1、核酸化學主題醫學知識核酸化學主題醫學知識核酸是存在于細胞中的一類大分子酸性物質，包括核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）兩大類。RNA和DNA都是以單核苷酸(nucleotide)為基本單位所組成的多核苷酸長鏈。RNA主要參與遺傳信息的表達，而DNA則是遺傳信息的載體。DNA主要存在于細胞核中，線粒體、葉綠體、質粒中也有少量DNA。RNA主要分布在細胞質中。在自然界中，人、動物、植物和微生物都含有核酸。核酸占細胞干重的515。第一節 概 述核酸化學主題醫學知識2核酸是存在于細胞中的一類大分子酸性物質，包括核

2、糖核酸（rib一、核酸的元素組成 組成核酸的基本元素：C、H、O、N、P； 其中P 的含量比較穩定，占9%-10%，通過測定P 的 含量來推算核酸的含量（定磷法）。 DNA平均含磷量為9.9%，RNA為9.4%。 任何核酸都含磷酸，所以核酸呈酸性。二、核酸的基本組成單位-核苷酸 核酸部分水解產生核苷酸，核苷酸進一步水解生成核苷和磷酸。核苷再水解生成堿基(嘌呤堿和嘧啶堿)和戊糖(核糖或脫氧核糖)。核酸的各種水解產物可用層析或電泳等方法分離鑒定。核酸的逐步水解過程可表示如下：核酸化學主題醫學知識3一、核酸的元素組成核酸化學主題醫學知識3核酸核苷酸磷酸核苷堿基戊糖 核糖嘌呤嘧啶核酸完全水解產物:脫氧

3、核糖核酸化學主題醫學知識4核酸核苷酸磷酸核苷堿基戊糖 核糖嘌呤嘧啶核酸完全水解產物:脫 核苷酸是核酸的基本結構單位，核酸是一類多聚核苷酸。RNA和DNA的基本化學組成見表。核酸化學主題醫學知識5 核苷酸是核酸的基本結構單位，核酸是一類多聚（一）核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12-D-2-核糖-D-2-脫氧核糖O核糖 + H +糠醛甲基間苯二酚FeCl3綠色產物脫氧核糖 + H+ -羥基-酮戊醛二苯胺藍色產物RNA和DNA定性、定量測定核酸化學主題醫學知識6（一）核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2C（二）嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHH

4、HH123456789嘌呤NH2腺嘌呤 adenine（A）NNNNHHHHOH2N鳥嘌呤 guanine（G）核酸化學主題醫學知識7（二）嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHHHH1234NNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶 Cytosine（C）尿嘧啶 uracil（U）NNHHHHOOHHNNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶 thymine（T）核酸化學主題醫學知識8NNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶 CNNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式稀有堿基：除五種基本的堿基外，核酸中還有些含量甚少的堿基，稱為稀有堿基。很多稀有堿基是甲基化

5、堿基。一些稀有堿基的結構式如下：核酸化學主題醫學知識9NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式稀有堿基：（三）核苷 戊糖和堿基縮合而成的糖苷稱為核苷(nucleoside)。戊糖和堿基之間的連接是戊糖的第一位碳原子(C-1)與嘧啶堿的第一位氮原子(N-1)或嘌呤堿的第九位氮原子(N-9)相連接，戊糖和堿基之間的連接鍵是N-C鍵，故生成的化學鍵稱為，N-糖苷鍵。應用X射線衍射法證明，核苷中的堿基與糖環平面互相垂直。根據核苷中所含戊糖不同，將核苷分為核糖核苷和脫氧核糖核苷兩類。OHOH2COHOHOH12345核 糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷(1,N1-糖苷鍵) 核酸化學主題醫學知識1

6、0（三）核苷 戊糖和堿基縮合而成的糖苷稱為核苷(nu天然核苷：一般為反式構象核酸化學主題醫學知識11天然核苷：一般為反式構象核酸化學主題醫學知識11修飾核苷（modified nucleoside）： 也稱稀有核苷（minor nucleoside） 修飾核苷包括三種情況:（1）由修飾堿基和糖組成的核苷核酸化學主題醫學知識12修飾核苷（modified nucleoside）： 修飾核OHOH2COHOH12345核 糖NCOONHHH51OH假尿苷（）（2）由非修飾堿基和2-O-甲基 核糖組成的核苷 （3）由堿基與糖連接方式特殊的核苷 核酸化學主題醫學知識13OHOH2COHOH12345核

7、 糖NCOONHRNA中主要的核糖核苷有四種：腺嘌呤核苷(adenosine，A)、鳥嘌呤核苷(guanosine，G)、胞嘧啶核苷(cytidine，C)和尿嘧啶核苷(uridine，U)。其結構式如下： A G C U 腺苷 鳥苷 胞苷 尿苷核酸化學主題醫學知識14RNA中主要的核糖核苷有四種：腺嘌呤核苷(adenosine DNA中主要的脫氧核糖核苷也有四種：腺嘌呤脫氧核苷(deoxyadenosine，dA)、鳥嘌呤脫氧核苷(deoxyguanosine，dG)、胞嘧啶脫氧核苷(deoxycytidine，dC)、胸腺嘧啶脫氧核苷(deoxythymidine，dT) 。其結構式 如下

8、： (A) (G) (C) (T)核酸化學主題醫學知識15 DNA中主要的脫氧核糖核苷也有四種：腺嘌呤(四) 核苷酸 核苷中戊糖的羥基磷酸酯化，就形成核苷酸。即核苷酸是核苷的磷酸酯。根據核苷酸中的戊糖不同，核苷酸可分為兩大類：核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。由于核糖中有三個游離的羥基(2、3和5)，因此核糖核苷酸有2-核苷酸、3-核苷酸和5-核苷酸三種。而脫氧核糖只有3和5兩個游離羥基可被酯化，因此只有3-脫氧核苷酸和5-脫氧核苷酸兩種。自然界存在的游離核苷酸為5-核苷酸，一般其代號可略5。核酸化學主題醫學知識16(四) 核苷酸 核苷中戊糖的羥基磷酸酯化，就(2-AMP)(3-AMP)(5-AMP

