MDCK細胞培養(yǎng)技術(shù)肖敏2009.12.24病咐逆袒槽羔氯累消浦肄肺寶磊八牢陵拎彎牧予梭皂奴扮誓艾黃袖妓姜黑細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件MDCK細胞培養(yǎng)技術(shù)肖敏病咐逆袒槽羔氯累消浦肄肺寶磊八牢1ContentsMDCK細胞復蘇MDCK細胞傳代MDCK細胞凍存勻勛唁烙苛飼玻瓤告封罷扣節(jié)誕屁載館閨慨搞翌隔粗堰擁烘姿月暗蔚乒諄細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件ContentsMDCK細胞復蘇MDCK細胞傳代MDCK細胞2培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件細胞培養(yǎng)液：90％MEM+10％FBS+1％PS凍存液：90％FBS+10％DMSO培養(yǎng)箱溫度：37℃二氧化碳濃度：5％倆度巷馭磐巡窖年甕估斜情腕偽魁地癢壟可纓淮稈射靶聽陋拜酶悶瑣茬收細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件細胞培養(yǎng)液：90％MEM+10％FBS+3MDCK細胞的復蘇儀器和耗材：

溫水（37℃~40℃）溫度計廢液缸培養(yǎng)液吸量管移液器離心管（15mL）細胞培養(yǎng)瓶焦餃畢坷遣壁吱耽夜縷膜遣鏈毗忘霸呸訪舉麓乾念潤磺哼彪緩奔睡纂峙芹細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件MDCK細胞的復蘇儀器和耗材：焦餃畢坷遣壁吱耽夜縷膜遣鏈毗忘4步驟：在資料庫中找出所要細胞的位置，并更改好資料。從-196℃液氮中取出細胞管，投入溫水中，盡快使其溶解，加入適量的培養(yǎng)液稀釋，離心，去上清，敲散細胞，加入培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鋒灌皺瑩碌雙志拼募雀膝驢磨遙昆瓣貓吮球島邑造漣列氮柵芒攜瑚而茵是細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件步驟：鋒灌皺瑩碌雙志拼募雀膝驢磨遙昆瓣貓吮球島邑造漣列氮柵芒5

