Rubisco及其活化酶抗體的制備及其在作物中的應(yīng)用研究生：陳相輝學(xué)號(hào)：01143 指導(dǎo)老師：王忠教授（揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，揚(yáng)州225009）Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase）是光合碳代謝中的關(guān)鍵酶，處于光合碳還原和光合碳氧化這兩個(gè)方向相反但又相互連鎖的循環(huán)的交叉點(diǎn)上，調(diào)節(jié)著光合作用和光呼吸的代謝比例，其活性大小對(duì)光合速率起著決定性作用。1、 選題依據(jù)Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合作用研究的熱點(diǎn)問題，如何提高作物中這兩種酶的含量和活性也一直是個(gè)懸而未解決的難題。目前，國內(nèi)外多以煙草、菠菜作為研究Rubisco和Rubisco活化酶的材料，涉及小麥和水稻等作物方面的內(nèi)容較少，尤其有關(guān)小麥Rubisco活化酶的研究仍然是國內(nèi)外研究中的空白。2、 研究目的和意義本試驗(yàn)擬用小麥為研究對(duì)象，研究Rubisco及其活化酶的酶學(xué)特性和調(diào)節(jié)機(jī)制。在研究方法上，酶的分離和提純方法采用最新技術(shù)，并有所改進(jìn)；而在含量測定上，將免疫學(xué)技術(shù)與植物生理生化技術(shù)相結(jié)合，采用抗體抗原特異性反應(yīng)的原理來測定，這也為免疫學(xué)在植物上的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在研究內(nèi)容上，不僅研究自然生長狀態(tài)下，Rubisco及其活化酶的含量和活性，而且設(shè)置多重處理，研究不同處理?xiàng)l件下和C3、C4植株體內(nèi)Rubisco，Rubisco活化酶含量、活性的變化，并結(jié)合光合速率、ATP、RuBP含量、葉綠素含量的測定，探討它們之間的內(nèi)在相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新之處是利用免疫化學(xué)技術(shù)提供一個(gè)快速、準(zhǔn)確而簡易的定量測定Rubisco和Rubisco活化酶的方法，從而可以預(yù)測光合潛力和估計(jì)由于礦質(zhì)營養(yǎng)、水分供給、光照、植物生長調(diào)節(jié)素和基因調(diào)控發(fā)生變化而引起光合作用和產(chǎn)量的變化。進(jìn)一步對(duì)Rubisco和Rubisco活化酶做深入的研究。3、 研究內(nèi)容3.1、 Rubisco和Rubisco活化酶的提取和純化3.2、 Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備3.3、 Rubisco和Rubisco活化酶ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定3.4、 C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比較及其與光合作用的關(guān)系3.5、 光暗處理對(duì)小麥光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶的影響3.6、 不同施氮水平對(duì)小麥光合速率和Rubisco、Rubisco活化酶的影響3.7、 Rubisco和Rubisco活化酶單克隆抗體制備初探4、材料和方法注射器JTTOC\o"1-5"\h\z4.1材料 與％,1.1.1植物材料 二、、揚(yáng)麥5號(hào)(’liiiicumaestivumL.CV.Yangmi :.5),田間自然生長，苗期葉片用于酶的提純，后期旗葉用于光合速率、Rubisco活性和含量的測 " '定。 圖1新西蘭大白兔4.1.2動(dòng)物材料健康的新西蘭大白兔，體重2?3公斤，首先免疫三聯(lián)苗(兔瘟、巴氏桿菌病、魏氏梭菌病)，一周后進(jìn)行試驗(yàn)。4.2試劑與儀器液相層析收集系統(tǒng),Bio-Rad垂直板電泳系統(tǒng)，高速冷凍離心機(jī),Gene-System紫外分光光度計(jì)；SephadexG-25,DEAE-纖維素(DEAE-TOYOPEARL-650M,日本)，PMSF,Benzamidine，F(xiàn)reund氏完全和不完全佐劑，ATP，Leupetine，HEPES，DTT，已純化且具有活性的Rubisco為本實(shí)驗(yàn)室保存。