傳代細胞培養實驗費曉方掌握無菌操作技術。了解傳代細胞的培養的一般方法與步驟。了解培養細胞的消化分散。了解細胞計數方法。了解培養液配制方法。了解倒置顯微鏡的使用。實驗目的和要求：為什么要學習細胞培養？動物細胞培養可分為原代培養和傳代培養。直接從有機體獲取的細胞進行的培養是原代培養，若將培養細胞洗脫后轉移到另外的容器中進行在培養叫做傳代培養。目前，動物細胞培養技術已經達到一個新的階段：從不同分化組織衍生得到的許多類型的細胞能夠成功地在培養液中生長、反復傳代。在維持一個獨特細胞系長達數月的過程中，記錄下細胞的倍增次數和生長速率是很有用的，以便在合適的時間傳代以及在體外生活是中不同時間凍存細胞。實驗內容：*早期細胞培養，依靠的是精湛的操作技術和盡可能的靠近火焰一達到細胞的無菌化。*目前，超凈臺是使工作臺無菌化最經濟有效的手段。

（1）超凈臺的選擇，應選擇層流超凈臺。不能選擇平流超凈臺。超凈臺應該盡可能的安裝紫外燈。

（2）超凈臺的維護，超凈臺的HEPA過濾層應該每一年或一年后由認可的機構進行維修。1.工作環境及表面的處理（超凈臺的使用）（3）使用超凈臺的方法，在每次使用前，應用紫外燈照30分鐘。首先打開吹風的開關，在關掉紫外燈，打開日光燈。點燃酒精燈，開始操作。（4）超凈臺表面的處理。a.應做到每日清潔，以使操作中濺出的培養液或其它液體及時被清除而不蓄積，達到杜絕細菌和真菌繁殖的目的。b.工作臺中只限放置每日工作所必需的物品，其他非必須物應當除去。c.日常的清潔工作包括：用70%的酒精或10%的新潔而滅擦洗工作臺。用固定的容器裝廢棄液。3.實驗者的操作技術無菌操作的原則：保證細胞培養板，細胞培養皿，細胞培養瓶內部以及吸管包裹層等內部的無菌狀態。細胞培養應在超凈工作臺或有空氣濾過裝置的工作間里進行。培養液或其它溶液不應該在工作區以外打開。裝吸管或吸頭的容器也不應該在工作區以外打開。細胞培養中液體的吸取，均需機械移液裝置移取。切勿采用口吸的方法?？谖亲畲蟮奈⑸镂廴驹矗匾氖羌毎囵B液及成分通過食入或吸入的方式及入人體，可能對研究人員造成傷害。細胞培養瓶在超凈臺中打開后，瓶蓋應蓋頂超下放置與工作臺中。4.細胞的處理以及維持細胞生長所需培養液的無菌處理。基本培養液由必須氨基酸、維生素、無機鹽、葡萄糖和作為生長因子、激素和貼壁因子來源的血清組成。一般用碳酸氫鈉（NaHCO3)體系進行緩沖。細胞的生長不僅產生CO2，也需要CO2才能生存。所以，細胞的培養需要子在CO2培養箱中CO2培養箱中CO2的濃度應與培養液中碳酸氫鈉平衡。如果CO2的濃度為5%，則配培養液中應加入1.97g/L的碳酸氫鈉。培養瓶蓋應輕輕的擰上，不要完全擰死，以保證氣體的交換。培養液的pH值應為7.2至7.4。培養液的配制：商家一般以三種形式提供培養液：1.粉末劑（需要實驗著配制）2.濃縮裝（用無菌水稀釋即可）3.無需進一步處理的工作液形式。由于粉末劑是其中最便宜的一種，一般實驗室較多采用。配制培養液需要濾菌裝置：除菌器、真空泵以及0.45μm或0.22μm的濾膜。培養液應貯藏在4°C冰箱中。配好的培養液應在無抗菌素的無菌條件下進行培養，每次配好后留樣，培養72小時，觀察培養液確實沒有污染后使用。學習傳代細胞的培養技術本次試驗應用HeLa細胞或A375-S2細胞進行傳代培養。HeLa細胞：人子宮頸癌細胞株A375-S2細胞：人黑色素瘤細胞株操作前的準備（超凈臺內物品擺放）實驗材料：每組的超凈臺中有以下物品：1.50mlRPMI1640培養液1瓶；5ml小牛血清（FCS)1瓶；2ml胰蛋白酶1瓶；1ml谷氨酰胺1瓶；1mlHepes1瓶；PBS(-)1瓶2.滅菌1ml移液管1支；裝有試管的滅菌小飯盒1個；試管架1個；1ml，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；細胞計數板1塊；鑷子1把，小燒杯1個；酒精燈1臺；培養好細胞的細胞培養瓶1個操作前準備（酒精燈）2.倒掉原有的細胞培養液，加入5mlPBS(-)洗滌2次。

3.加入胰蛋白酶100-200μl，迅速前后旋轉細胞培養瓶4-5次，以便胰蛋白酶包被所有細胞，于37°C培養箱中孵育5分鐘，消化細胞

4.在顯微鏡下觀察，細胞變化。待到細胞變為球形，尚未從培養瓶壁上脫落下來時，用移液管吹打，使細胞從培養瓶壁上脫落下來，加入細胞培養液2-5ml。5.如果細胞不能吹打下來，再放回培養中孵育幾分鐘

7.取出離心管，倒掉上清液，在桌面上輕敲離心筒，使沉降在離心筒底的細胞分散均勻。

8.倒入5ml細胞培養液，混勻。細胞計數細胞計數：1.按上述方法，用胰蛋白酶處理細胞，細胞重懸于細胞培養液中。2.用沾有70%酒精的棉球擦凈細胞計數板和蓋玻片，蓋玻片放好在細胞計數板上。3.用移液器吸取細胞標本10μl，加入10μl臺盼氏蘭溶液混勻，吸取10μl混合液從蓋玻片的一側將混合液打入蓋玻片與計數板之間。4.在顯微鏡下，計數或細胞。5.計數細胞計數板每一小室中，上下左右角和中間的大方格中（5個格）的細胞數。每毫升細胞總數=[(A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2)]

1032稀釋倍數第一小室的細胞總數第二小室的細胞總數9.取1104個細胞放入細胞培養瓶內，加入5-8ml培養液。

10.顯微鏡下觀察。11.將傳代細胞放入培養箱中培養。

12.兩天后顯微鏡下觀察細胞生長情況活力染色：*臺盼蘭染料排斥實驗。*臺盼蘭配成0.4%w/v濃度。*加入細胞后，染料的停留不少于3分鐘，不超過10分鐘。*由于健康細胞能排斥臺盼蘭染料，但是細