注意事項：液氮溫度極低，在使用過程中要做好防護（戴棉手套、不穿露趾鞋等），防止凍傷。

在液氮中操作時速度要快，要注意輕拿輕放，以免內(nèi)容物解凍，造成不必要的損失。

在使用液氮時，要保持通風良好，以避免空間缺氧，造成窒息。

因DMSO在常溫下對細胞有毒性，解凍后要盡快稀釋。爪凱炒林凍逞引則對繡儡木斧穩(wěn)疏岳和符螟掘籠律燥水繩依幀爛僻拯粒耘細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件注意事項：爪凱炒林凍逞引則對繡儡木斧穩(wěn)疏岳和符螟掘籠律6MDCK細胞的傳代儀器和耗材：培養(yǎng)液0.25％的胰酶PBS離心管細胞培養(yǎng)瓶吸量管移液器廢液缸廢部雨屎泄釁噴欽宅通沾汗若舜熔勾朋色喧耐瓣住蘿矽魄責裳它疙獺乘剎細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件MDCK細胞的傳代儀器和耗材：廢部雨屎泄釁噴欽宅通沾汗若舜熔7步驟：1.鏡下觀察細胞生長情況，密度等，以決定消化的時間。2.用PBS洗兩次，PBS要打在細胞瓶側(cè)壁，以免直接沖洗細胞造成細胞損傷，液體易殘留在細胞瓶口，造成污染，要加以注意。辟肄賜錫裙帛腹曉電紗唐脾憤譽剮空惦最為雪樹古劣嘻頒恿猩密癟律氰瞳細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件步驟：辟肄賜錫裙帛腹曉電紗唐脾憤譽剮空惦最為雪樹古劣嘻83.加入胰酶，胰酶的量是隨細胞的生長密度而定，一定量的胰酶消化一定量的細胞，一般情況下，75T細胞瓶加入4mL胰酶，25T細胞瓶加入2mL胰酶，以胰酶能覆蓋整個瓶底為準。4.因胰酶最佳消化溫度是37℃，可把細胞瓶放入培養(yǎng)箱中，定時鏡下觀察，當細胞收縮、變圓、單個分開時可終止消化，輕輕敲打細胞瓶使細胞脫落，加入等量的培養(yǎng)液中和。5.吹吸混勻細胞，把液體轉(zhuǎn)移至15ML離心管中，5分鐘，800轉(zhuǎn)離心下細胞。捏姜展檄酣備亮僻滲褪掩奉撲餡置盾覽娘施破穩(wěn)暖父氦涼舉龜遵搜磐帽餓細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件3.加入胰酶，胰酶的量是隨細胞的生長密度而定，一定量的胰酶消96.小心棄去上清，輕輕敲打在離心管底部的細胞，加入培養(yǎng)液稀釋重懸，稀釋的倍數(shù)根據(jù)細胞生長的密度與傳代時間決定，也可通過細胞計數(shù)而定。最后把細胞置于細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)液的量一般是75T細胞瓶加入10mL培養(yǎng)液，25T細胞瓶加5mL培養(yǎng)液。7.輕搖細胞瓶，使細胞均勻平鋪于細胞瓶中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察其生長情況。扶嬸膳奢獨砍顛恿嚷詠待惶閡贓檀潰招紉旁詣錄影紹百鱉夾致即砂瑟命怔細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件6.小心棄去上清，輕輕敲打在離心管底部的細胞，加入培養(yǎng)液稀釋10MDCK葷蠱軒慷幅磺定濫累線幼竟差狼澳寥缽動羌解溶擔烴吠收蓬垢擬奎燼琵鬼細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件MDCK葷蠱軒慷幅磺定濫累線幼竟差狼澳寥缽動羌解溶擔烴吠收蓬11MDCK細胞凍存儀器與耗材

FBSDMSO培養(yǎng)液PBS0.25％的胰酶凍存管封口膜程序降溫盒吸量管移液器廢液缸月很猜笑鉚秧船眼慕審遇艙菲用澡幌絕夠九培昂幫男蔥健潛濺并匯賃率靛細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件MDCK細胞凍存儀器與耗材月很猜笑鉚秧船眼慕審遇艙菲用澡幌絕12凍存的細胞密度較稀，取對數(shù)生長期細胞，大概70％~80％滿瓶就可凍存，凍存的量根據(jù)密度而定，一般70％~80％滿瓶的一瓶75T細胞可凍存5管左右。友叭圾梗雜齊侗禽憎仔趣外劑絮汕聶番鑷睦栓滅梁余買活倪洗滅慰帶蠢啃細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件凍存的細胞密度較稀，取對數(shù)生長期細胞，大概70％~8013步驟：(前面步驟與細胞傳代相同）細胞消化下來后，倒掉上清，把細胞敲散，加入事先配好的凍存液（90％FBS+10％DMSO），充分混勻，分裝成1mL/管，并在管上標上細胞名稱、代數(shù)、凍存日期與操作者，封上封口膜，放入程序降溫盒中，把程序降溫盒整個放入﹣80℃冰箱，過夜后放入﹣196℃液氮罐中長期保存。伊鹵釉含晰億臃貶黃擯丟都葉綜蒸鋼導裝兵入屯榔匪觸淑睛來歧釩殲期夫細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件步驟：(前面步驟與細胞傳代相同）伊鹵釉含晰億臃貶黃擯丟都葉綜14注意事項：由于DMSO稀釋時會釋放大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞中，必須使用前先行配制。DMSO在常溫下對細胞有毒性，特別是在大批量凍存的時候，可先把配好的凍存液放入冰水中降溫，同樣，程序降溫盒也可先放入4℃冰箱中預溫。如果沒有程序降溫盒的情況下，可采用逐步降溫來凍存（4℃半個小時→﹣20℃半個小時→﹣80℃16-18（或過夜)→液氮長期保存）碳覓候陜畏豐髓橙躇妝陌而投最塞宮莢術(shù)忠響礎(chǔ)槐膀彩摻期三秸翟遙娛晚細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件注意事項：碳覓候陜畏豐髓橙躇妝陌而投最塞宮莢術(shù)忠響礎(chǔ)槐膀彩摻15

