食品微生物檢驗基礎食品微生物檢驗基礎Contents第一節細菌學檢驗基礎1第二節免疫學檢驗基礎2第三節分子生物學基礎3Contents第一節細菌學檢驗基礎1第二節免疫學檢驗第一節細菌學檢驗基礎一、無菌技術二、微生物的接種與分離技術三、細菌的培養方法四、細菌的生長現象五、細菌的生化反應檢查法第一節細菌學檢驗基礎一、無菌技術一、無菌技術一、無菌技術（一）什么是無菌技術指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施。（一）什么是無菌技術指在微生物實驗工作中，控制或防止各類（二）無菌環境無菌室無菌柜超凈工作臺（二）無菌環境無菌室1、無菌室（1）無菌室的結構：更衣間、緩沖間、操作間（2）無菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外線照射（1~2小時）.每周用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）.每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒。1、無菌室（1）無菌室的結構：更衣間、緩沖間、操作間2、超凈工作臺

超凈臺的使用與保養:（1）風速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上;（3）讓超凈臺預工作10~15分鐘;（4）使用完畢后，用70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈.2、超凈工作臺

超凈臺的使用與保養:

（三）無菌器材滅菌器材：玻璃器皿、培養基、無菌衣等.消毒器材：無菌室內的凳子、試管架、天平、工作臺、手等（三）無菌器材滅菌器材：玻璃器皿、培養基、無菌衣等.（四）無菌操作1、目的：（1）是保證待檢物品不被環境中微生物的污染；（2）是防止被檢微生物在操作中污染環境或感染操作人員。（四）無菌操作1、目的：2、進入無菌室前的準備（1）定期檢查無菌環境的空氣是否符合規定；（2）用紫外線滅菌處理30~60分鐘；（3）檢查無菌器材是否完備；（4）洗手消毒；（5）手部消毒后，再穿戴無菌工作服。2、進入無菌室前的準備（1）定期檢查無菌環境的空氣是否符合規3、檢驗操作過程的無菌操作要求（1）在操作中不應有大幅度或快速的動作；（2）使用玻璃器皿應輕取輕放。（3）在正火焰上方操作；（4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5）在接種培養物時，協作應輕、準。（6）不能用嘴直接吸吹吸管。（7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內消毒。3、檢驗操作過程的無菌操作要求（1）在操作中不應有大幅度或快無菌操作–

取菌技巧11.接種環前端鉑絲部分以酒精燈燒紅滅菌，后端鐵棒部分過火無菌操作–取菌技巧11.接種環前端鉑絲部分以酒精燈燒紅2.試管前端過火3.打開試管蓋（塞）無菌操作–

取菌技巧12.試管前端過火3.打開試管蓋（塞）無菌操作–取菌技巧4.試管傾斜，放入接種環無菌操作–

取菌技巧14.試管傾斜，放入接種環無菌操作–取菌技巧15.試管前端過火，蓋上試管蓋6.接種環燒紅滅菌無菌操作–

取菌技巧15.試管前端過火，蓋上試管蓋6.接種環燒紅滅菌無菌操作–2.自Plate上取單一菌落(方法一：蓋子微開遮住培養基，避免空氣中菌體掉入)(方法二：plate反面拿起)無菌操作–

取菌技巧22.自Plate上取單一菌落(方法一：蓋子微開遮住培1.擠出吸球內空氣，插上滅過菌的玻璃吸管2.向上為吸，向下為放無菌操作–

取菌技巧31.擠出吸球內空氣，插上滅過菌的玻璃吸管2.向上為吸，向下調整微量加樣器

刻度

(吸取范圍200~1000μl)2.插上滅過菌的Tip(用力插緊)無菌操作–

取菌技巧4調整微量加樣器刻度2.插上滅過菌的Tip(用力插緊)3.按鈕壓至第一段（不可壓至最底）4.深入液面下2~4mm無菌操作–

取菌技巧43.按鈕壓至第一段（不可壓至最底）4.深入液面下2~5.慢慢釋放按鈕，即可吸取液體無菌操作–

取菌技巧45.慢慢釋放按鈕，即可吸取液體無菌操作–取菌技巧41.試管前端過火2.打開試管蓋無菌操作–

接菌技巧1.試管前端過火2.打開試管蓋無菌操作–接菌技巧方法一：以接種環沾菌，放入新的培養基中接菌方法三：以Pipetman

吸取菌液，按鈕壓至最底排出菌液方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培養基中，向下排出菌液無菌操作–

接菌技巧方法一：以接種環沾菌，放入新的培養基中接菌方法三：以Pipe無菌操作斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌

(2)開啟棉塞

(3)管口滅菌

(4)挑起菌苔

(5)接種

(6)塞好棉塞無菌操作斜面接種時的無菌操作操作時離酒精燈外焰區太遠試管直放，空氣中菌體容易掉入無菌操作–錯誤示范操作時離酒精燈外焰區太遠試管直放，空氣中菌體容易掉入無菌操作無菌操作

–

錯誤示范吸球倒放，菌液容易流入吸球內安全吸球隨意放置桌面，菌液容易流出至桌上無菌操作–錯誤示范吸球倒放，菌液容易流入吸球內安全吸球隨無菌操作

–

錯誤示范微量加樣器

倒放，菌液容易流入微量加樣器

內無菌操作–錯誤示范微量加樣器倒放，菌液容易流入微量加樣注意事項

–

生物性廢棄物生物性廢棄物放至正確位置以便滅菌注意事項–生物性廢棄物生物性廢棄物放至正確位置以便滅菌二、微生物的接種與分離技術二、微生物的接種與分離技術（一）接種將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養基上或活的生物體內的過程叫做接種。（一）接種將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養基上或活的生物１、接種工具和方法接種和分離工具1．接種針2.接種環3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀１、接種工具和方法接種和分離工具2.常用的接種方法有以下幾種：１）劃線接種２）三點接種３）穿刺接種４）澆混接種2.常用的接種方法有以下幾種：１）劃線接種５）涂布接種６）液體接種

７）注射接種

８）活體接種５）涂布接種(二)分離純化(二)分離純化１.傾注平板法１.傾注平板法２.涂布平板法傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解1.菌懸液

2.熔化的培養基

3.培養物

4.無菌水２.涂布平板法傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件３.平板劃線法平板劃線分離法1.斜線法

2.曲線法

3.方格法

4.放射法

5.四格法３.平板劃線法平板劃線分離法

平板劃線法：

1、倒平板，標記培養基名稱，編號和實驗日期。

2、劃線方法

平板劃線法：三、細菌培養方法由于細菌的種類不同，對培養條件的要求也就不同，細菌對培養條件的要求包括溫度和氣體。由于大多數細菌所需的溫度均是35～37℃，所以細菌的培養方法僅以細菌對氣體需求不同進行分類。據此可將細菌培養分為三種，即需氧培養法、CO2培養法、厭氧培養法。三、細菌培養方法(一)需氧培養法此法為一般培養法，適合于需氧菌及兼性厭氧菌的培養。將已接種好的平板(一般需倒置)、斜面或液體培養基置35℃孵箱中培養18～24h，一般的細菌均能在培養基內生長。但對于難于生長或生長緩慢的細菌(如結核桿菌)則需培養3～7d甚至一個月才能生長。(一)需氧培養法(二)CO2培養法某些細菌(如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、布魯桿菌、溶血鏈球菌等)分離時，需在5％～10％CO2環境中才能生長良好。根據造成CO2環境的方法不同，CO2培養法又可分為以下幾種：1．CO2培養箱法CO2的供應是靠與孵箱連接的CO2鋼瓶，瓶中定期充有99.99％的CO2鋼瓶上的真空表可指示CO2的輸出量并指示補充氣體的時間。由于CO2孵箱較昂貴，此法僅供大型實驗室應用。(二)CO2培養法二氧化碳培養箱二氧化碳培養箱2．燭缸法此法是將已接種的培養基，置于一定體積的磨口干燥缸內，在缸蓋口均勻涂上少許凡士林，在缸內同時放入點燃的蠟燭，然后蓋嚴缸蓋，蠟燭經幾分鐘后因缸中氧氣減少而自行熄滅，此時缸中的CO2含量約為5％～10％，再將干燥缸放入35℃孵箱中培養即可。2．燭缸法二氧化碳培養法

