1、人類染色體標本制備及核型分析實驗三人類染色體標本制備及核型分析1人類染色體標本制備實驗三人類染色體標本制備及核型分析11、掌握人類外周血細胞常規核型的標本制備 方法； 2、掌握胰酶法G顯帶的技術；3、掌握G顯帶核型分析的基本過程和技術；4、熟悉快速線條圖的繪制；5、了解染色體自動分析系統的原理和使用方法。一、目的與要求 人類染色體標本制備及核型分析21、掌握人類外周血細胞常規核型的標本制備一、目的與要求 人類二、基本原理 （一）染色體標本制備 外周血中的淋巴細胞幾乎都是處在G0期或G1期，一般情況下是不分裂的。 當在培養基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）時，這

2、種小淋巴細胞受到刺激后轉化為淋巴母細胞，并開始進行有絲分裂。 經過短期培養后，用秋水仙素處理、低滲、固定、滴片和染色，就可獲得大量中期分裂相的細胞，制片后可以清楚地對染色體進行觀察。人類染色體標本制備及核型分析3二、基本原理 （一）染色體標本制備人類染色體標本制備及核型分染色體標本制作技術有下述四大發現： 一、美籍華人徐道覺(1952)從助手工作中的失誤發現采用蒸餾水低滲處理分裂細胞可使染色體展開； 二、Tjio(1956)發現秋水仙素可使分裂的細胞停止在中期； 三、LiJG發現PHA(phytohemagglutin)(植物血球凝集素)可使淋巴細胞轉化為淋巴母細胞，呈分裂狀態； 四、標本的空

3、氣干燥法使細胞和染色體展平。 人類染色體標本制備及核型分析4染色體標本制作技術有下述四大發現：人類染色體標本制備及核型分這種培養方法是Moorhead于1960年建立的。在人類遺傳分析中普遍采用外周血培養的方法獲取分裂的細胞，進而開展臨床和基礎遺傳學的研究。這對于遺傳疾病的檢出以及遺傳咨詢等工作發揮了重要作用。 人類染色體標本制備及核型分析5這種培養方法是Moorhead于1960年建立的。人類染色體（二）染色體顯帶 人們將用各種不同的方法，以及用不同的染料處理染色體標本后，使每條染色體上出現明暗相間，或深淺不同帶紋的技術稱為顯帶技術（banding technique）。人類染色體標本制備及

4、核型分析6（二）染色體顯帶 人們將用各種不同的方法，以 研究發現，人染色體標本經胰蛋白酶、Na0H、檸檬酸鹽或尿素等試劑處理后，再用Giemsa染色，可使每條染色體上顯示出深淺交替的橫紋，這就是染色體的G帶。每條染色體都有其較為恒定的帶紋特征，所以G顯帶后，可以較為準確的識別每條染色體，并可發現染色體上較細微的結構畸變。人類染色體標本制備及核型分析7 研究發現，人染色體標本經胰蛋白酶、Na0 關于G顯帶的機理目前有多種說法，較常見的有 1、Lee等（1973）認為染色體上與DNA結合疏松的組蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后這些區段成為淺帶，而那些組蛋白和DNA結合牢固的區段可被染成深帶。人類染色

5、體標本制備及核型分析8 關于G顯帶的機理目前有多種說法，較常見的有 2、有人認為，染色體顯帶現象是染色體本身存在著帶的結構。比如用相差顯微鏡觀察未染色的染色體時，就能直接觀察到帶的存在。用特殊方法處理后，再用染料染色，則帶更加清楚，隨顯帶方法不同，顯出來的帶特點也不一樣，說明帶的出現又與染料特異結合有關。人類染色體標本制備及核型分析9 2、有人認為，染色體顯帶現象是染色體本身存 一般認為，易著色的陽性帶為含有AT多的染色體節段，相反，含GC多的染色體段則不易著色。總的來說，G顯帶的機理還未搞清。人類染色體標本制備及核型分析10 一般認為，易著色的陽性帶為含有AT多的染色三、內容與操作一、染色體

6、G顯帶標本的制備 1. 采血：采血過程中嚴格執行無菌操作。 2接種：超凈工作臺內 0.30.5ml 輕輕水平搖動混勻。 培養：5%CO2，375恒溫箱培養64-65小時；卡介苗注射器(5號針頭)向培養瓶中加入20g/ml秋水仙素（0.01%）一滴，輕輕搖勻，放回溫箱繼續培養至68小時。 人類染色體標本制備及核型分析11三、內容與操作一、染色體G顯帶標本的制備人類染色體標本制備及4、離心：10分鐘（1500轉分），棄上清液，留下沉淀物。5、低滲：68m1預溫37的0.075M KCl溶液，沉淀細胞重重沖散，37水浴箱30-35分鐘。6、預固定：1ml新配制的固定劑，輕輕沖打，37水浴箱中靜置5分