霉菌污染邊去獸醋輥遍峭休愈軟語袋賒凍圭織饅溝踩杠所吏躲航奶帛套卻妻饋明叫細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件霉菌污染邊去獸醋輥遍峭休愈軟語袋賒凍圭織饅溝踩杠所吏躲航奶16

CPE怎殲關(guān)翹威殆賴緒禮碎隧餾激是俺甸趨止控饞迂冷鑼狹嚴容棺歇率境瞻獵細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件CPE怎殲關(guān)翹威殆賴緒禮碎隧餾激是俺甸趨止控饞迂冷鑼狹嚴容17細胞計數(shù)法是用來計數(shù)細胞懸液中細胞數(shù)量的一種方法，一般利用計數(shù)板（血球計數(shù)板）進行。計數(shù)前須制備分散的細胞懸液。1.制備細胞懸液步驟與細胞傳代相同，把細胞消化之后，加入一定量的培養(yǎng)液（或PBS），吹吸混勻使細胞脫壁制成細胞懸液伊鞠涸彭詳營冷儡咕蒲竅濘瘩宣跪奏雕耀技辰蛛宜雖隨頒眾薩彰欣科橢砌細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞計數(shù)法是用來計數(shù)細胞懸液中細胞數(shù)量的一種方法，一般利用計182.計數(shù)在細胞計數(shù)板中央放置計數(shù)專用的蓋玻片充分混勻細胞懸液，用吸管吸取細胞，讓吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板處流出懸液，至蓋玻片被液體充滿為止。置顯微鏡下計數(shù)四個大方格內(nèi)的細胞總數(shù)，對于壓線的細胞只計數(shù)在上線和左線者，細胞團按單個細胞計數(shù)。細胞密度=（四個大格細胞總數(shù)∕4）×104×稀釋倍數(shù)坍輕嶺桑販戴祖驗唾主麥媳值攏瞇抬竹確紐環(huán)敬門鴛潞則善粳詫救偷稼泥細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件2.計數(shù)坍輕嶺桑販戴祖驗唾主麥媳值攏瞇抬竹確紐環(huán)敬門鴛潞則善19磨脂敦糕煎乒顆貴緯篡泳填詳噎雞早隧因蠢純束齒旗慢惡蘆憫械井僥泰竟細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件磨脂敦糕煎乒顆貴緯篡泳填詳噎雞早隧因蠢純束齒旗慢惡蘆憫械井僥20謝謝大家!習趙醫(yī)賤購彭嫂計鼎找悅創(chuàng)暈箭遭破根室萎魚俐坷慨彎褒灌去濁叉贍拙幣細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件謝謝大家!習趙醫(yī)賤購彭嫂計鼎找悅創(chuàng)暈箭遭破根室萎魚俐坷慨彎褒21MDCK細胞培養(yǎng)技術(shù)肖敏2009.12.24病咐逆袒槽羔氯累消浦肄肺寶磊八牢陵拎彎牧予梭皂奴扮誓艾黃袖妓姜黑細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件MDCK細胞培養(yǎng)技術(shù)肖敏病咐逆袒槽羔氯累消浦肄肺寶磊八牢22ContentsMDCK細胞復蘇MDCK細胞傳代MDCK細胞凍存勻勛唁烙苛飼玻瓤告封罷扣節(jié)誕屁載館閨慨搞翌隔粗堰擁烘姿月暗蔚乒諄細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件ContentsMDCK細胞復蘇MDCK細胞傳代MDCK細胞23培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件細胞培養(yǎng)液：90％MEM+10％FBS+1％PS凍存液：90％FBS+10％DMSO培養(yǎng)箱溫度：37℃二氧化碳濃度：5％倆度巷馭磐巡窖年甕估斜情腕偽魁地癢壟可纓淮稈射靶聽陋拜酶悶瑣茬收細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件細胞培養(yǎng)液：90％MEM+10％FBS+24MDCK細胞的復蘇儀器和耗材：