二氧化碳培養法

3．化學法常用的方法為碳酸氫鈉-鹽酸法，利用每升容積0.35ml鹽酸與0.4g碳酸氫鈉接觸生成CO2的化學原理產生CO2

，以供細菌生長。3．化學法(三)厭氧培養法厭氧菌由于對氧敏感，在其分離、鑒定以及研究等的過程中，必須為之營造一個低氧化還原電勢的厭氧環境，否則厭氧菌就不能生長甚至死亡，因此厭氧環境對于厭氧菌的生長繁殖至關重要。如在液體培養基的表面加蓋凡士林或蠟，或在液體培養基中加入碎肉塊制成皰肉培養基等。此外，也可以利用物理或化學方法除去培養環境中的氧，以保證厭氧環境。(三)厭氧培養法食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件厭氧培養箱由恒溫培養室、真空取樣室、厭氧操作室、氣路、電路控制系統等部分組成，填充氣體一般為氮氣。厭氧培養箱由恒溫培養室、真空取樣室、厭氧操作室、氣路、電路控四、細菌的生長現象(一)細菌在固體培養基上的生長現象1．細菌在營養瓊脂平板上的生長現象細菌經一定時間培養后，在固體培養基表面所形成的，肉眼可見的物體（群落），稱為菌落。一個單一的菌落原則上是由一株細菌生長繁殖而成，其特征代表了該菌種細菌的特性。觀察的方法是將平皿培養物放在自然光或白熾燈光的前面，從不同角度進行觀察。四、細菌的生長現象菌落形狀：圓形、不整形、扁平、凸起、凹面菌落大小：以mm計算。表面性狀：光滑、粗糙、有無光澤等。邊緣情況：整齊、不整齊、鋸齒狀等。顏色：無色、白色、黃色、灰色等。透明度：不透明、透明、半透明等。質地：硬、軟、脂狀、磨狀等。粘度：奶油狀、黏液狀、膜狀易碎等。乳化性：指在生理鹽水中，將一菌落在鹽水中研磨形成均勻乳狀或顆粒狀的程度。菌落形狀：圓形、不整形、扁平、凸起、凹面菌落形態學

BacterialColonyMorphology菌落形態學

BacterialColonyMorphol有莢膜的細菌菌落較大并且表面光滑，而沒有莢膜的則表面較粗糙；具有芽孢的細菌菌落表面常有褶皺并且不透明。沒有鞭毛不運動的細菌，特別是球菌，常形成較小、較厚、邊緣較整齊的菌落；有鞭毛的細菌則較大而扁平，邊緣波狀、鋸齒狀等；有莢膜的細菌菌落較大并且表面光滑，而沒有莢膜的則表面較粗糙；食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落單增李斯特氏菌在普通計數瓊脂平板上的菌落單增李斯特氏菌在普通計數瓊脂平板上的菌落2．細菌在鑒定培養基上的特征（1）在血平板上的溶血特征α溶血：在菌落周圍出現狹窄的草綠色的半透明區域，而紅細胞外形完整。β溶血：在菌落周圍出現一個大小不一的完全透明清楚的寬帶。γ溶血：看不到溶血帶的溶血。2．細菌在鑒定培養基上的特征食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件雙環：菌落周圍完全溶解的暈圈外有一部分溶血的圓圈。雙環：菌落周圍完全溶解的暈圈外有一部分溶血的圓圈。(2)卵黃瓊脂中的反應：此培養基用于檢查細菌是否產生卵磷脂酶和脂酶，前者是在菌落周圍出現一沉淀環，后者則是出現“珍珠包膜”，即在菌落周圍出現“珍珠層”，通過反射光可見菌落周圍有一層閃光膜。(2)卵黃瓊脂中的反應：菌落白色混濁環，菌落白色混濁環，菌落周圍無混濁白環菌落周圍有混濁白環乳糖卵黃瓊脂平板,借以確定該菌可否產生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相應抗血清所抑制，菌落周圍菌落周圍乳糖卵黃瓊脂平板,借以確定該菌可否產生卵磷脂(3)蛋白水解作用：在菌落周圍出現清晰的環。(4)色素：細菌在生長過程中可產生色素。水溶性色素溶在培養基中，使培養基著色，如綠膿色素、熒光色素等；脂溶性色素則使細菌菌落著上顏色，如金黃色葡萄球菌的金黃色菌落。(3)蛋白水解作用：在菌落周圍出現清晰的環。（5）氣味：有些細菌在生長過程中可產生氣味，有助于細菌的鑒定。能產生特殊氣味的細菌有：假單胞菌屬細菌可產生葡萄汁氣味；變形桿菌產生巧克力燒焦的臭味；鏈球菌產生地窖里的霉臭；梭菌可產生糞臭、腐敗味；產黑色素類桿菌屬細菌產生辛辣味等。（5）氣味：有些細菌在生長過程中可產生氣味，有助于細菌的鑒定(二)細菌在液體培養基中的生長現象細菌在液體培養基中一般以培養18～24h，觀察生長特性為好。細菌在液體中生長特性包括：1．發育程度以有無生長，微弱、中等、旺盛來表示。2．渾濁度有無渾濁以及渾濁的程度(一般以混、中等、微渾、透明表示)；均勻渾濁、有顆粒；絮狀生長。(二)細菌在液體培養基中的生長現象3．沉淀細菌由于重力而下沉，如鏈球菌的鏈與鏈相互纏繞而下沉，出現肉眼可見的沉淀，而上層的液體仍清澈透明，或者由于發酵分解糖產生酸，而使基質中的蛋白質發生沉淀。4．液體表面性狀有無表面生長以及生長的性狀，如膜狀(厚薄)、環狀、皺狀、是否光滑或呈顆粒狀。5．其他有無色素，有無氣味，有無產酸情況，有無氣體產生。3．沉淀細菌由于重力而下沉，如鏈球菌的鏈與鏈相互纏繞而下液體培養物的觀察未接種形成薄膜形成沉淀混濁生長絮狀生長液體培養物的觀察未接種形成薄膜(三)細菌在半固體培養基中的生長現象半固體培養基主要用于細菌動力的觀察。有動力的細菌在穿刺線處有生長線外，在穿刺線的周圍均可見渾濁和細菌生長的小菌落；無動力的細菌僅在穿刺線上有生長，周圍的培養基透明清晰。(三)細菌在半固體培養基中的生長現象斜面培養物的觀察絲狀樹狀念珠狀擴展狀假根狀刺毛狀斜面培養物的觀察絲狀樹狀五、細菌的生化反應檢查法由于細菌各自的酶系統不同，新陳代謝的產物也有所不同，而這些產物又各具有不同的生物化學特性。為此，可利用生物化學的方法來鑒別一些在形態和其它方面不易區別的細菌，這種試驗稱為細菌的生化反應試驗。五、細菌的生化反應檢查法在培養物中加入某種底物與指示劑，經接種、培養后，觀察培養基的PH值變化。在培養物中加入試劑，觀察它們同細菌代謝產物所生成的顏色反應。根據酶作用的反應特性，測定酶的存在。根據細菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細菌的生長情況。在培養物中加入某種底物與指示劑，經接種、培養后，觀察培養基的生化試驗的注意事項1、待檢菌應是新鮮培養物。培養18-24h。2、待檢菌應是純種培養物。3、遵守觀察反應的時間。觀察結果的時間，多為24或48小時。4、應做必要的對照試驗。5、提高陽性檢出率，至少挑取2-3個待檢的疑似菌落分別進行試驗。生化試驗的注意事項1、待檢菌應是新鮮培養物。培養18-24h（一）糖類代謝試驗（二）氨基酸和蛋白質代謝試驗（三）有機酸鹽和銨鹽代謝試驗（四）酶類試驗生化試驗分類（一）糖類代謝試驗生化試驗分類(一)糖類代謝試驗1.糖(醇)發酵試驗原理糖類是作為碳源和能量來源提供細菌合成菌體成分必需的原料，由于細菌各自有不同的酶系統，故對糖(醇)類的分解能力不盡相同。有的能分解某些糖類，生成酸又生成氣體，有的雖能分解這些糖類但只能生成酸不能生成氣體，有的則根本不能分解。借此特點，可以作為鑒定細菌的依據之一。該試驗檢查細菌對加在基礎培養基中的特殊的糖發酵(降解)后產酸或產酸產氣的能力。(一)糖類代謝試驗常用的糖、醇單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖、鼠李糖雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖、蕈糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇類：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛茅醇常用的糖、醇單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖、鼠李糖方法(1)試劑：糖發酵培養基中，常用的指示劑主要有酚紅、溴麝香草酚藍、溴甲酚紫和酸性復紅等。前二者顏色反應較敏感，但穩定性較差。后二者比較穩定。特別是對發酵遲緩的細菌，培養時間較長，則以后二者為優。(2)培養基：液體糖發酵管，半固體糖發酵管，固體糖發酵管，雙糖(或三糖)高層斜面發酵管。(3)操作：以無菌操作的方法將經分離培養的純種細菌接種到糖(醇)發酵培養基中，置溫箱內，按各類菌所要求溫度(通常為37℃)經一定時間(數小時至二周)培養，然后觀察結果。方法氣泡導管氣泡氣泡陽性陽性陰性培養基變為黃色培養基未變色、無氣泡產生氣泡導管氣泡氣泡陽性陽性陰性培養基變為黃色培養基未變色、無氣結果(1)接種的細菌，如能分解培養基中的糖(醇)類而生成酸，由于培養基內加有指示劑，故可使培養基中的指示劑呈酸性反應，如產生氣體，則可使半固體培養基內或液體培養基中倒置的小管出現氣泡。如若不分解則無任何反應。結果糖酵解試驗

