液體培養基因芯片檢測藥物MIC檢測28改進羅氏比例法2930計算耐藥百分比：含藥培養基上生長的菌落數耐藥百分比=--------------------------×100%對照培養基上生長的菌落數假設耐藥百分比大于或等于1%，那么認為受試菌對該抗結核藥耐藥。

BBLMGIT液體藥敏試驗31INH:耐藥Day7RIFDay5GCDay7INHRIF:敏感結果判讀3233時間比較樣本選擇方式對照管報陽時間最終確認時間直接培養（10）3-5天5-7天次培養（15）7-13天9-13天液體培養比例法28天液體培養時間跨度GenoType?MTBDRplus

檢測程序1)從用NALC/NaOH處理的痰取DNA2)PCR擴增3)雜交對擴增的特異DNA核酸進行反向雜交，探測鏈上的堿基對4)評價4)評價34GenoType?

MTBDRplus

利福平耐藥：rpoB基因rpoB野生型-探針:WT1到WT8rpoB突變探針:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L→通過缺失的野生型信號進行突變探測→通過出現的突變信號進行突變探測35分枝桿菌復合群中的耐藥基因檢測原理3637雜交試劑38

結果判讀與解釋39

結果判讀與解釋40快速耐藥檢測DNA微陣列芯片法414243快速耐藥檢測DNA微陣列芯片法第3次耐藥監測MDR菌株的局部檢測結果rpoB基因突變〔516G-T〕inhA基因突變〔-15C-T〕KatG基因突變〔315G-C〕44快速耐藥檢測-DNA微陣列芯片法目前國家參比室已發布了相關的標準操作流程45結核分枝桿菌鑒定程序46分枝桿菌菌種鑒定的意義非結核分枝桿菌的發病率在不同的國家、不同的地區報告差異很大。據資料報道，日本在1980年報告：在分枝桿菌感染中，非結核分枝桿菌的發病率為12%，并有逐年上升趨勢，其中主要為鳥胞內復合群，高達89.6%，其次為堪薩斯占8.0%我國2007年耐藥基線調查結果顯示，我國的非結核分枝桿菌大約為3.04%。我省第3次耐藥監測結果顯示，我省的非結核分枝桿菌大約為3.47%4748分枝桿菌菌種鑒定的意義一般來說，非結核分枝桿菌對抗結核藥物的敏感性低于結核菌，但各型和各菌株之間對藥物的敏感性差異甚大。分枝桿菌的主要類型分枝桿菌結核分枝桿菌復合群非結核分枝桿菌(MTC)(NTM)麻風分枝桿菌〔M.leprae〕49分枝桿菌菌種鑒定分枝桿菌菌群鑒定的目的既是鑒定菌株屬于結核分枝桿菌復合群還是非結核分枝桿菌，也是進一步菌種鑒定的根底。分枝桿菌臨床別離株藥物敏感性試驗應與菌種初步鑒定同步進行，以對硝基苯甲酸〔PNB〕、噻吩-2-羧酸肼〔TCH〕鑒別培養基初步鑒別結核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非結核分枝桿菌鑒別培養基的制備過程略。50分枝桿菌菌種初步鑒定分枝桿菌PNBTCH28℃生長耐熱觸酶硝酸還原煙酸試驗牛分枝桿菌——————結核分枝桿菌—+————NTM++++++51結核分枝桿菌復合群〔MTC〕鑒定方法該方法可以鑒別結核分枝桿菌復合群，包括結核分枝桿菌、非洲分枝桿菌I型和Ⅱ型、牛分枝桿菌、卡介苗、田鼠分枝桿菌、caprae分枝桿菌以及canettii分枝桿菌。52非結核分枝桿菌〔nontuberculosismycobacteria，NTM〕是結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌的總稱。53NTM迄今為止已發現有150余種,目前已證實50多種具有潛在致病性。分類習慣上仍采用Runyon分類法——根據菌落色素﹑生長速度分為四組54NTM非結核分枝桿菌〔nontuberculous

mycobacteria,NTM〕是指分枝桿菌屬中除結核分枝桿菌及麻風分枝桿菌以外的一組分枝桿菌可導致慢性肺部疾病、淋巴結炎、皮膚和軟組織感染及全身播散型NTM病等。NTM屬于時機性致病菌，它的致病性和毒力均較結核桿菌低。NTM對現有抗結核藥物大多耐藥，所以NTM病治療困難，預后不佳。55結核與非結核分枝桿菌的主要區別

區別點結核分枝桿菌非結核分枝桿菌菌落外形粗糙、顆粒、結節滑或粗糙菌落色澤乳酪色黃或橘紅色抵抗力對酸堿有一定抗力對酸堿較敏感生長溫度較嚴格，370C最正確范圍較寬25~400C生長速度慢4~8周快〔1周內)慢2~4周感染途徑呼吸、消化道接觸感染致病性致病菌多為條件致病菌所致疾病人和動物結核病各部位NTM病治療對抗癆藥敏感常耐抗癆藥物

56大量研究以及臨床治療病例說明多數傳統抗TB藥對NTM病很少或沒有活性，所以NTM病治療困難，預后欠佳。57NTM醫院感染的爆發流行醫院內感染系指在醫院內獲得的感染，其發病可以在住院期間，也可以在出院后，可以是散在發生，也可以是爆發流行。58非結核分支桿菌醫院感染的爆發流行NTM作為醫源性感染或醫院感染病原體的報道那么始于1973年自70年代中期至1996年國外文獻至少有25起NTM醫院感染爆發事件，病例數600以上，每起3～298例不等，均屬快速生長NTM，尤以龜分支桿菌及膿腫分支桿菌更常見。1996年中國臺灣報道3年期間22例快速生長分支桿菌〔龜分支桿菌19例、偶然分支桿菌3例〕角膜炎，深圳膿腫分支桿菌引起的醫院感染爆發事件，59NTM醫院感染爆發流行事件

深圳市于1998年4~6月發生一起膿種分枝桿菌引起的院內術后感染爆發流行事件。該院在4~6月期間共做手術292例，其中168人發生手術切口感染，感染率為57.5%，為國內