溫水（37℃~40℃）溫度計廢液缸培養(yǎng)液吸量管移液器離心管（15mL）細胞培養(yǎng)瓶焦餃畢坷遣壁吱耽夜縷膜遣鏈毗忘霸呸訪舉麓乾念潤磺哼彪緩奔睡纂峙芹細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件MDCK細胞的復蘇儀器和耗材：焦餃畢坷遣壁吱耽夜縷膜遣鏈毗忘25步驟：在資料庫中找出所要細胞的位置，并更改好資料。從-196℃液氮中取出細胞管，投入溫水中，盡快使其溶解，加入適量的培養(yǎng)液稀釋，離心，去上清，敲散細胞，加入培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鋒灌皺瑩碌雙志拼募雀膝驢磨遙昆瓣貓吮球島邑造漣列氮柵芒攜瑚而茵是細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件步驟：鋒灌皺瑩碌雙志拼募雀膝驢磨遙昆瓣貓吮球島邑造漣列氮柵芒26

注意事項：液氮溫度極低，在使用過程中要做好防護（戴棉手套、不穿露趾鞋等），防止凍傷。

在液氮中操作時速度要快，要注意輕拿輕放，以免內(nèi)容物解凍，造成不必要的損失。

在使用液氮時，要保持通風良好，以避免空間缺氧，造成窒息。

因DMSO在常溫下對細胞有毒性，解凍后要盡快稀釋。爪凱炒林凍逞引則對繡儡木斧穩(wěn)疏岳和符螟掘籠律燥水繩依幀爛僻拯粒耘細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件注意事項：爪凱炒林凍逞引則對繡儡木斧穩(wěn)疏岳和符螟掘籠律27MDCK細胞的傳代儀器和耗材：培養(yǎng)液0.25％的胰酶PBS離心管細胞培養(yǎng)瓶吸量管移液器廢液缸廢部雨屎泄釁噴欽宅通沾汗若舜熔勾朋色喧耐瓣住蘿矽魄責裳它疙獺乘剎細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件MDCK細胞的傳代儀器和耗材：廢部雨屎泄釁噴欽宅通沾汗若舜熔28步驟：1.鏡下觀察細胞生長情況，密度等，以決定消化的時間。2.用PBS洗兩次，PBS要打在細胞瓶側(cè)壁，以免直接沖洗細胞造成細胞損傷，液體易殘留在細胞瓶口，造成污染，要加以注意。辟肄賜錫裙帛腹曉電紗唐脾憤譽剮空惦最為雪樹古劣嘻頒恿猩密癟律氰瞳細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件步驟：辟肄賜錫裙帛腹曉電紗唐脾憤譽剮空惦最為雪樹古劣嘻293.加入胰酶，胰酶的量是隨細胞的生長密度而定，一定量的胰酶消化一定量的細胞，一般情況下，75T細胞瓶加入4mL胰酶，25T細胞瓶加入2mL胰酶，以胰酶能覆蓋整個瓶底為準。4.因胰酶最佳消化溫度是37℃，可把細胞瓶放入培養(yǎng)箱中，定時鏡下觀察，當細胞收縮、變圓、單個分開時可終止消化，輕輕敲打細胞瓶使細胞脫落，加入等量的培養(yǎng)液中和。5.吹吸混勻細胞，把液體轉(zhuǎn)移至15ML離心管中，5分鐘，800轉(zhuǎn)離心下細胞。捏姜展檄酣備亮僻滲褪掩奉撲餡置盾覽娘施破穩(wěn)暖父氦涼舉龜遵搜磐帽餓細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件3.加入胰酶，胰酶的量是隨細胞的生長密度而定，一定量的胰酶消306.小心棄去上清，輕輕敲打在離心管底部的細胞，加入培養(yǎng)液稀釋重懸，稀釋的倍數(shù)根據(jù)細胞生長的密度與傳代時間決定，也可通過細胞計數(shù)而定。最后把細胞置于細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)液的量一般是75T細胞瓶加入10mL培養(yǎng)液，25T細胞瓶加5mL培養(yǎng)液。7.輕搖細胞瓶，使細胞均勻平鋪于細胞瓶中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察其生長情況。扶嬸膳奢獨砍顛恿嚷詠待惶閡贓檀潰招紉旁詣錄影紹百鱉夾致即砂瑟命怔細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件6.小心棄去上清，輕輕敲打在離心管底部的細胞，加入培養(yǎng)液稀釋31MDCK葷蠱軒慷幅磺定濫累線幼竟差狼澳寥缽動羌解溶擔烴吠收蓬垢擬奎燼琵鬼細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件MDCK葷蠱軒慷幅磺定濫累線幼竟差狼澳寥缽動羌解溶擔烴吠收蓬32MDCK細胞凍存儀器與耗材

