異位F1F0ATP合酶及其與腫瘤血管生成的關(guān)系【摘要】異位F1F0ATP合酶作為一個(gè)細(xì)胞外表受體，它可表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞外表黏合血管抑素(angistatin，又稱(chēng)血管生成抑制素)，調(diào)節(jié)細(xì)胞外表ATP程度，進(jìn)而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化。血管抑素在低pH值時(shí)可以黏合并阻滯細(xì)胞外表的F1F0ATP合酶，繼而干擾其活動(dòng)；籍此發(fā)揮強(qiáng)大的內(nèi)皮細(xì)胞殺傷效應(yīng)，在抑制腫瘤血管生成中起著重要作用。【關(guān)鍵詞】?jī)?nèi)皮細(xì)胞腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)血管生成。關(guān)于血管生成抑制藥物的挑選仍是當(dāng)前熱點(diǎn)。新研究的異位F1F0ATP合酶作為一種內(nèi)皮細(xì)胞外表血管源性受體已被識(shí)別。這種異位ATP合酶能催化ATP合成，在特定條件下可被血管抑素〔angistatin〕抑制。當(dāng)血管抑素發(fā)揮抑制作用時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)難以維持正常胞內(nèi)pH值而死亡。1異位F1F0ATP合酶概況在線粒體內(nèi)，通過(guò)在無(wú)機(jī)磷酸鹽(Pi)和ADP之間制造一個(gè)高能化學(xué)聯(lián)結(jié)帶，ATP合酶可以將呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子梯度能量轉(zhuǎn)換為ATP。這個(gè)合酶復(fù)合物過(guò)去被認(rèn)為是嚴(yán)格表達(dá)在線粒體內(nèi)部，但近來(lái)很多報(bào)道認(rèn)為：ATP合酶的構(gòu)成部分也存在于細(xì)胞膜外表，它們可以作為多種配體的受體參與各種過(guò)程，如脂代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖控制、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞分化以及腫瘤的免疫識(shí)別[1~3]。該復(fù)合物第一個(gè)區(qū)域是膜內(nèi)F0區(qū)域〔包含10~14環(huán)〕。這個(gè)F0區(qū)域是一個(gè)旋轉(zhuǎn)發(fā)動(dòng)機(jī)，它可以使10~14環(huán)旋轉(zhuǎn)；線粒體呼吸鏈所產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)能，驅(qū)動(dòng)著這個(gè)旋轉(zhuǎn)發(fā)動(dòng)機(jī)[4]。ATP合成酶的第二個(gè)區(qū)域F1是起催化作用的，它由αβ二聚物合成的一種三聚物組成[5]。這兩個(gè)區(qū)域分別被中心和外周的桿狀單位所連接[6,7]。中心的桿狀單位由γ、δ、ε亞單元構(gòu)成，δ、ε兩個(gè)亞單元將γ的一個(gè)末端耦合至環(huán)上，這樣環(huán)可以和γ亞單元一起旋轉(zhuǎn)[8,9]。喪失了F0區(qū)域的復(fù)合物，或者沒(méi)有合酶活動(dòng)的復(fù)合物通常被稱(chēng)為F1ATP酶〔F1〕[10]。反之，一個(gè)完好的復(fù)合物被稱(chēng)為F1F0ATP合酶。通過(guò)免疫熒光和電子顯微鏡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)在細(xì)胞外表的線粒體蛋白[11]。有報(bào)道認(rèn)為βF1亞單位作為一個(gè)細(xì)胞外表蛋白，它可以被非浸透性膜反響物生物素化，參與細(xì)胞毒素淋巴細(xì)胞的交互作用與某些催化作用[12]。而且，免疫熒光能測(cè)到F1的構(gòu)成元件[13,14]。Ki等通過(guò)顯微鏡法、生化方法和細(xì)胞分級(jí)別離法，為F1在細(xì)胞外表的表達(dá)提供了有力的證據(jù)，并被擴(kuò)展至成熟肝細(xì)胞、角化細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等。