9、)Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP)Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP)核酸化學主題醫學知識17(2-AMP)(3-AMP)(5-AMP)Deoxya核酸化學主題醫學知識18核酸化學主題醫學知識18三、核苷酸的性質 (一) 一般性狀 核者酸為無色粉末或結晶，易溶于水，不溶于有機溶劑。由于戊糖含有不對稱碳原子，因此核苷酸溶液具有旋光性。 (二) 紫外吸收 由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，因此堿基、核苷和核苷酸在240290nm波段有吸收峰，其最大吸收值在260nm附近，不同的核苷酸有不同的吸收特性。因此，可

10、以用紫外分光光度法對核苷酸作定性和定量測定。 1核苷酸的定量測定 精確稱取核苷酸若干毫克，用0.01mol/L鹽酸定容至一定體積，在波長260nm下測定樣品的吸收度，根據核苷酸的摩爾吸收系數可以計算出樣品中核苷酸的百分含量。計算公式為： 核酸化學主題醫學知識19三、核苷酸的性質 (一) 一般性狀 核者酸為無色式中 A260 所測樣品的吸收度； M 所測核苷酸的分子量； E260所測核苷酸的摩爾吸收系數； C 所測核苷酸的樣品濃度(mgm1)。核酸化學主題醫學知識20式中 A260 所測樣品的吸收度；核酸化學主題醫學知識22核苷酸的定性鑒定 由于不同的核苷酸有其獨特的紫外吸收曲線，因此，選定某兩

11、個波長的吸收值之比，可以用作鑒定不同核苷酸的指標。其標準比值見表。由于溶液的pH會影響核苷酸的解離狀態，因而影響其紫外吸收特性，所以測定時要嚴格控制溶液的pH值。250/260 280/260 290/2602.07.02.07.02.07.05-CMP0.460.842.100.991.550.305-AMP0.850.800.220.150.030.0035-UMP0.740.730.380.400.030.035-GMP1.221.150.680.680.400.28光密度 比值pH核苷酸核酸化學主題醫學知識212核苷酸的定性鑒定 由于不同的核苷酸有其獨(三) 核苷酸的互變異構作用 堿基

12、上帶有酮基的核苷酸能轉化為烯醇式。在溶液中，酮式和烯醇式兩種互變異構體常同時存在，處于平衡態。在生物體內，核酸結構中的核苷酸主要是酮式。核酸化學主題醫學知識22(三) 核苷酸的互變異構作用 堿基上帶有酮基的核酸化學主題醫學知識23核酸化學主題醫學知識23(四)核苷酸的兩性解離和等電點 核苷酸中含有磷酸基，使核苷酸具有較強的酸性。在核苷酸中，兩個磷酸基解離常數分別為pK10.71.6，pK25.96.5。 由于核苷酸含有堿基和磷酸基，因此，核苷酸為兩性電解質，它們在不同pH值的溶液中解離程度不同，在一定條件下可形成兼性離子。當處在等電點時，腺苷酸、鳥苷酸、胞苷酸主要是兼性離子存在。尿苷酸的堿基堿

13、性極弱，測不出含氮環的解離曲線。所以不能形成兼性離子。核酸化學主題醫學知識24(四)核苷酸的兩性解離和等電點 核苷酸中含有磷胞嘧啶核苷酸的解離: 核酸化學主題醫學知識25胞嘧啶核苷酸的解離: 核酸化學主題醫學知識25可在pH2.05.0之間分離各種核苷酸 pH3.5時各核苷酸所帶電荷 核苷酸 磷酸基電荷 堿基的電荷 凈電荷 AMP-1+0.54-0.46GMP-1+0.05-0.95CMP-1+0.84-0.16UMP-1+0-1核酸化學主題醫學知識26可在pH2.05.0之間分離各種核苷酸 pH3.5時各核苷四、生物體內重要的核苷酸衍生物(一) 5-二磷酸核苷類和5-三磷酸核苷類 5-核苷酸

14、又可按其在5位縮合的磷酸基的多少，分為一磷酸核苷（核苷酸）、二磷酸核苷和三磷酸核苷。 OHOH2COHOHOH12345核 糖NNNNHNHH9腺嘌呤胸 苷PO-OO腺苷-5-磷酸AMPOP O-OOADPATPP O-OO核酸化學主題醫學知識27四、生物體內重要的核苷酸衍生物(一) 5-二磷酸核苷類和5 各種核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸是體內合成RNA和DNA合成的直接原料。在體內能量代謝中的作用：ATP能量“貨幣”UTP參加糖的互相轉化與合成CTP參加磷脂的合成GTP參加蛋白質和嘌呤的合成第二信使cAMP 核苷三磷酸化合物在生物體內的能量代謝中起著重要的作用。體內物質氧化時所產生的能量一般不

15、能直接用于生理活動，但釋放出來的能量可供ADP磷酸化形成ATP。因此體內物質氧化所放出的能量先儲存于ATP中，當體內需要能量時，ATP水解釋放出能量以滿足生理活動的需要。可見，ATP在生物體內化學能的儲存和利用中起著關鍵的作用。核酸化學主題醫學知識28 各種核苷三磷酸和脫氧核苷三磷酸是體內合成R核酸化學主題醫學知識29核酸化學主題醫學知識29 ATP的磷酸酯鍵顯示出高的水解性能，可以從它的特殊化學結構來解釋。a靜電效應：在生理pH(7.35)條件下，ATP的磷酸根中4個可離解質子全部離解，因此共帶有4個負電荷。這些負電荷之間靜電排斥作用使磷酸酯鍵處于高勢能狀態。b共振穩定因素：ATP離解成AD

16、P和磷酸或AMP和焦磷酸以后，共振穩定性大大增加。核酸化學主題醫學知識30 ATP的磷酸酯鍵顯示出高的水解性能，可以從核苷酸的命名及縮寫符號脫氧堿基磷酸基數目磷酸dAMPGDTTCU核酸化學主題醫學知識31核苷酸的命名及縮寫符號脫氧堿基磷酸基數目磷酸dAMPGDTT(二) 環化核苷酸 環化核苷酸如環化腺苷酸和環化鳥苷酸普遍存在于動植物和微生物細胞中。它們的結構式如下：環一磷酸腺苷 環一磷酸鳥苷 環化核苷酸有重要的生理功能，它們參與調節細胞生理生化過程而控制生物的生長、分化和細胞對激素的效應。核酸化學主題醫學知識32(二) 環化核苷酸 環化核苷酸如環化腺苷酸和第二節 核酸的結構一、 DNA的結構