不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產氣或不產氣。可用指示劑及發酵管檢驗。糖酵解試驗不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用記錄：產酸不產氣，陽性，以“+”表示產酸產氣，陽性，以“⊕”表示不產酸產氣，陰性，以“-”表示記錄：(2)在半固體糖發酵管中，還可以觀察細菌的動力，若為有鞭毛的細菌，則沿接種線向周圍擴散生長。若為無鞭毛菌，則僅在接種線處生長。(2)在半固體糖發酵管中，還可以觀察細菌的動力，若為有鞭毛的(3)在雙糖(或三糖)高層斜面發酵管中，由于葡萄糖含量僅為乳糖或蔗糖的1/10，如細菌只分解葡萄糖，則斜面上產生的酸少，且易被氧化并因產生氨以及細菌分解培養基中的蛋白質產生堿性物質而變弱堿性，故斜面變為粉紅色，而底層變酸，指示劑變色。若細菌分解葡萄糖，同時也分解乳糖或蔗糖時，則產酸量較多，底層和斜面均呈酸性，指示劑亦變色。若在此培養基中加入硫酸亞鐵或尿素，同時還可以觀察細菌產生硫化氫及尿素分解情況。(3)在雙糖(或三糖)高層斜面發酵管中，由于葡萄糖含量僅為乳注意事項(1)各種糖發酵培養基，含糖的濃度一般為5～10g/L，有時為20g/L。(2)有些糖類，可因121℃高壓蒸汽滅菌時水解變質，特別是在堿性溶液中更易被破壞，故含糖的培養基常用115℃，15min滅菌。亦可先將糖類單獨配制成100～200g/L的水溶液，經115℃15min滅菌后，然后再以無菌操作的方法加入已滅菌的培養基中。此外，還可將糖的溶液用濾菌器進行濾過除菌，再加入培養基中。(3)若應用微量發酵管，或要求培養時間較長時，應注意保持其周圍的濕度，以免培養基干燥。注意事項2.甲基紅(MR)試驗原理某些細菌分解葡萄糖的過程中產生丙酮酸，丙酮酸進一步被代謝成為乳酸，乙酸，甲酸等。使培養基的pH下降至4.5以下，加入甲基紅指示劑出現紅色為陽性；有些細菌分解葡萄糖產酸量少，或產生的酸進一步轉化為其他物質，最終的酸類較少，培養基pH較高，加入甲基紅指示劑呈黃色為陰性反應。因此該試驗是檢查細菌發酵葡萄糖產生并保持穩定的酸性終末產物和克服體系緩沖作用的能力，某些細菌比其他細菌能夠產生更多的酸。2.甲基紅(MR)試驗方法(1)培養基：葡萄糖蛋白胨水(MR/VP培養基)。(2)試劑：甲基紅指示劑。(3)操作：待檢菌18～24h純培養物接種于葡萄糖蛋白胨水培養基中；37℃培養2～3d，每2ml培養液加2滴甲基紅指示劑，立即觀察。方法結果

MR陽性：培養物有足夠的酸，能使培養基表面甲基紅試劑仍保持明顯的紅色(pH4.4)；MR陰性：培養基表面呈黃色(pH6.0)；延遲反應：橙色，應繼續孵育到4天，并重復試驗。結果食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件3.伏普試驗(V-P試驗)某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V-P（+）反應。3.伏普試驗(V-P試驗)方法(Barritt法)(1)試劑：甲液為60g/Lα－萘酚酒精溶液；乙液為400g/LKOH溶液.(2)操作：首先將被檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水中，經37℃培養4d。再按每2ml培養液中加入甲液lml、乙液0.4ml，充分搖動試管，觀察結果。結果如立即或于數分鐘內出現紅色反應者為陽性；若為陰性應將試管置37℃中4h后再進行觀察。方法(Barritt法)4.β-半乳糖苷酶試驗原理細菌的酶分為結構酶和適應酶。β-半乳糖苷酶是一種誘導酶，它對半乳糖苷的作用是特異的。發酵乳糖的大腸菌類能產生β-半乳糖苷酶-滲透酶和β-半乳糖苷酶，因此能迅速地(在24～48h內)分解乳糖，并通過中間產物半乳糖和葡萄糖形成CO2和H2。非乳糖發酵菌缺少這兩種酶，因此乳糖既不能進入菌體，又不能被分解。然而，不能發酵乳糖的細菌可呈現兩種表型之一：一是G-P+

，即沒有β-半乳糖苷酶(G)，但有滲透酶(P)，因此不能發酵半乳糖苷，但能積累半乳糖苷；二是G+P-，具有β-半乳糖苷酶(G)，但沒有滲透酶(P)。通過使用有機化合物鄰位-硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)證明有無β-半乳糖苷酶活性，可預測細菌發酵乳糖的能力。若有半乳糖苷酶陽性的細菌存在，無色的ONPG試劑被水解，釋放出黃色化合物鄰位-硝基苯酚(ONP)。陽性β-半乳糖苷酶試驗就是基于對鄰位-硝基苯酚的檢測。4.β-半乳糖苷酶試驗通過使用有機化合物鄰位-硝基苯β-方法(1)培養基：10g/L乳糖肉湯瓊脂。(2)試劑：0.01mol/L磷酸鹽緩沖液；鄰硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)液。(3)操作：首先將被檢菌接種到10g/L乳糖肉湯瓊脂上，經37℃培養過夜，以無菌方法取一接種環菌置于0.25ml的生理鹽水中做成菌懸液，然后加ONPG液0.25ml，置于37℃溫箱或水浴箱中，分別在20min和3h后觀察結果。結果如有β-半乳糖苷酶，一般在20～30min即呈現黃色者為陽性；如無此酶則24h不變色。方法5.七葉苷水解試驗原理某些細菌(如糞鏈球菌)可水解七葉苷，生成葡萄糖和七葉素(為一種珊瑚狀的白色結晶)。七葉素可與培養基中的檸檬酸鐵試劑的二價鐵離子起反應生成黑色的化合物沉淀，使培養基變黑。5.七葉苷水解試驗方法(1)培養基：七葉苷培養基。(2)操作：以無菌方法將試驗菌接種到七葉苷瓊脂斜面培養基上，經37℃18～24h培養，觀察結果。結果