α、β亞單位也在許多腫瘤細(xì)胞株中被發(fā)現(xiàn)。就目前所知，雖然報(bào)道成熟細(xì)胞表達(dá)F1，但這種表達(dá)在組織切片中還沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)?？赡艿脑蚴牵航M織經(jīng)固定后，抗原性F1F0的抗原決定簇變得不夠穩(wěn)定。2血管生成與血管生成抑制腫瘤生長(zhǎng)所需的新血管源于現(xiàn)有正常血管，過(guò)去我們稱(chēng)之為血管生成〔Flkan,1971)。血管生成涉及到血管生成因子與血管生成抑制因子之間的調(diào)節(jié)失衡。受腫瘤所釋放的可溶性血管生成因子影響，這些源于部分毛細(xì)血管、小動(dòng)脈、小靜脈的新生血管，會(huì)促使腫瘤超常規(guī)迅速成長(zhǎng)。血管抑素作為一個(gè)天然血管生成抑制劑，已被證實(shí)可以抑制血管生成，并有效阻止腫瘤生長(zhǎng)。Flkan提出了“血管生成開(kāi)關(guān)〞的概念，即存在一個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)平衡血管生成和血管穩(wěn)定〔angistati〕；這個(gè)網(wǎng)絡(luò)是基于一定數(shù)量的血管生成信號(hào)與血管穩(wěn)定信號(hào)來(lái)運(yùn)行的。Flkan和’REilly等描繪了以下現(xiàn)象，在某些腫瘤外科手術(shù)治療中，經(jīng)?？梢砸?jiàn)到原發(fā)腫瘤去除后，轉(zhuǎn)移灶腫瘤仍迅速生長(zhǎng)。這一現(xiàn)象已被許多實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)[15]。在這些模型中，原發(fā)腫瘤切除后，那些快速生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移瘤并不是起源于腫瘤細(xì)胞的播種，而是起源于早已存在的微小轉(zhuǎn)移灶。“血管生發(fā)開(kāi)關(guān)〞在原發(fā)腫瘤處會(huì)傾向血管生成；而繼發(fā)轉(zhuǎn)移處“血管生發(fā)開(kāi)關(guān)〞會(huì)傾向血管穩(wěn)定。腫瘤原發(fā)灶范圍內(nèi)，穩(wěn)定因子也會(huì)產(chǎn)生，只是沒(méi)有足夠的數(shù)量來(lái)對(duì)抗血管生成。另外，血管穩(wěn)定因子在循環(huán)中可能有更長(zhǎng)的半衰期，所以在遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤部位的區(qū)域，“血管生發(fā)開(kāi)關(guān)〞的效應(yīng)往往相反。原發(fā)部位的腫瘤切除后，這些血管穩(wěn)定因子數(shù)量變得相對(duì)缺乏，從而使轉(zhuǎn)移性腫瘤產(chǎn)生的前血管生成因子主導(dǎo)了“血管生發(fā)開(kāi)關(guān)〞，促進(jìn)了遠(yuǎn)處腫瘤新生血管的生成。3細(xì)胞外表異位F1F0ATP合酶在內(nèi)皮細(xì)胞外表，異位F1F0ATP合酶作為一種受體已被確認(rèn)存在。ser等對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞外表血管抑素粘合位點(diǎn)的鑒定做了大量工作。和其他的纖溶酶原裂解物一樣，如纖維蛋白溶酶，血管抑素也由此衍生而成。研究者分別準(zhǔn)備了放射性碘標(biāo)記的血管抑素與纖溶酶原，然后通過(guò)細(xì)胞黏合測(cè)定的方式，證明了血管抑素確實(shí)黏附于人類(lèi)臍靜脈上皮母細(xì)胞(HUVE)外表的特殊位點(diǎn)，而且與纖溶酶原有著不同的粘連動(dòng)力學(xué)。另外纖溶酶原和血管抑素并不互相競(jìng)爭(zhēng)黏附于HUVE，進(jìn)一步驗(yàn)證了兩者存在不同的粘合位點(diǎn)。為了鑒定黏合位點(diǎn)，研究者們準(zhǔn)備了一個(gè)與瓊脂糖凝膠匹配的血管抑素親和層析柱，另一個(gè)溶酶原親和層析柱作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。