17、 (一) DNA的堿基組成 (二) DNA的一級結構(三)DNA的二級結構 (四) DNA的三級結構二、 RNA的結構 (一) RNA的類型 (二) RNA的堿基組成(三) RNA的一級結構 (四) RNA的構象三、核酸中核苷酸順序的測定 (一) RNA的核苷酸順序測定(二) DNA的核苷酸順序測定核酸化學主題醫學知識33第二節 核酸的結構一、 DNA的結構 一、DNA的結構(一) DNA的堿基組成 DNA由四種主要的堿基(腺嘌呤、 鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)組成。此外，還含有少量稀有堿基。應用紙層析和紫外分光光度法對多種生物DNA的堿基組成進行定量測定，總結出如下規律：(1)所有DNA中腺嘌

18、呤和胸腺嘧啶的摩爾含量相等，即AT；鳥嘌呤和胞嘧啶(包括5-甲基胞嘧啶)的摩爾含量相等，即GC。因此，嘌呤總數等于嘧啶總數，即A+GC+T。 (2)DNA的堿基組成具有種屬特異性，即不同生物的DNA具有自己獨特的堿基組成。 (3)DNA的堿基組成沒有組織特異性，即同生物體的不同器官、不同組織的DNA具有相同的堿基組成。 所有DNA中AT，GC這一規律的發現，為DNA雙螺旋結構模型的建立提供了重要的根據。核酸化學主題醫學知識34一、DNA的結構(一) DNA的堿基組成 DNA由四種(二) DNA的一級結構(Primary structure) DNA的一級結構是指DNA分子中核苷酸排列的順序。由

19、于核苷酸間的差異主要是堿基不同，也稱堿基序列。實驗表明，核酸中一分子核苷酸的3-位羥基與另一分子核苷酸的5-位磷酸基通過脫水可形成3,5-磷酸二酯鍵，從而將兩分子核苷酸連接起來。因此在DNA鏈中，除了第一個和最后一個核苷酸外，所有核苷酸的3，5-羥基都參與磷酸二酯鍵。第一個核苷酸的5-磷酸基不連到別的核苷酸上，而最后一個核苷酸則有一個自由的3-羥基。所以DNA鏈有方向性或極性，它有5端和3端。DNA是由數量極其龐大的四種脫氧核糖核苷酸，通過3，5-磷酸二酯鍵彼此連接起來的直線形或環形分子，DNA沒有側鏈。DNA中有4種類型的核苷酸，有n個核苷酸組成的DNA鏈中可能有的不同序列總數為4n。下圖表

20、示DNA多核苷酸鏈的一個小片段。核酸化學主題醫學知識35(二) DNA的一級結構(Primary structureHO-O OCH2 TO=PO-35OHHO-O OCH2 GO=PO-35OHO OCH2OHH AO=POO-35351PPPOHATGd-pGpTpAOHd-pG-T-Ad-pGTA核酸化學主題醫學知識36HO-O OCH2 TO=PO-35OHHO-O 核酸化學主題醫學知識37核酸化學主題醫學知識37寫出二核苷酸d-ApTp的結構核酸化學主題醫學知識38寫出二核苷酸d-ApTp的結構核酸化學主題醫學知識38(三)DNA的二級結構 1953年，J. Watson和F. Cr

21、ick 在前人研究工作的基礎上，根據DNA結晶的X-衍射圖譜和分子模型，提出了著名的DNA雙螺旋結構模型，并對模型的生物學意義作出了科學的解釋和預測。 DNA二級結構的WatsonCrick模型 B-型DNA 雙螺旋結構模型的要點： (1)DNA分子由兩條脫氧多核苷酸鏈構成，兩條鏈都是右手螺旋，這兩條鏈反向平行(即一條為5-3，另一條為3-5)，圍繞同一個中心軸構成雙螺旋結構，鏈之間的螺旋形成一條大溝和一條小溝。 (2)磷酸基和脫氧核糖在外側，彼此之間通過磷酸二酯鍵相連接，形成DNA的骨架。堿基連接在糖環的內側。糖環平面與堿基平面相互垂直。(3)雙螺旋的直徑為2nm。順軸方向，每隔0.34nm

22、有一個核苷酸，兩個相鄰核苷酸之間的夾角為36。每一圈雙螺旋有10對核苷酸，每圈高度為34nm。核酸化學主題醫學知識39(三)DNA的二級結構核酸化學主題醫學知識39(4)兩條鏈由堿基間的氫鍵相連，而且堿基間形成氫鍵有一定規律：腺嘌呤與胸腺嘧啶成對，鳥嘌呤與胞嘧啶成對。A和T間形成兩個氫鍵，G和C間形成三個氫鍵。這種堿基之間互相配對稱為堿基互補。 (5)沿螺旋軸方向觀察，配對的堿基并不充滿雙螺旋的全部空間。由于堿基對的方向性，使得堿基對占據的空間不對稱，因此在雙螺旋的表面形成大溝和小溝。雙螺旋表面的溝對DNA和蛋白質相互識別是很重要的。核酸化學主題醫學知識40(4)兩條鏈由堿基間的氫鍵相連，而且

23、堿基間形成氫鍵有一定規律B型DNA雙螺旋結構模式圖核酸化學主題醫學知識41B型DNA雙螺旋結構模式圖核酸化學主題醫學知識41堿基配對及氫鍵形成核酸化學主題醫學知識42堿基配對及氫鍵形成核酸化學主題醫學知識42DNA雙螺旋結構的穩定因素： DNA雙螺旋結構是很穩定的。主要有三種作用力使DNA雙螺旋結構維持穩定。一種作用力是互補堿基之間的氫鍵，但氫鍵并不是DNA雙螺旋結構穩定的主要作用力，因為氫鍵的能量很小。DNA分子中堿基的堆集可以使堿基締合，這種力稱為堿基堆集力，是使DNA雙螺旋結構穩定的主要作用力。堿基堆集力是由于雜環堿基的電子之間相互作用所引起的。DNA分子中堿基層層堆集，在DNA分子內部