培養基變黑色者為試驗陽性。若將糞鏈球菌接種到七葉苷液體培養基中，經37℃4～6h培養，培養基即可。方法6.石蕊牛乳試驗原理牛乳中含有大量的乳糖和酪蛋白，營養豐富，一般細菌均可在其中生長。一種細菌在石蕊牛奶中可表現一種或幾種代謝特性，每種代謝特性對一個特定細菌來說都是特異的。這樣，就有助于細菌的鑒定：①乳糖發酵；②石蕊還原；③凝固蛋白；④蛋白陳化(消化)；⑤氣體產生。有的細菌如產氣莢膜梭菌，對牛乳具有強烈發酵反應，產酸、產氣、凝固、胨化幾乎同時發生。所產生的氣體，可將培養基表層的凡士林沖至管口，牛乳可全被胨化變清，這種被稱為“洶涌發酵”是為該菌所特有。有的細菌不發酵乳糖，而分解含氮物質，生成氨及胺，使培養基變堿性，石蕊指示劑變藍紫色。6.石蕊牛乳試驗有的細菌如產氣莢膜梭菌，對牛乳具有強烈發酵方法(1)培養基：石蕊牛乳培養基。(2)操作：首先將培養基表面的一層凡士林在酒精燈上熔化，然后無菌取被檢菌接種到石蕊牛乳培養基中。接種后將培養基直立，置37℃溫箱培養，觀察結果。結果