培育好的HUVE細(xì)胞外表用生物素來(lái)標(biāo)記，以此來(lái)確認(rèn)黏合蛋白對(duì)應(yīng)的細(xì)胞外表特定區(qū)域。從HUVE細(xì)胞抽提的質(zhì)膜通過(guò)每一個(gè)層析柱，然后徹底沖洗掉那些未被黏合的物質(zhì)。從每個(gè)層析柱上洗提黏合蛋白做SDS和estenblt定性分析，再根據(jù)所選擇條帶進(jìn)展廣泛的蛋白組學(xué)定性研究。HUVE質(zhì)膜通過(guò)后的纖溶酶原親和層析柱，在SDS凝膠上產(chǎn)生了一條~44kD的蛋白條帶。這種蛋白被免疫測(cè)定證明是annexinⅡ。與之對(duì)應(yīng)的血管抑素層析柱并沒(méi)有產(chǎn)生對(duì)annexinⅡ抗體有反響的蛋白。相反，發(fā)現(xiàn)了一系列從20kD~65kD不等的蛋白條帶，大多集中在~55kD左右。蛋白條帶從凝膠中提取后進(jìn)展大樣本的肽鏈圖譜分析，從中發(fā)現(xiàn)這個(gè)條帶包含了F1F0ATP合酶的α和β亞單位。F1F0ATP合酶也是線粒體內(nèi)膜的組成成分。Das最先在腫瘤細(xì)胞株A549的細(xì)胞外表探測(cè)到了F1F0ATP合成酶的β亞單位；但是這種觀察隨后也遭到了質(zhì)疑，有人認(rèn)為：可能是遺傳不穩(wěn)定細(xì)胞株中異常的運(yùn)輸導(dǎo)致了這個(gè)結(jié)果。Sltys等進(jìn)一步描繪了在特定細(xì)胞膜外表所發(fā)現(xiàn)的線粒體基質(zhì)蛋白的多樣性。盡管人們提出了許多機(jī)制來(lái)解釋線粒體基質(zhì)蛋白移位到線粒體之外的區(qū)域，但是詳細(xì)細(xì)節(jié)仍不清楚。為進(jìn)一步研究細(xì)胞外表的F1F0ATP合酶，ser等試驗(yàn)了兩種假說(shuō)：首先，他們提出了對(duì)抗F1F0ATP合酶的非抑制性抗體是否可以阻止血管抑素的粘合與活動(dòng)；其次，又提出了對(duì)抗F1F0ATP合成酶的抑制性抗體是否可以模擬血管抑素的功能效應(yīng)。4血管生成調(diào)控與異位F1F0ATP作用機(jī)制通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，Yegutkin等[16]證實(shí)在HUVE和淋巴細(xì)胞外表存在ATP合成與水解的互相抵消作用，而這種合成也包括了腺苷酸激酶〔AK〕與核苷酸氯喹激酶〔NDPK〕。淋巴細(xì)胞通過(guò)這些活動(dòng)在其外表維持了一個(gè)穩(wěn)態(tài)的ATP程度，而在內(nèi)皮細(xì)胞中核苷酸酶的活動(dòng)處于主導(dǎo)地位[17]。但這些并沒(méi)有提供ATP合酶活動(dòng)的直接證據(jù)[16]。兩種天然的抗血管生成肽已被證實(shí)可以和內(nèi)皮細(xì)胞外表的F1互相作用，一種是上述的血管抑素，另一種是內(nèi)皮性單核細(xì)胞激發(fā)多肽Ⅱ(EAPⅡ)。EAPⅡ是由一些腫瘤細(xì)胞釋放的炎性肽，可以激發(fā)趨化單核巨噬細(xì)胞和中性細(xì)胞。hang等已鑒定出F1的α亞單位是內(nèi)皮細(xì)胞上EAPⅡ的一個(gè)配體，在THP-1和E細(xì)胞株上情形也類(lèi)似。目前認(rèn)為，血管抑素在低pH值時(shí)會(huì)發(fā)揮強(qiáng)大的血管內(nèi)皮細(xì)胞殺傷效應(yīng)。當(dāng)血管抑素在pH值6.5~7.5時(shí)，可以黏合并阻滯細(xì)胞外表的F1F0ATP合酶。即使胞外pH值下降到與腫瘤類(lèi)似的pH范圍〔6.5~6.7〕，血管內(nèi)皮細(xì)胞仍可維持一個(gè)相對(duì)正常的胞內(nèi)pH值。在胞外pH壓力下，當(dāng)血管抑素通過(guò)F1F0ATP合酶作用于內(nèi)皮細(xì)胞，會(huì)引起胞內(nèi)pH值的迅速下降，繼之血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡。血管抑素結(jié)合到細(xì)胞外表調(diào)節(jié)ATP程度，限制細(xì)胞的遷移和增殖，進(jìn)而限制血管的分化生成。