24、形成一個疏水核心。疏水核心內幾乎沒有游離的水分子，這有利于互補堿基間形成氫鍵。第三種使DNA分子穩定的力是磷酸基的負電荷與介質中的陽離子的正電荷之間形成的離子鍵。它可以減少DNA分子雙鏈間的靜電斥力，因而對DNA雙螺旋結構也有一定的穩定作用。核酸化學主題醫學知識43DNA雙螺旋結構的穩定因素：核酸化學主題醫學知識43DNA雙螺旋的種類: 目前已知DNA雙螺旋結構可分為A、B、C、D及Z型等數種，除Z型為左手雙螺旋外，其余均為右手雙螺旋。 外形堿基距離直徑nm螺旋方向螺距nm堿基數目螺旋表面A型短粗0.232.55右手2.4611大小溝B型適中0.342.00右手3.4010.4大小溝Z-DNA

25、細長0.381.84左手4.5612小溝深核酸化學主題醫學知識44DNA雙螺旋的種類: 目前已知DNA雙螺旋結構可分為A、B、核酸化學主題醫學知識45核酸化學主題醫學知識45(四) DNA的三級結構 DNA的二級結構指雙螺旋結構。雙螺旋鏈的扭曲或再次螺旋就構成了DNA的三級結構。超螺旋是DNA三級結構的一種形式。超螺旋螺旋核酸化學主題醫學知識46(四) DNA的三級結構 DNA的二級結構指 大部分原核生物的DNA是共價封閉的環狀雙螺旋，這種雙螺旋還可以再次螺旋化形成超螺旋(superhelix 或supercoil) 。當引進的張力與原先右手螺旋的方向相同時，超螺旋的方向是左手的，稱為正超螺旋

26、（變緊）(positive supercoil)；引進張力與原先右手螺旋方向相反時，超螺旋的方向是右手的，稱為負超螺旋（變松）(negative supercoil)。正超螺旋是旋緊雙螺旋后形成的，負超螺旋是放松雙螺旋后形成的。 DNA超螺旋結構形成的重要意義: 使DNA形成高度致密狀態從而得以裝入核中； 推動DNA結構的轉化以滿足功能上的需要。如負超螺旋分子所受張力會引起互補鏈分開導致局部變性，利于復制和轉錄。核酸化學主題醫學知識47 大部分原核生物的DNA是共價封閉的環狀雙螺旋松弛環形115201052315101520251510152023右手旋轉擰松兩匝后的線形DNA解鏈環形1510

27、152023負超螺旋12148231613核酸化學主題醫學知識48松弛環形11520105231510152025151015部分解鏈超螺旋松弛型核酸化學主題醫學知識49部分解鏈超螺旋松弛型核酸化學主題醫學知識49絕大多數原核生物的DNA都是共價封閉的環狀雙螺旋。如果再進一步盤繞則形成麻花狀的超螺旋結構。 原核生物DNA的高級結構：核酸化學主題醫學知識50絕大多數原核生物的DNA都是共價封閉的環狀雙螺旋。如果再進一DNA在真核生物細胞核內的組裝：生物體內的核酸通常都與蛋白質結合形成復合物，以核蛋白（nucleoprotein）的形式存在。DNA分子十分巨大，與蛋白質結合后被組裝到有限的空間中。

28、在真核生物中，雙螺旋的DNA分子圍繞一蛋白質八聚體進行盤繞，從而形成特殊的串珠狀結構，稱為核小體(nucleosome)。核小體結構屬于DNA的高級結構。核酸化學主題醫學知識51DNA在真核生物細胞核內的組裝：生物體內的核酸通常都與蛋白質DNA的功能DNA的基本功能是作為遺傳信息的載體，為生物遺傳信息復制以及基因信息的轉錄提供模板。DNA分子中具有特定生物學功能的片段稱為基因(gene)。一個生物體的全部DNA序列稱為基因組(genome)。基因組的大小與生物的復雜性有關，如病毒SV40的基因組大小為5.1103bp，大腸桿菌為5.7106bp，人為3.2109bp。核酸化學主題醫學知識52D

29、NA的功能DNA的基本功能是作為遺傳信息的載體，為生物遺傳二、RNA的結構 (一) RNA的類型 根據結構、功能不同，動物、植物和微生物細胞的RNA主要有三類：核蛋白體RNA(rRNA)，轉運RNA(tRNA)，信使RNA(mRNA)。 1核蛋白體RNA ( rRNA) 核蛋白體RNA是細胞中主要的一類RNA，rRNA占細胞中全部RNA的80左右，是一類代謝穩定、分子量最大的RNA，存在于核蛋白體內。核蛋白體(ribosome)又稱為核糖體或核糖核蛋白體。它是細胞內蛋白質生物合成的場所。核蛋白體由兩個亞基組成，一個稱為大亞基，另一個稱為小亞基，兩個亞基都含有rRNA和蛋白質，但其種類和數量卻不

30、相同。 核酸化學主題醫學知識53二、RNA的結構 (一) RNA的類型 核酸化學主2轉運RNA(tRNA) 轉運RNA是細胞中一類最小的RNA，tRNA一般由7393個核苷酸構成，分子量2300028000 ，但含有稀有堿基最多的RNA，其稀有堿基的含量可多達20%。 tRNA約占細胞中RNA總量的15。在蛋白質生物合成中tRNA起攜帶氨基酸的作用。細胞內tRNA的種類很多，每一種氨基酸都有與其相對應的一種或幾種tRNA。 3信使RNA mRNA在細胞中含量很少，占RNA總量的35。mRNA在代謝上很不穩定，它是合成蛋白質的模板，每種多肽鏈都由一種特定的mRNA負責編碼。因此，細胞內mRNA的

