項目三：DNA濃度與純度的紫外分光光度計法分析一、 實驗目的學習利用紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，掌握濃度和純度的計算方法和實驗操作技術。二、 實驗原理組成核酸的堿基(G,A,T,C)在260nm處具有強吸收峰，所以通過測定260nm的吸收峰即可對DNA進行定量。但有時也會因為所處溶液的pH值不同而導致吸光系數的不同，因此，一般在中性pH值左右的環境中進行測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。核酸樣品中最常有的其它吸光物質為蛋白質，由于蛋白質在280nm處具有強吸收峰，因此測定A260/A280比率，可以判斷DNA的純度。純化的DNA及RNA的A260/A280比值應分別接近1.8及2.0，當溶液中含有蛋白質時，會造成A260/A280比值降低。計算原溶液的濃度(A)：A260X轉換因子x稀釋因子=原溶液DNA濃度(gg/ml)每吸光單位轉換因子：雙股DNA為50gg/ml；單股DNA或RNA為40gg/ml計算原溶液的摩爾數(以500bp大小的DNA片段為例)：每個脫氧核苷酸的平均分子量近似為324.5，因此分子量=500x324.5=162250摩爾濃度(mol/L)=A/162250x1000三、實驗儀器1、紫外-可見分光光度計2、移液器16套（每2人1套）四、 實驗材料1、 無菌槍頭20此各2支；2、 離心管五、 實驗試劑1、 無菌水2、 待測DNA溶液五、實驗步驟1、 取標準入DNA，稀釋，待用。2、 制作標準曲線（教師完成！）3、 取實驗一提取的基因組DNA，稀釋50倍后待用。4、 測定A260和A2805、 計算DNA濃度、純度紫外吸收檢測DNA濃度與純度2007年11月13日星期二11:40目的：了解紫外吸收檢測DNA濃度與純度的原理，掌握測定方法。原理：核酸的最大吸收波長為260nm，蛋白質為280nm，在波長260nm時，1OD值相當于雙鏈DNA濃度為50gg/ml，單鏈寡核苷酸的含量為30gg/ml，可以據此來計算核酸樣品的濃度，還可通過測定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280）,估計核酸的純度。純凈DNA的比值為1.8,RNA為2.0。若比值高于1.8說明DNA樣品中的RNA尚未除盡，若樣品中含有酚和蛋白質將導致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干擾。紫外分光光度法只能用于測定濃度大于0.25gg/ml的核酸溶液，對濃度更小的樣品，可采用熒光分光光度法。試劑與儀器：提取的質粒DNA，紫外分光光度儀。操作步驟：1）分光光度計先用水在260nm和280nm兩個波長下校零。2）取質粒DNA樣品2叫，用水稀釋100倍，轉入分光光度計的石英比色杯中。3）在260nm和280nm分別讀出樣品光密度值。754紫外-可見分光光度計操作規程用途：能在紫外、可見光譜區域對樣品物質作定性和定量的分析。波長范圍：200nm-800nm。操作要點：3、 插上電源，打開開關，打開試樣室蓋，按“A/T/C/F”鍵，選擇“T%”狀態，選擇測量所需波長，預熱30分鐘。4、 開始測量時要先調節儀器的零點，方法為：保持在“T%”狀態，當關上試樣室蓋時，屏幕應顯示“100.0”，如否，按“OA/100%”鍵；打開試樣室蓋，屏幕應顯示“000.0”，如否，按“0%”鍵，重復2-3次，儀器本身的零點即調好，可以開始測量。3、用參比液潤洗一個比色皿，裝樣到比色皿的3/4處（必須確保光路通過被測樣品中心），用吸水紙吸干比色皿外部所沾的液體，將比色皿的光面對準光路放入比色皿架，用同樣的方法將所測樣品裝到其余的比色皿中并放入比色皿架中。7、 將裝有參比液的比色皿拉入光路，關上試樣室蓋，按“A/T/C/F”鍵，調到“Abs”，按“OA/100%”鍵，屏幕顯示“0.000”，將其余測試樣品一一拉入光路，記下測量數值即可（不可用力拉動拉桿）。8、 測量完畢后，將比色皿清洗干凈（最好用乙醇清洗），擦干，放回盒子，關上開關，拔下電源，罩上儀器罩，并打掃衛生，才可離開。9、 本操作要點只針對測量吸光度而言。注意事項：7、 儀器使用前需開機預熱30分鐘8、 開關試樣室蓋時動作要輕緩9、 不要在儀器上方傾倒測試樣品，以免樣品污染儀器表面，損壞儀器10、一定要將比色皿外部所沾樣品擦干凈，才能放進比色皿架進行測定11、有任何疑問請報告指導老師12、使用完畢請認真填寫《儀器設備使用登記簿》，并交指導老師簽字。濃度測定：在一定范圍內，DMA或RNA的光密度0D細與其含量成正比，當使用1頷比色杯，0D傾=1時,dsDNA濃度約為50居/mbssDNA濃度約為37八/皿1,RNA濃度約為4gg/ml；寡核昔酸濃度約為3O.g/m1（由底物不同有差異）o根據以下公式可以汁算DNB在溶液中的濃度：質粒DN乳濃度（*gI沖【）=稀釋倍數X00^