或許pH張力是血管抑素造成血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡的最根本調(diào)節(jié)器，血管抑素似乎也可通過(guò)F1F0ATP合酶來(lái)調(diào)節(jié)質(zhì)子流的阻抑。有人認(rèn)為在K1-5誘導(dǎo)的血管生成抑制的凋亡通路中，異位F1F0ATP合酶發(fā)揮著最為核心的作用[18]。除了血管抑素，同樣可以下調(diào)ATP合成的還有特殊的F1F0抑制劑，比方：抗α亞單位抗體、抗β亞單位抗體、寡霉素、efrapeptins或者白藜蘆醇等[2,19]。此外，和單克隆抗α/βF1抗體類(lèi)似的方式[1]，血管抑素下調(diào)HUVE增殖。但是一個(gè)多克隆的抗α亞單位抗體產(chǎn)生的效應(yīng)卻與之相反，說(shuō)明異位F1F0ATP合酶參與調(diào)節(jié)了這個(gè)過(guò)程。新的研究熱點(diǎn)IF1肽也在HUVE細(xì)胞外表被檢測(cè)到，但它的數(shù)量非常之少[2,20]。IF1在線粒體中可以抑制ATP水解。Burik等利用孤立線粒體和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)展研究，證實(shí)IF1盡管抑制了ATP水解，并使細(xì)胞外表ATP聚集，但它并沒(méi)有抑制ATP的合成；并且IF1效應(yīng)也受pH值影響[2]?；蛟S，IF1是抗血管生成的一個(gè)潛在調(diào)控者。5結(jié)語(yǔ)異位F1F0ATP合酶作為一個(gè)細(xì)胞外表受體已被證實(shí)存在。異位F1F0ATP合酶可表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上黏合血管抑素，進(jìn)而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化。盡管內(nèi)皮細(xì)胞外表存在F1F0/F1合酶，但它真正的參與機(jī)制并沒(méi)完全清楚。研究者正進(jìn)一步討論血管生成抑制與異位F1F0ATP合酶作用的詳細(xì)細(xì)節(jié)，以及相關(guān)的細(xì)胞外表ATP代謝和pH動(dòng)態(tài)平衡情況[21]。最近有學(xué)者指出F1F0ATP合酶是熱休克蛋白90〔HSP90〕的協(xié)同作用蛋白，而抑制HSP90蛋白的功能被認(rèn)為是治療實(shí)體瘤和白血病的新穎途經(jīng)[22]。另有學(xué)者提出：借助于異位F1F0ATP合酶的作用，血管抑素在低胞外pH的條件下可以直接對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[23]。這些觀點(diǎn)為異位F1F0ATP合酶在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的機(jī)制增添了新的含義，也為下一步靶向治療的研究指明了方向。【參考文獻(xiàn)】[1]StetE,artinezL,GrantE,etal.TurregnitinfllingVgaa9Vdelta2TellreeptrinteratinsithasurfaeF1-ATPaserelatedstrutureandaplipprtEinA-I[J].Iunity，2022，22(1):71-80.[2]BurikNR,ahlL,FangJ,etal.AnInhibitrftheF1subunitfATPsynthase(IF1)dulatestheativityfangistatinntheendthelialellsurfae[J].JBilhe，2022，280(3):1740-1745.[3]atabe,NakakiT.ATPdepletindesntauntfrapptsisinduedbyinhibitinfithndrialeletrntransprthaininhuandpainergiells[J].Neurpharalgy，2022，7(1):37-43.[4]SenirAE,NadanaivaS,eberJ.TheleularehanisfATPsynthesisbyF1F-ATPsynthase[J].BihiBiphysAta，2002，1553(3):188-211.