31、種類很多。mRNA的分子量極不均一，其沉降系數在425S間，mRNA的平均分子量約500000。 核酸化學主題醫學知識542轉運RNA(tRNA) 轉運RNA是 除上述三類RNA以外，細胞內還有一些其他類型的RNA，如細胞核內的不均一核RNA(HnRNA)、小分子核RNA(LnRNA)和染色質RNA(ChRNA)等。核蛋白體RNA信使RNA轉運RNA核內不均一RNA核內小RNA胞漿小RNA 細胞核和胞液線粒體功能rRNAmRNA mtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白體組分蛋白質合成模板轉運氨基酸成熟mRNA的前體參與hn

32、RNA的剪接、轉運rRNA的加工、修飾蛋白質內質網定位合成的信號識別體的組分核仁小RNA核蛋白體RNA信使RNA轉運RNA核內不均一RNA核內小RNA胞漿小RNA 細胞核和胞液線粒體功能rRNAmRNA mtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白體組分蛋白質合成模板轉運氨基酸成熟mRNA的前體參與hnRNA的剪接、轉運rRNA的加工、修飾蛋白質內質網定位合成的信號識別體的組分核仁小RNARNA的種類、分布與功能核酸化學主題醫學知識55 除上述三類RNA以外，細胞內還有一些其他類型的(二) RNA的堿基組成 RNA中含有腺嘌呤、

33、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶四種基本堿基。此外，目前已發現RNA中有60多種稀有堿基。(三) RNA的一級結構 RNA分子由許多核苷酸構成，實驗證明，核苷酸之間也是通過磷酸二酯鍵連接，一個核苷酸C5的磷酸基與相鄰的核苷酸的C3的羥基結合成3，5-磷酸二酯鍵。下圖所示為RNA分子中多核苷酸鏈的一小片段。 RNA分子的一級結構就是指多核苷酸鏈中核苷酸的排列順序。核酸化學主題醫學知識56(二) RNA的堿基組成 RNA中含有腺嘌圖 RNA分子中多核苷酸鏈的小片段pApGpCp核酸化學主題醫學知識57圖 RNA分子中多核苷酸鏈的小片段pApGpCp核酸化學主(四) RNA的構象 根據RNA的某些理化性質和X

34、射線衍射分析證明大多數天然RNA分子是單鏈。多核苷酸鏈可以發生自身回折，使可以配對的一些堿基相遇，堿基按一定規律，A與U之間形成氫鍵，G與C之間也可以形成氫鍵連接起來，構成雙螺旋區；不能配對的堿基則形成環狀突起，這種構象就是RNA的二級結構。RNA中的雙螺旋結構為A-DNA類型的結構。每一段螺旋區至少需要有46對堿基才能保持穩定。不同的RNA分子，雙螺旋區所占比例不同，如rRNA中雙螺旋區占40左右，tRNA中占50左右，煙草花葉病毒RNA中占60左右。核酸化學主題醫學知識58(四) RNA的構象 根據RNA的某些理化性質核酸化學主題醫學知識59核酸化學主題醫學知識591. tRNA的二級結構

35、tRNA的二級結構由于局部雙螺旋的形成而呈現“三葉草”形，故稱為“三葉草”結構。tRNA的“三葉草”形結構包括： 1.四臂四環；2.氨基酸臂； 3.D環上有二氫尿嘧啶（ DHU臂） ； 4.反密碼環上的反密碼子與mRNA相互作用(反密碼臂)； 5.可變環上的核苷酸數目可以變動(可變臂)和6. TC臂五部分。核酸化學主題醫學知識601. tRNA的二級結構tRNA的二級結構由于局部雙螺旋的形攜帶氨基酸辨認并結合氨基酰tRNA合成酶識別mRNA上的密碼識別并結合核蛋白體氨基酸臂DHU臂反密碼臂可變臂TC臂核酸化學主題醫學知識61攜帶氨基酸辨認并結合氨基酰tRNA合成酶識別mRNA上的密碼（1）氨基

36、酸臂或氨基酸莖，由3-端和5-端堿基組成7對互補堿基對的雙螺旋區，富含鳥嘌呤，末端為CpCpA-OH，接受活化的氨基酸。（2）二氫尿嘧啶環，由812個核苷酸組成，含有二氫尿嘧啶。由34對堿基組成的雙螺旋區與tRNA其余部分相連，這個雙螺旋區叫二氫尿嘧啶臂（莖）。（3）反密碼子環，由 7個核苷酸組成，環中部由 3個堿基組成反密碼子，反密碼子在蛋白質（肽）合成中能與rnRNA上的密碼子配對。次黃嘌呤常出現于此環中。5對堿基組成的雙螺旋區叫反密碼子臂（莖），反密碼子環由此莖與tRNA分子的其他部分相連。（4）額外環，又叫可變環（或叉），由318個核苷酸組成，是tRNA分類的重要指標。（5）假尿嘧啶核

37、苷-胸腺嘧啶核糖核苷環，即TC環，由7個核苷酸組成。有5對堿基組成的雙螺旋區叫TC臂，由此臂與tRNA的其它部分連接。核酸化學主題醫學知識62（1）氨基酸臂或氨基酸莖，由3-端和5-端堿基組成7對互2. tRNA的三級結構： tRNA的三級結構的形狀像一個倒寫的L字母。它是在二級結構三葉草形的基礎上進一步扭曲、折疊而成的。核酸化學主題醫學知識632. tRNA的三級結構： tRNA的三級結構3. rRNA的結構在原核生物中，rRNA有三種：5S，16S，23S。其中，16S的rRNA參與構成核蛋白體的小亞基，而5S和23S的rRNA參與構成核蛋白體大亞基。在真核生物中，rRNA有四種：5S，5

38、.8S，18S，28S。其中，18S的rRNA參與構成核蛋白體小亞基，其余的rRNA參與構成核蛋白體大亞基。核酸化學主題醫學知識643. rRNA的結構在原核生物中，rRNA有三種：5S，165sRNA的二級結構核酸化學主題醫學知識655sRNA的二級結構核酸化學主題醫學知識654. mRNA的結構與功能mRNA可形成局部雙螺旋結構的二級結構。（1）原核細胞mRNA是多順反子，即可以編碼多條多肽鏈；真核細胞的mRNA為單順反子。（2）絕大多數真核細胞的mRNA的3-末端具有一段多聚腺苷酸（poly(A)），而且不同真核細胞的mRNA的3-末端的poly(A)長短不同。而原核細胞的mRNA一般沒