產酸：若發酵糖產酸，使石蕊指示劑變為粉紅色。產氣：若發酵乳糖同時產氣者，可沖開覆蓋在培養基上的凡士林。凝固：若發酵乳糖產酸甚多，可使酪蛋白凝固。胨化：若將凝固的酪蛋白，繼續水解成蛋白胨，此時牛乳培養基的上段則變清。產堿：若不發酵乳糖，分解含氮物質，生成氨及胺，使培養基變堿性，石蕊指示劑變藍紫色。方法（二）氨基酸和蛋白質代謝試驗不同細菌分解蛋白質能力不同，可利用不同氮源來合成菌體蛋白質，可通過檢測加入蛋白質分解代謝后的產物或pH變化鑒定細菌。（二）氨基酸和蛋白質代謝試驗1.靛基質（Imdole）試驗某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。1.靛基質（Imdole）試驗某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸方法(1)培養基：蛋白胨水。(2)試劑：Kovac試劑；歐氏試劑。(3)操作：純培養物接種蛋白胨水培養基35℃培養24～48h，沿管壁徐徐加入Kovac氏試劑或歐氏試劑0.5ml，分為兩層，觀察。結果兩層液體交界處出現紅色為陽性，無色為陰性。方法靛基質試驗照片靛基質+靛基質試驗照片靛基質+2.硫化氫試驗原理某些細菌能分解培養基中的含硫氨基酸生成H2S，H2S可與加入培養基中的鉛或鐵離子生成黑色硫化物。2.硫化氫試驗方法與結果(1)瓊脂穿刺法：培養基：三糖鐵培養基、含硫酸亞鐵(或醋酸鉛)的半固體培養基。操作：將試驗細菌以接種針沿管壁穿刺接種到含醋酸鉛或硫酸亞鐵培養基中，經37℃24h培養后，觀察結果。結果：培養基變黑色為陽性。當產生硫化氫量少時，為了便于觀察結果，在穿刺接種培養時，一定要沿培養基管壁進行。方法與結果制好的培養基對照管斜面紅色，底面黃色培養基全黃色斜面、底部黃色，并產生H2S斜面紅色，底部黃色，產生H2S底面黃色，并產生CO2制好的培養基對照管斜面紅色，底面黃色培養基全黃色斜面、底部黃(2)醋酸鉛試紙法：培養基：含胱氨酸的半固體培養基、浸有醋酸鉛的濾紙條。操作：待檢菌穿刺接種培養基，懸掛醋酸鉛紙條，37℃培養24～48h。結果：試紙呈黑色為陽性。該法較敏感。(2)醋酸鉛試紙法：3.尿素酶試驗原理有些細菌(如某些變形桿菌)具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氨,使培養基pH上升，而變成堿性，使含有酚紅指示劑的培養基變成紅色。方法(1)培養基：尿素瓊脂。(2)操作：將待檢菌接種于尿素培養基，37℃培養18～24h，觀察結果，如為陰性應繼續觀察4d。結果培養基變紅為陽性，不變為陰性。3.尿素酶試驗尿素酶試驗圖陽性尿素酶試驗圖陽性1、未接種2、尿素酶陽性3、尿素酶陰性1、未接種4.明膠液化試驗原理某些細菌產生明膠酶可使明膠分解，失去凝固力，使其由半固體轉化為液體狀態。天然存在的蛋白質分子太大不能進入菌體細胞，因此，細菌為了利用這些蛋白質，首先必須將其分解為較小的組分。某些細菌分泌細胞外類蛋白水解酶(明膠酶)來分解蛋白質，這種能力有助于細菌的鑒定。4.明膠液化試驗方法(1)培養基：明膠培養基(2)操作：將待檢菌穿刺接種于明膠培養基，同時設置對照管(未接種細菌)，20℃培養5～7d，觀察。在孵育期間，每24h取出試管(包括含細菌的試驗管相對照管)放冰箱(或冰浴)內約2h，檢查明膠是否已被消化(液化)，每天一次，直到7d，除非發生液化。有許多菌種要證實明膠液化需要延長孵育時間。結果半固體培養基不再凝固為陽性。方法注意事項:明膠在≤20℃時為固體，≥35℃時則為液體。從凝膠(固態)轉變為液體大約在28℃。所以，明膠管在≥35℃下孵育時，在決定是否液化以前，必須先放在冰箱或冰浴中冷卻一段時間。因細菌在培養基的表面生長引起液化，當明膠管還溫熱時不要搖動，否則液化的明膠與培養基液體混合，由此忽略陽性結果，造成假陰性。注意事項:5.苯丙氨酸脫氨酶試驗原理某些細菌產生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸和游離氨，加入FeCl3試劑與苯丙酮酸螯合后出現綠色產物，隨后綠色可褪去。延長時間后，所生成的綠色會較快褪色。苯丙酮酸如與檸檬酸鐵相遇則產生棕黑色。5.苯丙氨酸脫氨酶試驗方法(1)培養基：苯丙氨酸培養基。(2)試劑：100g/LFeCl3溶液。(3)操作：被檢菌濃厚接種于苯丙氨酸瓊脂斜面上，37℃培養18～24h，滴加100g/LFeCl3試劑數滴于斜面上，自上流下觀察。結果須在5min內作出判斷，出現綠色為陽性。方法加氯化鐵試劑出現綠色+加氯化鐵試劑出現綠色+6.氨基酸脫羧酶試驗原理細菌產生的脫羧酶可使氨基酸脫掉羧基，生成胺和CO2，胺可使培養基pH升高，用指示劑顯示這個變化。常用的氨基酸有三種，脫羧反應如下：(1)賴氨酸：賴氨酸經過賴氨酸脫羧酶作用生成尸胺和CO2。(2)鳥氨酸：鳥氨酸經鳥氨酸脫羧酶的脫羧作用，產生腐胺和CO2。(3)精氨酸：L-精氨酸經精氨酸脫羧酶的作用，可產生精胺和CO2。6.氨基酸脫羧酶試驗(1)賴氨酸：賴氨酸經過賴氨酸脫羧酶作方法(1)培養基：氨基酸脫羧酶培養基。(2)操作：待檢菌接種于氨基酸培養基及對照培養基，35℃培養1～4d。延長時間則常有假陽性出現，假陽性系由蛋白胨中其他種氨基酸分解而造成，故必須同時接種對照管。結果檢測培養基由黃色變紫色為陽性，黃色為陰性，對照(無氨基酸)為黃色。方法試驗管對照管陽性+陰性-對照管變黃試驗管變黃試驗管對照管陽性+陰性-對照管變黃試驗管變黃陽性反應試驗管顏色變化過程紫色→黃色→紫色原理：對照管呈黃色，說明有細菌生長。在培養的早期（10~12h），細菌發酵葡萄糖產酸使培養液PH下降，指示劑溴甲酚紫由紫色變為黃色，以后由于氨基酸脫羧生成胺，PH又回升至堿性，指示劑顯紫色。陽性反應試驗管顏色變化過程紫色→黃色→紫色陽性反應試驗管顏色變化過程：紫色→黃色→紫色陽性反應試驗管顏色變化過程：7.精氨酸雙水解試驗原理細菌分解精氨酸產堿不限于精氨酸脫羧酶。精氨酸雙水解酶可使精氨酸經過兩次水解，產生鳥氨酸、兩分子氨和一分子CO2。經氣相色譜分析證明，沙門菌分解精氨酸系由于精氨酸雙水解酶，而大腸埃希菌則系由于精氨酸脫羧酶。7.精氨酸雙水解試驗方法(1)培養基：含精氨酸的氨基酸脫羧酶試驗培養基及對照培養基。(2)操作：自斜面培養物接種，作腸桿菌科的鑒定時可覆蓋滅菌的液狀石蠟，作假單胞菌屬的鑒定時則不能覆蓋液狀石蠟。于37℃培養。方法結果指示劑顏色轉為堿性時為陽性。即溴甲酚紫轉為紫色，酚紅轉為紅色。但由培養基pH的改變不能證明是由精氨酸脫羧酶或由精氨酸雙水解酶，欲鑒別應作氣相色譜分析。結果指示劑顏色轉為堿性時為陽性。即溴甲酚紫轉為紫色，酚紅8.肉渣消化試驗原理肉渣消化試驗是測定細菌對蛋白質的另一種分解能力。某些梭菌在生長過程中可將肉渣消化。例如肉毒梭菌有很強的消化能力，皰肉培養基可被消化而呈黑色，有助于和其他梭菌的鑒別。8.肉渣消化試驗方法(1)培養基：皰肉培養基。(2)操作：試驗菌按常規法接種于皰肉培養基，用蠟筆于培養基的肉渣上緣畫一橫線作為標記。于37℃培養數日。結果觀察管內肉渣的高度有無變化，即可判定肉渣是否已被部分消化。方法9.凝固血清消化試驗原理某些細菌液化凝固血清，系由于這些細菌產生一種胞外蛋白酶的作用所致方法(1)培養基：呂氏血清培養基。(2)操作：取試驗細菌，以無菌方法接種于呂氏血清斜面上，經37℃培養數日，觀察結果。結果凝固之血清發生液化為陽性。9.凝固血清消化試驗(三)有機酸鹽和銨鹽代謝試驗1.檸檬酸鹽利用試驗原理有些細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源，能在除檸檬酸鹽外不含其他碳源的培養基上生長，分解檸檬酸鹽，生成碳酸鈉，使培養基變成堿性。(三)有機酸鹽和銨鹽代謝試驗方法(1)培養基：檸檬酸鹽培養基。(2)操作：被檢菌接種于檸檬酸鹽斜面培養基上，35℃培養l～4d，觀察。結果培養基由淡綠色變為深藍色為陽性，不變色為陰性。方法指示劑為：1%溴麝香草酚藍(酒精溶液)或0.04%苯酚紅10mL/1000mL水用脫脂棉過濾，制成后為黃綠色。指示劑為：1%溴麝香草酚藍(酒精溶液)或0.04%苯酚紅1斜面有菌苔生長，培養基斜面變為藍色或深藍色，為陽性，記+；無菌苔生長，培養基斜面仍為綠色者，為陰性，記-斜面有菌苔生長，培養基斜面變為藍色或深藍色，為陽性，記+；2.馬尿酸鈉水解試驗三氯化鐵法原理：B群鏈球菌具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸與三氯化鐵試劑結合，形成苯甲酸鐵沉淀.2.馬尿酸鈉水解試驗方法培養基:馬尿酸鈉培養基。試劑：三氯化鐵溶液。操作：待檢菌接種馬尿酸鈉培養基，35℃培養48h，離心沉淀，取上清液0.8mL加入三氯化鐵溶液0.2mL，立即混合均勻，經10～15min觀察結果。結果：出現穩定的沉淀物為陽性，輕搖后沉淀物溶解為陰性。方法茚三酮法原理：馬尿酸被細菌分解后，形成苯甲酸及甘氨酸。甘氨酸在茚三酮的作用下，經氧化脫氨基反應，生成氨，CO2和相應的醛，而茚三酮則生成了還原型茚三酮。其中形成的氨和還原型茚三酮，與殘留的茚三酮起反應，形成紫色化合物。茚三酮法方法：試劑：l％馬尿酸鈉水溶液；3.5g茚三酮溶于100mL的1：1的丙酮，丁酮混合溶液。操作：0.4ml待檢菌與等量的1％馬尿酸鈉水溶液混合后，35℃培養2h，加入0.2ml茚三酮試劑，振搖后觀察。結果：出現紫色為陽性。方法：3.丙二酸鹽利用試驗原理某些細菌利用丙二酸鹽作為唯一碳源時，丙二酸鈉可被分解生成碳酸鈉，使培養基變堿性。溴麝香草酚藍：溴麝香草酚藍是一種酸堿指示劑，變色范圍pH6.0(黃)～7.6(藍)。普通水是中性，pH也就是7左右，差不多呈淡藍，溶有二氧化碳后，由于會形成碳酸，碳酸是弱酸，因此pH不會降太多，變黃。當中過渡顏色是綠色。3.丙二酸鹽利用試驗方法(1)培養基：丙二酸鈉培養基。(2)操作：被檢菌接種于丙二酸鹽培養基，于35℃培養24～48h后觀察結果。結果：培養基由綠色變為藍色為陽性，顏色無變化為陰性。方法陽性+陽性+(四)酶類試驗1.氧化酶試驗(Kovacs試驗)原理氧化酶(又稱細胞色素氧化酶)是細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶，能使還原型的細胞色素C氧化成氧化型的細胞色素C，氧化型細胞色素C又使對苯二胺氧化，生成紅色的醌類化合物。(四)酶類試驗方法(1)試劑：10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液，或10g/L鹽酸二甲基對苯二胺水溶液。(2)操作：取濾紙片蘸取待測菌落少許，加試劑一滴，觀察顏色變化。也可用滴管吸取試劑，直接將一滴滴在待測菌菌落上，觀察顏色變化。結果：陽性者立即呈現粉紅色或紅色，顏色逐漸變深至深紫色。方法成藍色為+不變色或為紅色為-成藍色為+不變色或為紅色為-2.過氧化氫酶試驗(觸酶試驗)原理過氧化氫酶又稱觸酶，可使細菌代謝過程中的過氧化氫分解為水和氧。2.過氧化氫酶試驗(觸酶試驗)方法(1)試劑：新鮮配制的3％過氧化氫水溶液。(2)操作：挑取1環固體培養基上的待測菌菌落，放于潔凈玻片上或試管內，滴加3％過氧化氫數滴，觀察結果。實驗時必須用18～24h新鮮培養物。陳舊培養物可能使觸酶失活，出現假陰性結果。此外，不宜挑取血瓊脂上的菌落，因紅細胞內含有觸酶，會導致假陽性結果。結果30s內有大量氣泡產生者為陽性，無氣泡產生者為陰性。方法菌落－平板－1滴3％的過氧化氫。陽性。過氧化氫酶：菌落－平板－1滴3％的過氧化氫。過氧化氫酶：3.硝酸鹽還原試驗原理某些革蘭氏陰性桿菌在代謝過程中，能將培養基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸反應生成重氮苯磺酸，再與α-萘胺結合，生成紅色的N-α萘胺偶氮苯磺酸。3.硝酸鹽還原試驗方法(1)培養基：硝酸鹽培養基。(2)試劑：①甲液：對氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸100ml；②乙液：α-萘胺0.5g，5mol/L醋酸100ml。操作：待測菌株接種到硝酸鹽培養基中，35℃18～24h培養后，加入0.1ml甲、乙液等量混合液于試管內，觀察結果。結果出現紅色為陽性，無顏色變化為陰性。方法食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件4.過氧化物酶試驗（1）原理:過氧化物酶的作用是將過氧化氫中的氧轉移給可被氧化的物質。（2）其反應如下：試驗時，若以聯苯胺(4,4-二氨基聯苯)作為被氧化的物質，試驗細菌如有過氧化物酶存在時，加入過氧化氫可使苯胺氧化成為藍色的聯苯胺藍。4.過氧化物酶試驗（3）方法試劑：鹽酸聯苯胺溶液；3％過氧化氫溶液。操作：將鹽酸聯苯胺溶液與過氧化氫溶液等量混合后，滴加于菌落上，立即觀察結果。（4）結果陽性者于2min內呈現藍色。（3）方法5.脫氫酶試驗（1）原理細菌的脫氫酶可使相應的作用物脫去氫，但此作用需要一個可還原的化合物作為受氫體。若用美藍（亞甲藍，Methyleneblue）作為受氫體的話，細菌如有脫氫酶存在，可使美藍還原成美白(無色)。但是，美白易被空氣中氧氣所氧化，故此試驗應在隔絕空氣下進行。染料、醫藥、鑒識血跡5.脫氫酶試驗如果用無色TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑

）作為受氫體，在有脫氫酶存在的情況下，TTC可以接受氫而成為紅色的Formazan（甲臜zā

)。后者不再被氧氣所氧化，所以試驗不必在密閉的條件下進行。2,3,5-氯化三苯基四氮唑如果用無色TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）作為受氫（2）方法試劑：1︰30000美藍水溶液；pH7.4磷酸鹽緩沖液；0.1mol／L的作用物水溶液。操作：①取試驗菌肉湯培養物10ml，離心后以緩沖液洗2次，再加緩沖液5ml，制成菌液。②取試管3支，每管加美藍水溶液0.5ml，于第1管和第3管各加菌液1ml，第2管加緩沖液1ml，置37℃水浴中15min。③第1管和第2管各加作用物2ml，第3管加緩沖液2ml。④各管加無菌液狀石蠟0.5ml，使覆蓋于液面上。⑤置37℃水浴中，每5min觀察一次，記錄美藍變白時間，共觀察2h。（2）方法(3)結果若第1管變白即為相應作用物的脫氫酶陽性，不變色為陰性。第2管與第3管為對照管，應不變色。(3)結果6.氧化三苯基四氮唑試驗(TTC試驗)(1)原理部分細菌可還原無色可溶性的氯化三苯基四氮唑，成為紅色的三苯甲臜(Formazan)。6.氧化三苯基四氮唑試驗(TTC試驗)(2)方法(i)試劑貯存液：用無菌蒸餾水配制Na2HPO4飽和液，取氯化三苯基四氮唑(TTC)775mg，溶于100mlNa2HPO4飽和液中混勻后，放置于暗處，可保存2～3個月。應用液：取貯存液4ml，加Na2HPO4飽和液至100ml，混勻后，置暗處，可用2～4周。(2)方法(ii)操作：①以無菌吸管吸取清潔中段尿2ml置于無菌試管中。②加TTC試劑應用液0.5ml。③混勻后，置37℃,8h培養后觀察結果。(3)結果出現紅色者為陽性，淡紅色者為弱陽性，不變色者為陰性。(ii)操作：①以無菌吸管吸取清潔中段尿2ml置于無菌試管中7.脂酶試驗(1)原理某些細菌產生卵磷脂酶，即α-毒素，在有鈣離子存在時，能迅速分解卵磷脂，生成混濁沉淀狀的甘油酯和水溶性的磷酰膽堿。(2)方法培養基：卵黃瓊脂培養基。操作：將待檢菌劃線接種于卵黃瓊脂平皿上，于35℃培養3～6h。(3)結果產生卵磷脂酶的細菌，培養3h后，在菌落周圍形成乳白色混濁環，6h后擴散至5～6mm。7.脂酶試驗8.磷酸酶試驗(1)原理磷酸酶是一種單膦酸酯的水解酶，可使單磷酸酯水解，其反應可根據反應基質的不同而異，如用磷酸酚酞為基質，經磷酸酶水解后可釋放出酚酞，在堿性環境中可呈紅色。8.磷酸酶試驗(2)方法培養基：于1000ml溶化的適宜瓊脂培養基并冷至45℃時，加入過濾除菌的1％磷酸酚酞溶液lml，搖勻后傾注平板。操作：取被檢菌的純培養物接種上述平板，于35℃培養18～24h，于平板蓋內加l滴濃氨水，熏蒸片刻。(3)結果如有酚酞釋出，菌落即變為粉紅色(2)方法9.DNA酶試驗(1)原理DNA酶可將脫氧核糖核酸(DNA)長鏈水解成由幾個單核苷酸組成的寡核苷酸鏈。長鏈DNA可被酸沉淀，水解后產生的寡核苷酸則可溶于酸，在DNA瓊脂平皿上加入鹽酸后，在菌落周圍形成透明環。9.DNA酶試驗(2)方法培養基：DNA酶試驗培養基。操作：點狀接種待檢菌于DNA瓊脂平皿上，35℃培養18～24h，用lmol/L鹽酸傾注平皿，觀察結果。(3)結果菌落周圍產生透明環為陽性，無透明環為陰性。(2)方法10.血漿凝固酶試驗(1)原理金黃色葡萄球菌可產生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白原轉變為纖維蛋白，附著于細菌的表面，產生凝固。凝固酶可分為兩種，一種是與細胞壁結合的凝固酶，可用玻片法測定；另一種是菌體生成后釋放于培養基中的游離凝固酶，可用試管法測出。10.血漿凝固酶試驗(2)方法(i)玻片法：在玻片上分別滴加新鮮人或兔血漿及生理鹽水各一滴，挑取待檢菌的菌落，分別與血漿和生理鹽水混合，立即觀察結果，如血漿中有明顯顆粒出現，而生理鹽水中無自凝現象為陽性。(2)方法有凝塊均勻混濁血漿生理鹽水血漿凝固酶試驗有凝塊均勻混濁血漿生理鹽水血漿凝固酶試驗(ii)試管法：小試管3支內各加入l︰4稀釋的新鮮人或兔血漿0.5ml，①其中一支加待檢菌18～24h肉湯培養物0.5ml，②另一支加陽性菌株18～24h肉湯培養物0.5ml，③再一支加肉湯培養基0.5ml為陰性對照，輕振混勻。3支試管放37℃水浴中3～4h，觀察結果。(3)結果待檢菌株管和陽性菌株管出現凝固，陰性對照管不出現凝固，為陰性。(ii)試管法：小試管3支內各加入l︰4稀釋的新鮮人或兔血漿陽性反應陰性反應不凝固少量、零散凝固明顯的塊狀凝固巨大塊凝固完全凝固，倒置不流動陽性反應陰性反應不凝固少量、零散凝固明顯的塊狀凝固巨大塊凝固金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗

金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件第二節免疫學基礎第二節免疫學基礎第二節免疫學基礎自1896年Widal和Sicad將免疫凝集反應技術用于傷寒的診斷以來，已經過去了一個多世紀，在這100多年里，免疫學技術得到了巨大的發展。凝集反應：當顆粒性抗原與其相應的抗體特異結合時，在電解質存在下，兩者比例合適時，可出現凝集顆粒，此現象稱凝集反應。凝集反應主要分為直接凝集和間接凝集反應兩類。目前免疫學技術已經廣泛地應用于醫學檢驗、農業、生物分類、食品檢驗、法醫鑒定以及有毒有害物質的鑒別和檢驗等諸多方面。第二節免疫學基礎自1896年Widal和Sicad將一、抗原與抗體（一）抗原（Antigen，Ag）1、抗原的定義和特性（1）定義抗原是指進入動物體內能刺激動物的免疫系統發生免疫應答，從而引起動物產生抗體或形成致敏淋巴細胞，并能和抗體或致敏淋巴細胞發生特異性反應的物質。一、抗原與抗體（一）抗原（Antigen，Ag）完全抗原包括下面兩方面的免疫性能：一是免疫原性,指抗原進入體內刺激免疫系統產生抗體或形成致敏淋巴細胞的特性，具有這種能力的物質稱為免疫原；二是免疫反應性，指抗原能和對應的抗體或致敏淋巴細胞發生特異性反應的特性，又稱為反應原性。完全抗原包括下面兩方面的免疫性能：有些物質，例如某些真菌毒素，單獨存在時只有反應原性而無免疫原性，是非免疫原物質，被稱為半抗原（hapten）。半抗原必須經過改造后才具有免疫原性有些物質，例如某些真菌毒素，單獨存在時只有反應原性而無免（2）免疫原性免疫原性是完全抗原非常重要的性質之一，一種抗原能否成功地誘導免疫動物（宿主）產生免疫應答取決于以下幾個方面的因素：抗原結構和性質、宿主的反應性和免疫方式。

（2）免疫原性在抗原的結構和性質方面，包括抗原的異質性、分子量大小和化學結構等。

異質性是指抗原物質和宿主動物本身物質之間的差異。分子量的大小也是影響抗原免疫原性的一個重要因素，一般當抗原的分子質量大于10ku時，均具有較好的免疫原性，分子質量越大，免疫原性越強。大分子物質的結構比較復雜，所含有效抗原基團的種類和數量也較多。在抗原的結構和性質方面，包括抗原的異質性、分子量大小和化宿主的反應性和免疫方式也影響著抗原的免疫原性，宿主的個體發育、生理狀態和遺傳性等都對免疫原性有很大的影響，所以不同種動物，甚至同種動物的不同個體對同一抗原的免疫均有差異。宿主的反應性和免疫方式也影響著抗原的免疫原性，宿主的個體宿主的主要組織相容性復合物的基因控制著免疫應答。宿主的免疫方式，即免疫動物的機體與抗原的相互作用方式對抗原的免疫應答也有很大影響，主要包括抗原的進入途徑、劑量、次數、間隔時間等。宿主的主要組織相容性復合物的基因控制著免疫應答。食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件抗原的免疫原性能否真正得到體現除了取決于抗原本身的組成和結構外，還與免疫動物的生理狀態和免疫方式等有密切的關系。抗原的免疫原性能否真正得到體現除了取決于抗原本身的組成和（3）特異性抗原的特異性表現在兩個方面：在免疫原性上，一種抗原只能誘發一種特異的免疫應答，結果形成特異性抗體或致敏淋巴細胞；在反應原性上，抗原只能與抗原誘導產生的特異性抗體或致敏淋巴細胞進行反應。（3）特異性抗原特異性是由特異性的抗原決定簇決定的。抗原決定簇或稱為抗原表位,是位于抗原物質分子表面或者其他部位的具有一定組成和結構的特殊化學基團，它能與免疫系統中淋巴細胞上的受體及相應的抗體分子結合，是免疫原引起機體特異性免疫應答和免疫原與抗體特異性反應的基本構成單位。抗原特異性是由特異性的抗原決定簇決定的。食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件抗原的特異性是免疫學技術廣泛應用于疾病診斷、鑒別和防治的基礎。在分子生物學研究方法中使用的免疫分子探針也是基于這種高度的特異性。抗原的特異性是免疫學技術廣泛應用于疾病診斷、鑒別和防治的2、抗原的分類抗原的分類方法很多，可以根據來源分，也可以根據其化學組成與理化性質，以及親緣關系等來進行分類2、抗原的分類天然抗原：天然具有抗原性的生物物質，如血漿、酶、激素。含多種抗原成分，具有種的特異性如血漿中的血漿蛋白質具有多種抗原性。

人工抗原：用人工方法將沒有免疫原性的小分子化合物聯指于蛋白質載體上所制成的復合抗原。完全抗原：既具有免疫原性又具有反應按抗原性質原性的物質。不完全抗原：只有反應原性而沒有免疫原性的物質。

不完全抗原簡單半抗原（半抗原）復合半抗原（1）按抗原性質分天然抗原：天然具有抗原性的生物物質，如血漿、酶、激素。含多種（2）按化學組成分蛋白質抗原：蛋白質破壞、改變喪失；蔗糖可抑制其變性多糖抗原：與蛋白質結合后，刺激動物產生抗體；福爾馬林處理后對熱穩定

類脂抗原：類脂多糖、蛋白多糖復合物、特異性多糖抗體、細菌細胞壁多糖蛋白復合物（2）按化學組成分蛋白質抗原：蛋白質破壞、改變喪失；蔗異種抗原(heteroantigen)：與免疫動物不同種屬的抗原。同種抗原(Alloantigen)：與免疫動物同種屬的抗原，能刺激同種而基因型不同的個體產生免疫應答。自身抗原(Autoantifen)：動物的自身組織細胞、蛋白質在特定條件下形成的抗原，對自身免疫系統具有抗原性。異嗜性抗原(Heterophilantigen)：是指與種屬特異性污垢、存在于人、動物、植物及微生物之間性質相同的抗原（交叉抗原）。也叫Fossman抗原（Fossman，瑞典病理學家）。（3）按來源分異種抗原(heteroantigen)：與免疫動物不同種屬（4）按存在部位分菌體抗原：（O存在于細胞壁、主要成分為脂多糖）為數種成分所組成，按O抗原分類表面抗原鞭毛抗原：（H）指存在于鞭毛，主要成分為蛋白質。H抗原細菌抗原也有不同菌群特異性莢膜抗原：主要成分為多肽