[5]DudkinaNV,SunderhausS,BraunHP,etal.haraterizatinfdieriATPsynthaseandristaeebraneultrastruturefrSaharyesandPlytellaithndria[J].FEBSLetters，2022，580(14):3427-3432.[6]PengG,Bstinaa,Raderaher,etal.BiheialandeletrnirspiharaterizatinftheF1F0ATPsynthasefrthehypertherphilieubateriuAquifexaelius[J].FEBSLetters,2022,580(25):5934-5940.[7]alkerJE,DiksnVK.TheperipheralstalkftheithndrialATPsynthase[J].BihiiaetBiphysiaAta,2022,1757(5-6):286-296.[8]IizukaS,KatS,Yshida,etal.γεsub-plexftherphiliATPsynthasehastheabilitytbindATP[J].BiheBiphysRes,2022,349(4):1368-1371.[9]FeniukBA,SuzukiT,Yshida.TherlefsubunitepsilnintheatalysisandregulatinfFF1-ATPsynthase[J].BihiiaetBiphysiaAta,2022,1757:326-338.[10]GaYQ,Yang,Karplus.Astruture-baseddelfrthesynthesisandhydrlysisfATPbyF1-ATPase[J].ell,2022,123(2):195-205.[11]ahlL,KenanDJ,Gnzalez-Grn,etal.Angistatin’sleularehanis:aspetsfspeifiityandregulatineluidated[J].JellBihe,2022,96(2):242-261.[12]asaikeT,SuzukiT,TsundaSP,etal.PrbingnfratinsfthebetasubunitfF0F1-ATPsynthaseinatalysis[J].BiheBiphysResun,2022,342〔3〕:800-807.[13]KiB,hHJ,LeeJ,etal.ExtraellularATPisgeneratedbyATPsynthaseplexinadipytelipidrafts[J].Expled,2022,36(5):476-485.[14]BurrellHE,ldarskiB,FsterBJ,etal.HuankeratinytesreleaseATPandutilizethreeehanissfrnuletideinternversinattheellsurfae[J].JBilhe,2022,280(33):29667-29676.[15]FunatsuH,YaashitaH,NaH,etal.utefvitreussurgeryandthebalanebeteenvasularendthelialgrthfatrandendstatin[J].InvestphthallVisSi,2022,44(3):1042-1047.[16]YegutkinGG,HenttinenT,SaburskiSS,etal.Theevidenefrtppsite,ATP-generatingandATP-nsuing,extraellularpathaysnendthelialandlyphidells[J].BiheJ,2002,367(1):121-128.[17]sanaiT,agtaK,Tanaka,etal.Intraellularsignalingfrvasnstritruplingfatr6:nvelfuntinfbeta-subunitfATPsynthaseasreeptr[J].Hypertensin,2022,46(5):1140-1146.[18]NiinaVK,aR,uL.EndthelialellsurfaeATPsynthase-triggeredaspase-appttipathayisessentialfrK1-5-Induedantiangigenesis[J].anerRes,2022,64(10):3679-3686.[19]ArakakiN,NagaT,NikiR,