39、有poly(A)。（3）真核細胞mRNA 5-末端有一個特殊的5-“帽子”結構。“帽子”結構和3-末端的poly(A)都有抗核酸外切酶的作用。原核生物mRNA一般沒有“帽于”結構。（4）真核細胞5-“帽子”結構的下游和3-poly(A)的上游分別為5-端不編碼區和3-端不編碼區，二者之間是其編碼區。已知5-端不編碼區和“帽子”結構是與核糖體結合的區域，與蛋白質合成的起始有關。至于3-端不編碼的功能，目前仍不清楚。原核細胞由于沒有“帽子”結構，不編碼區位于mRNA的兩端。核酸化學主題醫學知識664. mRNA的結構與功能mRNA可形成局部雙螺旋結構的二級原核與真核細胞的mRNA在結構上的差異順反

40、子順反子順反子插入順序插入順序先導區末端順序53 原核細胞mRNA的結構特點核酸化學主題醫學知識67原核與真核細胞的mRNA在結構上的差異順反子順反子順反子插入AAAAAAA-OH5 “帽子”PolyA 3 順反子m7G-5ppp-N-3 p 真核細胞mRNA的結構特點原核與真核細胞的mRNA在結構上的差異核酸化學主題醫學知識68AAAAAAA-OH5 “帽子”PolyA 3 順反子m真核生物mRNA 5-端帽子結構55m7GTP核酸化學主題醫學知識69真核生物mRNA 5-端帽子結構55m7GTP核酸化學mRNA分子中帶有遺傳密碼，其功能是為蛋白質的合成提供模板(templet)。mRNA分

41、子中每三個相鄰的核苷酸組成一組，在蛋白質翻譯合成時代表一個特定的氨基酸，這種核苷酸三聯體稱為遺傳密碼（coden)。某些小分子RNA具有催化特定RNA降解的活性，這種具有催化作用的小RNA被稱為核酶(ribozyme)。核酶通常具有特殊的分子結構，如錘頭結構。核酸化學主題醫學知識70mRNA分子中帶有遺傳密碼，其功能是為蛋白質的合成提供模板(三、核酸中核苷酸順序的測定(一) RNA的核苷酸順序測定 RNA一級結構的研究借鑒了蛋白質一級結構的研究方法，即片段重疊法。片段重迭法的一般步驟是：(1)對RNA分子進行末端測定，分析兩個末端堿基；(2)用特異核酸工具酶將RNA分子降解成小片段；(3)分離

42、酶解產生的各小片段；(4)分析各小片段核苷酸的含量、組成和排列順序；(5)把兩種以上不同特異酶水解的結果，運用重迭法的原理拼合成整個RNA分子的核苷酸排列順序。核酸化學主題醫學知識71三、核酸中核苷酸順序的測定(一) RNA的核苷酸順序測定核1. 末端分析 目前一般用同位素標記法來測定5末端和3末端核苷酸。如用-32P-ATP，以多核苷酸激酶催化，使RNA分子或片段的5-OH標記32P，然后經酶解或堿水解，鑒定帶有放射性的核苷酸或核苷二磷酸即為5末端。 2酶解產物的分離 現采用的分離方法有尿素柱層析法、雙向電泳法等。(1)尿素柱層析法 在7mol/L尿素存在下，進行DEAE-纖維素或DEAE-

43、葡聚糖凝膠柱層析，用含7molL尿素的0.1mol/L三乙胺乙酸鹽緩沖液線性梯度洗脫，即可把RNA的酶解產物寡核苷酸混合物分開。中性尿素柱層析法可以按鏈長把10個核苷酸殘基以下的寡核苷酸分開。酸性尿素柱層析則可以把相同鏈長、不同組成的各種寡核苷酸分開。核酸化學主題醫學知識721. 末端分析 目前一般用同位素標記法來測定(2)雙向電泳法 Sanger建立雙向電泳法分離放射性32P標記的RNA酶解產物，該法簡便易行，已廣泛用于RNA一級結構的測定，特別是小分子RNA的測定。此法能分離的最長片段為612個核苷酸。 (3) 凝膠電泳法 聚丙烯酰胺凝膠電泳用于RNA部分酶解產物(大片段)的分離。該法可按

44、鏈長將各核甘酸片段分開。根據產物長度不同，可選用不同濃度比例的丙烯酰胺。如果條件選得適宜，對于200個核苷酸以下的片段甚至相差一個核苷酸也能分開。核酸化學主題醫學知識73(2)雙向電泳法 Sanger建立雙向電泳法分3.核苷酸順序測定方法 用上述方法將RNA酶解產物分離后，須對每個片段作核苷酸順序測定，常用以下幾種方法。 (1) 自末端按序降解法 含有鄰位羥基的寡核苷酸片段可被過碘酸氧化成雙醛化合物。與苯胺反應除去末端核苷酸殘基，從而鑒定游離出來的堿基，即3末端堿基。 從理論上講，過碘酸氧化法可以從RNA的3末端開始逐個測定到RNA的5末端，但實際上由于每次反應不可能達到100完全多次循環的誤

45、差就越來越大。目前文獻報道最多是29次循環。核酸化學主題醫學知識743.核苷酸順序測定方法 用上述方法將RNA酶解核酸化學主題醫學知識75核酸化學主題醫學知識75苯 胺+N1核酸化學主題醫學知識76苯 胺+N1核酸化學主題醫學知識76(2) 核酸外切酶部分降解法 生物體內存在著多種核酸水解酶(nuclease)。這些酶可以水解多聚核苷酸的磷酸二酯鍵。核酸水解酶一般可分為RNA水解酶(RNases)和DNA水解酶(DNases)。核酸水解酶還可以根據其水解核酸方式分為兩類：核酸外切酶：能夠從多聚核苷酸鏈的一端(3-端或5-端) 開始，逐步將核 酸水解下來。 核苷酸內切酶：能夠水解多聚核苷酸鏈中某