7、鐘。7、離心：1500轉分離心10分鐘，棄上清液。6第一次固定：固定液68m1，沉淀物輕輕沖打均勻，37水浴箱中靜置固定10分鐘。7、第一次離心10分鐘(1500轉分)，棄上清液。8、 重復第6、7步。人類染色體標本制備及核型分析124、離心：10分鐘（1500轉分），棄上清液，留下沉淀物。9、 制片：留固定液0.2ml0.4ml，輕輕沖打制成細胞懸液。冰凍載波片，滴管口距離載玻片1015cm，每片23滴。10、烤片：75烤箱烤3小時。自然冷卻。人類染色體標本制備及核型分析139、 制片：留固定液0.2ml0.4ml，輕輕沖打制成細胞11、胰酶預溫：立式染色缸中磷酸緩沖液100ml（ 115M

8、 NaH2PO4 80.8 ml ，KH2PO4 19.2ml)，2.5的胰蛋白酶原液1ml配成0.025的工作液。37的恒溫水浴箱內預溫。12、顯帶：不斷輕輕擺動，使胰酶作用均勻，處理時間2590秒鐘左右（較陳舊標本時間適當延長，隨著處理標本數量增加，胰酶逐漸消耗，胰酶作用時間逐漸延長，精確的時間自行摸索）。 取出標本片，立即用37預溫的生理鹽水輕輕漂洗兩次，去除片子上的胰酶溶液。 人類染色體標本制備及核型分析1411、胰酶預溫：立式染色缸中磷酸緩沖液100ml（ 11513、染色：37預溫的Giemsa工作液染色12分鐘，自來水沖洗，氣干。14、鏡檢：低倍鏡下選擇分散良好的長度適中的分裂相

9、轉換油鏡觀察，若染色體未出現帶紋，則為顯帶不足；若染色體邊緣發毛為顯帶過頭，此時應根據具體情況增減胰蛋白酶處理時間重新處理一張標本。 人類染色體標本制備及核型分析1513、染色：37預溫的Giemsa工作液染色12分鐘，自注意事項玻片完全干后，才可置油鏡下進行觀察。每次顯帶均應做予實驗處理，以決定正確的顯帶時間，不可盲目處理所有玻片。顯帶效果的判斷，應多觀察幾個長度適中的分裂相,不能僅憑1、2個分裂相的顯帶效果決定下一步顯帶時間。人類染色體標本制備及核型分析16注意事項玻片完全干后，才可置油鏡下進行觀察。人類染色體標本二、G顯帶標本的核型分析 一禿二蛇三蝶飛，四象鞭炮五黑腰。六號短臂小白臉，七

10、上八下九苗條。十號長臂三條帶，十一低來十二高，十三十四十五號，三個一樣一二一。十六長臂近點深，十七遠端帶腳鐐。十八人小肚皮大，十九中間一點腰。二十頭重腳底輕，二十一象葫蘆瓢。 二十二一點Y黑腰，X pq 一肩挑。 人類染色體標本制備及核型分析17二、G顯帶標本的核型分析 一禿二蛇三蝶飛，1號染色體中央著絲粒和次縊痕染色深。 短臂：近側段和中段各有一條深帶，其中段深帶稍寬，在處理較好的標本上，遠側段可顯出2-3條淡染的深帶。此臂分為3個區，近側的深帶為2區1號帶，中段深帶為3區1號帶。 長臂：次溢痕緊貼著絲粒，染色濃。其遠側為一寬的淺帶，中段和遠側段各有兩條深帶，以中段第2深帶染色較濃，中段兩條

11、深帶稍靠近。此臂分為4個區，次溢痕遠側的淺帶為2區1號帶，中段第2深帶為3區1號帶，遠側段第3深帶為4區1號帶。 一禿人類染色體標本制備及核型分析181號染色體中央著絲粒和次縊痕染色深。一禿人類染色體標本制備及2號染色體 短臂：可見4條深帶，中段的兩條深帶稍靠近。此臂分為2個區，中段第2、3深帶之間的淺帶為2區1號帶。 長臂：可見6-7條深帶，此臂分為3個區，第2和第3深帶之間的淺帶為2區1號帶，第4和第5深帶之間的淺帶為3區1號帶。 二蛇人類染色體標本制備及核型分析192號染色體 短臂：可見4條深帶，中段的兩條深帶稍靠近。此3號染色體著絲粒染色濃。在短臂和長臂的中短各有一條明顯而寬闊的淺帶。

12、 短臂：一般在近側段可見兩條深帶，遠側段可見3條深帶，其中遠側近端部的一條較窄，且著色較淡，這是區別3號染色體短臂的顯著特征。此臂分為2個區，中段淺帶為2區1號帶。 長臂：一般在近側段和遠側段各有一條較寬的深帶。在處理較好的標本上，近側段的深帶可分為3條深帶，此臂分為2個區，中段淺帶為2區1號帶。 三蝶飛人類染色體標本制備及核型分析203號染色體著絲粒染色濃。在短臂和長臂的中短各有一條明顯而寬闊4號染色體 短臂：可見1-2條深帶，短臂只有1個區。 長臂： 可見均勻分布的4條深帶，在處理較好的標本上，在2、3深帶間還可顯出一條較窄的深帶。此臂分為3個區，近側段第1、2深帶間的淺帶為2區1號帶；遠