Rubisco活化酶的純化取100g新鮮小麥葉片，放入液氮中速凍10min，取出后先在碾缽中碾碎，再加入2g不溶性PVP和少量石英砂以及300mLRubisco活化酶提取液(50mmol/LHEPES-KOHPH7.0,1mmol/LEDTA,5mmol/LMgCl2,0.4mmol/LATP,15mmol/LDTT,1mmol/LPMSF,2mmol/LBenzamidine,0.01mmol/LLeupeptin)。將混合物在0°C下?lián)v碎15~20min，勻漿后用4層紗布過濾，30000g離心45min，上清液用飽和(NH4)2SO4(pH7.0)鹽析，取20%~35%的蛋白質(zhì)段，沉淀用5mL含35%飽和(NH4)2SO4的緩沖液(20mmol/LHEPES-KOHpH7.0,0.4mmol/LATP,10mmol/LDTT,100mmol/LKCl)懸浮，10000g離心10min后，沉淀用3mL不含(NH4)2SO4的緩沖液溶解，離心，經(jīng)SephadexG-25(1.5X20cm)脫鹽，用緩沖液平衡和洗脫，收集到的蛋白質(zhì)峰在液N2中過夜。次日，沉淀溶解后20000g離心10min，上清液經(jīng)DEAE-纖維素(DEAE-TOYOPEARL-650M)陰離子交換柱(1.5X20cm)，先用25mL洗脫液(20mmol/LHEPES-KOHpH7.0,4mmol/LDTT)洗脫，然后用60mL含0~0.5mol/LKCl的洗脫液梯度洗脫。洗脫速度為1mL/min，每1mL收集一管，蛋白質(zhì)峰進(jìn)行活性和純度鑒定。得到的蛋白質(zhì)峰加ATP至1mmol/L，經(jīng)SDS檢驗(yàn)酶純度后，用于酶特性分析。其余酶液先用液氮保存，后轉(zhuǎn)入-70C低溫冰箱中，用作制備Rubisco活化酶抗體。為了減少酶的失活，純化過程均在4C下進(jìn)行。Rubisco活化酶的SDS分析配置12%分離膠，3.2%濃縮膠，將20pl樣品與4pl的6倍上樣緩沖液混合煮沸3min，自然冷卻后，上樣。在120V、40mA條件下恒壓電泳2.5h。電泳結(jié)束后用含2%考馬斯亮蘭(G250)染色液染色30min，7.5%冰醋酸和5%的甲醇脫

色液過夜脫色。Rubisco活化酶抗體的制備按Sambrood[50]等皮下多位點(diǎn)分?jǐn)?shù)次注射法免疫大白兔。第一次免疫將0.5mL抗原與0.5mLFreund氏完全佐劑充分混合制成油包水乳劑，皮下注射于每只兔子背部多個(gè)部位，每個(gè)部位0.20?0.25mL,4?5點(diǎn)。半個(gè)月之后，進(jìn)行第二次免疫，方法同第一次，只是將Freund氏完全佐劑換成Freund氏不完全佐劑即可。以后每隔兩周進(jìn)行一次皮下多點(diǎn)注射免疫，方法與第二次完全一樣。三免后可從耳緣靜脈采血，檢測抗血清滴度，如滿足實(shí)驗(yàn)要求，則通過心臟采血，全血以10000rpm離心1min，后放置于4°C冰箱中過夜，次日吸取其上清即可用于實(shí)驗(yàn)。如滴度太低不滿足需要，則可繼續(xù)以第二次免疫方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫。Rubisco抗體的制備方法類同于活化酶抗體的制備，只是將抗原換成Rubisco即可。4.7蛋白質(zhì)含量的測定用紫外分光光度法，分別測定260nm、280nm吸光度。以O(shè)D280X1.45-OD260X0.74計(jì)算出蛋白質(zhì)濃度（mg?mL-1）。4.8ELISA法測定酶含加KubiMo抗慷JiUKubiscofA體加酵標(biāo)第二抗體加磋物抗血加KubiMo抗慷JiUKubiscofA體加酵標(biāo)第二抗體加磋物抗血igg 血3房珈抗體Ruhjsco抗體與 酶促底物成附于裁體表新與抗原結(jié)合 酵標(biāo)策二抗體站肖顯色反應(yīng)用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原（Rubisco和Rubisco活化酶）與制備的Rubisco和Rubisco活化酶的抗體反應(yīng)，制成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將待測樣品與原的含量。之相比較，求得樣品中抗圖2之相比較，求得樣品中抗圖2ELISA法實(shí)驗(yàn)原理4.9蛋白質(zhì)含量的測定依Folin-酚試劑法（薛應(yīng)龍，1985）測定，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.10光合速率和葉綠素含量的測定采用美國CID公司的CID31OPC便攜式光合速率測定儀測光合速率；用日本產(chǎn)SPAD型葉綠素計(jì)測定，用綠色程度表示劍葉葉綠素的相對(duì)含量。5、實(shí)驗(yàn)進(jìn)展提取和純化了Rubisco和Rubisco活化酶。6、研究計(jì)劃6.1、 Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備6.2、 Rubisc