46、種核苷酸形成的磷酸酯鍵。 如用蛇毒磷酸二酯酶(VPDase)等外切酶進行部分降解，即以限制酶量、降低溫度和控制作用時間來使RNA片段部分降解。由于條件不同而產生一系列不同長度的寡核苷酸片段的混合物，用凝膠電泳法將這些混合物分離后即可知其排列順序。現將下列八核苷酸用VPDase不完全水解，可得8種組分的混合物：核酸化學主題醫學知識77(2) 核酸外切酶部分降解法 生物體內存在著 pAGCUGACU pAGCUGAC pAGCUGA pAGCUGACU pAGCUG pAGC pAG pA 將上述各片段的混合物分離后測定每一片段的3末端，即可排出該片段的全部核苷酸順序。部分水解VPDase核酸化學

47、主題醫學知識78 (二) DNA的核苷酸順序測定 按制備DNA片段的方法不同，可以把測定DNA的核苷酸順序的方法分為酶法和化學法。1. MaxamGilbert堿基順序分析法 1975年，Maxam A和GilbertW發展了一種核酸堿基順序快速分析方法。這種方法的基本原理是應用有機化學方法，選擇性地切斷某種特定核苷酸(A，G，C，T)所形成的磷酸酯鍵。所以此法又稱為化學降解法。 (1)嘌呤堿殘基的選擇性水解： 核酸中的嘌呤堿基和嘧啶堿基可以與硫酸二甲酯作用，但反應條件及甲基化產物的性質不同。在溫和的條件下，用硫酸二甲酯處理DNA，分別得到兩種嘌呤堿基的甲基化產物：N-3-甲基腺嘌呤核苷和N-

48、7-甲基鳥嘌吟核苷。核酸化學主題醫學知識79(二) DNA的核苷酸順序測定 按制備DNA片核酸化學主題醫學知識80核酸化學主題醫學知識80 不同堿基的甲基化產物對于水解去嘌呤堿基反應敏感程度有明顯差別。脫去了嘌呤堿基的核糖磷酸酯鍵，在0.1 molLNaOH堿性條件下可以被水解切斷。在此條件下，其余的磷酸酯鍵不受影響。核酸化學主題醫學知識81 不同堿基的甲基化產物對于水解去嘌呤堿基反應敏核酸化學主題醫學知識82核酸化學主題醫學知識82(2)嘧啶堿殘基的選擇性水解： DNA鏈用肼處理，其中的嘧啶堿殘基被脫去，生成核糖腙衍生物，再在哌啶存在下水解，核糖腙3位的磷酸酯鍵則被水解斷裂。核酸化學主題醫學

49、知識83(2)嘧啶堿殘基的選擇性水解： DNA核酸化學主題醫學知識84核酸化學主題醫學知識84 根據上面反應原理，可以在不同反應條件下，選擇性地切斷分別由四種不同的核苷酸形成的磷酸酯鍵。 注意：不論嘌呤堿基或嘧啶堿基，在選擇性水解后，在水解位點上的含氮堿基都消失了。 例如一個多聚核苷酸鏈5-ATTGACTTAGCC，在一定條件下，在G處切斷，則有以下幾種情況可能發生： 由此可見，一共可以得到6種不同的多聚核苷酸片斷(包括一條原來的DNA鏈)。它們可以用凝膠電泳方法分離，多聚核苷酸片斷的長度與它在凝膠電泳中移動的速率成反比。如下圖。核酸化學主題醫學知識85 根據上面反應原理，可以在不同反應條件下

50、，選擇 (a)用染色法檢測得到全部的DNA片斷電泳圖譜， (b)用放射性同位素標記法檢測到的DNA片斷電泳圖譜(*)核酸化學主題醫學知識86 (a)用染色法檢測得到全部的DNA片斷電泳圖譜， 2Sanger堿基順序分析法 1976年，Sanger F發展了一種新的核酸堿基順序分析法。Sanger法的基本原理是將待測定的DNA單鏈作為DNA復制的模板，在DNA聚合酶(一種催化DNA合成的酶)催化下，在有四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)和四種脫二氧核苷三磷酸(ddNTP)參與下，合成出各種長度的DNA片斷，再進行凝膠電泳和放射性顯影，從圖譜上直接讀出待測DNA的互補堿基順序。由于此法的關鍵是利用脫二

51、氧核苷三磷酸終止DNA鏈的增長而實現的，所以又稱為鏈終止法。核酸化學主題醫學知識872Sanger堿基順序分析法 1976年CCGGTAGCAATT35模板引物GG53GGCGGCCGGCCATCCddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAddATPAGGCCATCGGGCCATCGTTGGddGTPGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTTddTTPCCATCGTTGA53核酸化學主題醫學知識88CCGGTAGCAATT35模板引物GG5核酸化學主題醫學知識89核酸化學主題醫學知識89第三節 核酸的理化性質一、核酸分子的大小 二、核酸的溶解度與粘度三、核酸的酸堿性質 四、核酸的紫

52、外吸收五、核酸的變性、復性和雜交核酸化學主題醫學知識90第三節 核酸的理化性質一、核酸分子的大小 二、核酸的一、核酸分子的大小 過去用苯酚和中性鹽法所制得的DNA樣品往往是部分降解了的產物。所以用它測得的DNA分子量(106107)往往偏低。現在采用電子顯微鏡照像和放射自顯影等技術測定DNA的分子量。RNA的分子量大約從幾百到幾百萬。二、核酸的溶解度與粘度 RNA和DNA都是極性比合物，部微溶于水，而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機溶劑。它們的鈉鹽比自由酸易于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達4。高分子溶液比普通溶液粘度要大得多，不規則線團分子比球形分子的粘度大，而線形分子的粘度更大。RNA的粘度比D

53、NA粘度小。當DNA溶液加熱，或在其他因素作用下；發生螺旋線團轉變時，粘度降低。所以可用粘度作為DNA變性的指標。核酸化學主題醫學知識91一、核酸分子的大小 過去用苯酚和中性鹽法所制得三、核酸的酸堿性質 可以把核酸看成是多元酸，多聚核苷酸鏈中含有兩類可離解的基團。多聚核苷酸鏈的離解性質與多肽鏈情況相似，能夠發生兩性離解，也有等電點。由于磷酸是一個中等強度的酸，而含氮堿基堿性很弱，因此核酸的等電點都在低pH值范圍內。DNA的等電點為4-4.5，RNA的等電點為2-2.5。DNA和RNA等電點相差較大這一特點，在DNA和RNA分離中具有重要意義。 DNA和RNA等電點相差較大的原因，很容易從它們的