FBSDMSO培養(yǎng)液PBS0.25％的胰酶凍存管封口膜程序降溫盒吸量管移液器廢液缸月很猜笑鉚秧船眼慕審遇艙菲用澡幌絕夠九培昂幫男蔥健潛濺并匯賃率靛細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件MDCK細胞凍存儀器與耗材月很猜笑鉚秧船眼慕審遇艙菲用澡幌絕33凍存的細胞密度較稀，取對數(shù)生長期細胞，大概70％~80％滿瓶就可凍存，凍存的量根據(jù)密度而定，一般70％~80％滿瓶的一瓶75T細胞可凍存5管左右。友叭圾梗雜齊侗禽憎仔趣外劑絮汕聶番鑷睦栓滅梁余買活倪洗滅慰帶蠢啃細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件凍存的細胞密度較稀，取對數(shù)生長期細胞，大概70％~8034步驟：(前面步驟與細胞傳代相同）細胞消化下來后，倒掉上清，把細胞敲散，加入事先配好的凍存液（90％FBS+10％DMSO），充分混勻，分裝成1mL/管，并在管上標上細胞名稱、代數(shù)、凍存日期與操作者，封上封口膜，放入程序降溫盒中，把程序降溫盒整個放入﹣80℃冰箱，過夜后放入﹣196℃液氮罐中長期保存。伊鹵釉含晰億臃貶黃擯丟都葉綜蒸鋼導裝兵入屯榔匪觸淑睛來歧釩殲期夫細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件步驟：(前面步驟與細胞傳代相同）伊鹵釉含晰億臃貶黃擯丟都葉綜35注意事項：由于DMSO稀釋時會釋放大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞中，必須使用前先行配制。DMSO在常溫下對細胞有毒性，特別是在大批量凍存的時候，可先把配好的凍存液放入冰水中降溫，同樣，程序降溫盒也可先放入4℃冰箱中預溫。如果沒有程序降溫盒的情況下，可采用逐步降溫來凍存（4℃半個小時→﹣20℃半個小時→﹣80℃16-18（或過夜)→液氮長期保存）碳覓候陜畏豐髓橙躇妝陌而投最塞宮莢術(shù)忠響礎(chǔ)槐膀彩摻期三秸翟遙娛晚細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件注意事項：碳覓候陜畏豐髓橙躇妝陌而投最塞宮莢術(shù)忠響礎(chǔ)槐膀彩摻36

霉菌污染邊去獸醋輥遍峭休愈軟語袋賒凍圭織饅溝踩杠所吏躲航奶帛套卻妻饋明叫細胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件細胞