深部抗原指細菌的內部結構所形成的抗原物質（免疫中不起作用）病毒抗原：V抗原：不耐熱

S抗原：可溶性（4）按存在部位分（二）抗體1、抗體的定義、分布和分類抗體（antibody，Ab）是由抗原刺激動物的免疫系統后，由免疫系統產生分泌的能和相應抗原發生特異性結合的免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）。通常Ab和Ig可作為同義詞使用。（二）抗體抗體主要存在于動物血清中，也存在于動物的其他體液和體外分泌液，例如乳汁和細胞分泌液中。另外，抗體還存在于某些細胞，例如B淋巴細胞的膜上。抗體主要存在于動物血清中，也存在于動物的其他體液和體外分Ig包括很多種類，根Ig的理化特性和與抗原結合方式的不同，Ig可以分為類和亞類，例如人類的Ig可分為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE五大類，其中IgG和IgA分別可進一步分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgA1、IgA2亞類。小鼠Ig的分類和人類Ig分類相同，但是IgG的亞類稍有差別，分別為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。IgG是Ig中主要的組成成分，約占血清總蛋白質的15%。應用于免疫學技術中的抗體主要是IgG和IgM，以IgG最為常用。Ig包括很多種類，根Ig的理化特性和與抗原結合方式的不同2、抗體的結構不同種類Ig的存在形式不同，以人的Ig為例，IgG、IgE和IgD以抗體單體的形式存在，而IgM和IgA則通常由多個抗體單體組成。IgM是由五個抗體單體通過J鏈（joiningchain）連接在一起的五聚體，而IgA則是由J鏈連接在一起的二聚體、三聚體甚至四聚體。2、抗體的結構食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件Ig的類型:Ig的類型:據根研究內容的不同，免疫檢測技術可以分為細胞免疫檢驗技術和體液免疫檢驗技術兩大類。細胞免疫檢驗技術主要檢測免疫活性細胞及其功能，在醫學檢驗、診斷和相關研究中應用較多。體液免疫檢驗技術則主要是檢測抗原和抗體等免疫活性物質，它除了用于醫學檢驗和分析外，在生物分類、食品檢驗、法醫鑒定等諸多方面都得到了廣泛的應用。該技術主要是以抗原抗體的特異性反應為基礎而建立起來的。二、常用的免疫學技術據根研究內容的不同，免疫檢測技術可以分為細胞免疫檢驗技術（一）抗原－抗體反應抗原-抗體反應，即抗原和抗體之間的特異性反應，可以發生在體內，也可以發生在體外，前者可以介導體內毒素中和、殺菌和溶菌等作用，后者在體外進行，是免疫檢測技術的基礎，但是它們的基本反應特性是相同的。在進行體外免疫學實驗時，通常是以存在于血清中的抗體(也是抗體的主要存在形式)為材料進行的，所以體外免疫學反應又稱為血清學反應。（一）抗原－抗體反應

1、抗原抗體反應的原理抗體（Ab)是球蛋白分子，在水溶液中，由于分子之間電荷等的相互作用而呈膠體狀，不會自然沉淀，同樣(可溶性)抗原(例如蛋白質)在溶液中一般也不會自然沉淀。當抗原(Ag)和對應的特異性抗體結合反應時，電荷減少或消失從而使它們由親水膠體變為疏水膠體，形成肉眼可見的抗原-抗體復合物。1、抗原抗體反應的原理抗原與抗體的特異性結合是基于抗原和相應抗體分子之間的結構互補性與親和性進行的，這些特性是由抗原和抗體分子的一級結構決定的。抗原抗體分子之間的特異性結合力包括電荷引力、范德華(vanderWaals)力、氫鍵和疏水作用。

抗原與抗體的特異性結合是基于抗原和相應抗體分子之間的結構

2、抗原-抗體反應的特性抗原-抗體反應的最大特點是①特異性

，抗原抗體反應實際上是抗原決定簇和抗體的超可變區之間的相互結合，由于它們兩者之間在化學結構和空間構型上高度互補，所以決定了它們之間的反應是高度特異的。2、抗原-抗體反應的特性其次是②可逆性，抗原抗體之間的反應是可逆的。反應平衡常數K＝k1/k2，其中k1為正反應速度常數，k2為逆反應速度常數。由于K值反映了抗原抗體之間的結合能力，抗原抗體之間的親和力通常也以它來表示。其次是②可逆性，抗原抗體之間的反應是可逆的。反應平衡常數影響K值的因素很多，主要包括電解質的種類與濃度、pH值和溫度等。在實踐中可以通過調節這些影響因素來促進或削弱抗原抗體的結合。例如，在抗體的親和層析中，首先調節pH值等因素使抗體結合在固定化的抗原上，通過洗脫液洗滌去除不能結合的其他雜質，然后調節洗脫液的pH值至酸性，使抗體與抗原的結合力削弱或消失，從而被洗脫下來，達到純化的目的。影響K值的因素很多，主要包括電解質的種類與濃度、pH值和抗原抗體反應的另一個非常重要的特性是③比例性，即只有抗原抗體的比例適當時才能出現最強的反應，通常表現為沉淀最多或吸光值最大等現象。抗原抗體反應的另一個非常重要的特性是③比例性，即只有抗原１、凝集反應2．沉淀反應3、補體結合試驗4．免疫標記技術常見的血清學反應１、凝集反應2．沉淀反應3、補體結合試驗4．免疫標記技術常見１、凝集反應顆粒性抗原＋相應抗體→凝集塊。包括：直接凝集反應、間接凝集反應、反向間接凝集反應、協同凝集反應等。１、凝集反應顆粒性抗原＋相應抗體→凝集塊。包括：直接凝集食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件凝集反應凝集反應包括：單向瓊脂擴散、雙向瓊脂擴散、對流免疫電泳、火箭電泳等。2．沉淀反應可溶性抗原＋相應抗體一定條件沉淀物包括：單向瓊脂擴散、雙向瓊脂擴散、對流免疫電泳、火箭電泳等。食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件對流免疫電泳常用于鑒定血清型。即將抗原和抗體在瓊脂凝膠孔中電泳，帶負電荷的抗原向正極運動，帶正電荷的抗體向負極運動，二者在瓊脂凝膠中相互作用而形成沉淀線。火箭電泳（rocketelectrophoresis）又稱電免疫擴散法，主要用于檢測標本中某一免疫球蛋白含量。方法是將含有已知抗體的瓊脂制成瓊脂板。冷凝后，在液板上的陰極端挖一排小孔。孔中分別加入一定量的待檢樣品及不同稀釋度的標準抗原，進行電泳。抗原向陽極移動，并與抗體結合。在抗原、抗體比例適當的部位形成錐形沉淀峰，其形狀如火箭。該峰的高度與抗原量成正比。可快速測出標本中抗原的含量。本法的敏感度與單向瓊脂擴散相仿，技術操作較為復雜，但需時間較短。對流免疫電泳用熒光素、酶、放射性同位素、膠體金、電子致密物等標記已知抗原或抗體，通過檢測標記來反映抗原抗體反應的情況，從而間接地測出被測抗原或抗體的存在與否或量的多少。（1）免疫熒光技術：（2）免疫酶技術：（3）放射免疫測定法：3．免疫標記技術(4)免疫印跡法：(5)免疫金標技術：(6)免疫PCR：用熒光素、酶、放射性同位素、膠體金、電子致密物等標記已知抗原食品微生物檢驗：食品微生物檢驗基礎課件免疫酶技術目前常用的是ELISA（酶聯免疫吸附試驗）免疫酶技術目前常用的是ELISA（酶聯免疫吸附試驗）Thanks！Thanks！食品微生物檢驗基礎食品微生物檢驗基礎Contents第一節細菌學檢驗基礎1第二節免疫學檢驗基礎2第三節分子生物學基礎3Contents第一節細菌學檢驗基礎1第二節免疫學檢驗第一節細菌學檢驗基礎一、無菌技術二、微生物的接種與分離技術三、細菌的培養方法四、細菌的生長現象五、細菌的生化反應檢查法第一節細菌學檢驗基礎一、無菌技術一、無菌技術一、無菌技術（一）什么是無菌技術指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施。（一）什么是無菌技術指在微生物實驗工作中，控制或防止各類（二）無菌環境無菌室無菌柜超凈工作臺（二）無菌環境無菌室1、無菌室（1）無菌室的結構：更衣間、緩沖間、操作間（2）無菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外線照射（1~2小時）.每周用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）.每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒。1、無菌室（1）無菌室的結構：更衣間、緩沖間、操作間2、超凈工作臺

超凈臺的使用與保養:（1）風速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上;（3）讓超凈臺預工作10~15分鐘;（4）使用完畢后，用70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈.2、超凈工作臺

超凈臺的使用與保養:

（三）無菌器材滅菌器材：玻璃器皿、培養基、無菌衣等.消毒器材：無菌室內的凳子、試管架、天平、工作臺、手等（三）無菌器材滅菌器材：玻璃器皿、培養基、無菌衣等.（四）無菌操作1、目的：（1）是保證待檢