54、結構特點來理解。RNA鏈中，核糖2-OH的氫原子能與磷酸酯中的羥基氧原子形成氫鍵，促進了磷酸酯羥基中氫原子的離解。核酸化學主題醫學知識92三、核酸的酸堿性質 可以把核酸看成是多元酸，多酸或堿水解：多聚核苷酸鏈在適當的條件下能被酸或堿水解成核苷酸。但是DNA和RNA對酸或堿的穩定性有很大的差別。例如，在室溫條件下，用01 moLL NaOH溶液即可將RNA完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。核酸化學主題醫學知識93酸或堿水解：多聚核苷酸鏈在適當的條件下能被酸或堿水解成核苷酸四、核酸的紫外吸收 核酸分子中的嘧啶和嘌呤環的共軛體系強烈吸收260-290nm波段的紫外光，一般在260nm左右有最

55、大吸收峰。蛋白質在280nm左右有最大吸收峰。紫外吸收光譜與分子中可解離基團的解離狀態、pH、光波波長等因素有關。利用核酸的紫外吸收特性，可以對核酸進行定量測定。上式中：A為吸收度，l為比色杯內徑的厚度(cm) ， E(P)為摩爾磷吸收系數。 核酸化學主題醫學知識94四、核酸的紫外吸收 核酸分子中的嘧啶和嘌呤 這樣，只要測定核酸溶液的磷含量和紫外吸收值，就可計算它的E(P)值。核酸在變性時，E(P)值顯著升高，此現象稱為增色效應。在一定條件下，變性核酸可復性，此時E(P)值又回復至原來水平，這種現象稱為減色效應。所以E(P)值可作為核酸復性的指標。核酸化學主題醫學知識95 這樣，只要測定核酸溶

56、液的磷含量和紫外吸收值，就五、核酸的變性、復性和雜交 (一) 變性 核酸分子具有一定的空間結構，維持這種空間結構的作用力主要是氫鍵和堿基堆積力。有些理化因素會破壞氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子的空間結構改變，從而引起核酸理化性質和生物學功能改變，這種現象稱為核酸的變性。核酸變性時，其雙螺旋結構解開，但并不涉及核苷酸間共價鍵的斷裂。因此變性作用并不引起孩酸分子量降低。多核苷酸鏈的磷酸二酯鍵的斷裂叫降解。伴隨核酸的降解，核酸分子量降低。 多種因素可引起核酸變性，如加熱、過高過低的pH、有機溶劑、酰胺和尿素等。加熱引起DNA的變性稱為熱變性。隨著DNA空間結構的改變，引起一系列性質變化，如粘度降低，某

57、些顏色反應增強，尤其是260nm紫外吸收增加，DNA變性后失去生物活性。核酸化學主題醫學知識96五、核酸的變性、復性和雜交 (一) 變性 核酸分子核酸化學主題醫學知識97核酸化學主題醫學知識97 DNA熱變性的過程不是一種“漸變”，而是一種“躍變”過程，就像固體的結晶物質在其融點時突然融化一樣。通常把E(P)值達到最高值的12時的溫度稱為“熔點”或熔解溫度，用符號Tm表示。DNA的Tm值一般在7085C之間。核酸化學主題醫學知識98 DNA熱變性的過程不是一種“漸變”，而是一種“影響Tm的因素：（1）G-C的相對含量越多，Tm值就越高。 （G+C）% =（Tm 69.3） 2.44（2）介質離

58、子強度低，Tm低。（3）高pH下堿基廣泛去質子而喪失形成氫鍵的能力。（4）變性劑如甲酰胺、尿素、甲醛等破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降。核酸化學主題醫學知識99影響Tm的因素：（1）G-C的相對含量越多，Tm值就越高。（(二) 復性將熱變性后的DNA溶液緩慢冷卻，在低于變性溫度約2530的條件下保溫一段時間（退火annealing），則變性的兩條單鏈DNA可以重新互補而形成原來的雙螺旋結構并恢復原有的性質。將變性DNA經退火處理，使其重新形成雙螺旋結構的過程，稱為DNA的復性。(三)核酸的雜交 在DNA復性過程中,雙鏈分子的再形成既可以發生在序列完全互補的核酸分子之間,也可以發生在堿基序列部

59、分互補的不同的DNA之間或DNA與RNA之間 ,這種現象稱為分子雜交。利用這一原理，在核酸研究中可引入特制的“探針”。核酸化學主題醫學知識100(二) 復性將熱變性后的DNA溶液緩慢冷卻，在低于變性溫度約 在核酸雜交分析過程中，常將已知順序的核酸片段用放射性同位素或生物素進行標記。這種帶有一定標記的已知順序的核酸片段稱為探針（probe）。核酸化學主題醫學知識101 在核酸雜交分析過程中，常將已知順序的核酸片段分子雜交的“探針”變性（加熱）雜交（緩慢冷卻）復性（緩慢冷卻）探針核酸化學主題醫學知識102分子雜交的“探針”變性（加熱）雜交（緩慢冷卻）復性（緩慢冷卻DNA-RNA雜交示意圖核酸化學主

60、題醫學知識103DNA-RNA雜交示意圖核酸化學主題醫學知識103利用核酸的分子雜交，可以確定或尋找不同物種中具有同源順序的DNA或RNA片段。常用的核酸分子雜交技術有：原位雜交、斑點雜交、Southern雜交及Northern雜交等。原位雜交技術：直接用探針與菌落或組織細胞中的核酸雜交，未改變核酸所在的位置。斑點雜交：將核酸直接點在膜上，再與核酸雜交。Southern印跡法：將電泳分離后的DNA片段從凝膠轉移到硝酸纖維素膜上，再進行雜交。Northern印跡法：將電泳分離后的RNA吸印到纖維素膜上再進行分子雜交。核酸化學主題醫學知識104利用核酸的分子雜交，可以確定或尋找不同物種中具有同源順