13、側段第3、4深帶間的淺帶為3區1號帶。 四象鞭炮人類染色體標本制備及核型分析214號染色體 短臂：可見1-2條深帶，短臂只有1個區。5號染色體 短臂： 可見1-2條深帶，其遠側的深帶寬而且色濃。此臂只有1個區。 長臂： 近側段有一條深帶，染色較淡；中段可見3條深帶，染色較濃；遠側段可見1-2條深帶，近末段的一條著色較濃。此臂分為3個區，中段第2深帶為2區1號帶；中段第3深帶與遠側段第1深帶之間寬闊的淺帶為3區1號帶。 五黑腰人類染色體標本制備及核型分析225號染色體 短臂： 可見1-2條深帶，其遠側的深帶寬而且6號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 中段有一條明顯而寬闊的淺帶，近側段和遠側段各有一條

14、深帶，近側段的深帶緊貼著絲粒。在處理較好的標本上，遠側段的深帶可分為2條深帶。此臂分為2個區，中段的明顯而寬闊的淺帶為2區1號帶。 長臂：可見5條深帶，近側的一條緊貼著絲粒。遠側段末段的一條深帶窄而且著色較淡。此臂分為2個區，第2和第3深帶之間的淺帶為2區1號帶。六號短臂小白臉人類染色體標本制備及核型分析236號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 中段有一條明顯而寬闊的7號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 有3條深帶，中間的一條深帶窄而且著色極淡，有時不明顯，遠側近末段的深帶著色濃而稍寬，宛如“瓶蓋”，這常常是辨別7號染色體的明顯特征。此臂分為2個區，遠側深帶為2區1號帶。 長臂： 有3條明顯的深帶，遠

15、側近末段的一條深帶著色較淡，第2和第3深帶稍接近。此臂分為3個區，近側第1深帶為2區1號帶；中段的第2深帶為3區1號帶。 七上人類染色體標本制備及核型分析247號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 有3條深帶，中間的一條8號染色體 短臂： 有2條深帶，其間有一條較明顯的淺帶，這是與10號染色體相區別的主要特征。此臂分為2個區，中段淺帶為2區1號帶。 長臂： 近側段可見2-3條分界不明顯的深帶，遠側段有一明顯而恒定的深帶。此臂分為2個區，中段深帶為2區1號帶。 八下人類染色體標本制備及核型分析258號染色體 短臂： 有2條深帶，其間有一條較明顯的淺帶，9號染色體著絲粒染色濃。 短臂：遠側段可見兩條深帶

16、，在有的標本上融合成一條深帶。此臂分為2個區，近側的第1深帶為2區1號帶。 長臂：可見兩條明顯的深帶，次溢痕一般不著色，在有些標本上呈現特有的狹長“頸部區”。此臂分為3個區，近中段的一深帶為2區1號帶，遠側段的一深帶為3區1號帶。 九苗條人類染色體標本制備及核型分析269號染色體著絲粒染色濃。 短臂：遠側段可見兩條深帶，在有10號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 近中段有一條深帶。此臂只有1個區。 長臂： 可見明顯的3條深帶，近側的一條著色最濃。該長臂上的這3條明顯的深帶是與8號染色體相區別的一個主要特征。此臂分為2個區，近側段的第1深帶為2區1號帶。 十號長臂三條帶人類染色體標本制備及核型分析2

17、710號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 近中段有一條深帶。此11號染色體著絲粒染色濃。 短臂：近中段可見一條寬的深帶，在處理較好的標本上，這條深帶可分為兩條較窄的深帶。此臂只有1個區。 長臂：近側有一條深帶，緊貼著絲粒，近中段可見一條明顯的較寬的深帶，在這條深帶與近側深帶之間有一條寬闊的淺帶。在處理較好的標本上，近中段的這條較寬的深帶可分成兩條較窄的深帶，兩深帶之間有一條很窄的淺帶，后者雖常不明顯，但卻是分區上的一個界標。在有些標本上近末端處尚可見一條窄的淺色的深帶。此臂分為2個區，界標即2區1號帶為上述近中段兩深帶之間的那條很窄的淺帶。十一低來人類染色體標本制備及核型分析2811號染色體著絲粒

18、染色濃。 短臂：近中段可見一條寬的深帶12號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 中段可見一條深帶，此臂只有一個區。 長臂： 近側有一條深帶緊貼著絲粒。中段有一條寬的深帶，這條深帶與近側深帶之間有一條明顯的淺帶，但與11號染色體比較，這條淺帶較窄，這是鑒別11號與12號染色體的一個主要的特征。在處理較好的標本上，中段這條較寬的深帶可顯出3條較窄的深帶，且正中一條著色較濃。在有些標本上，遠側段還可見1-2條窄的染色較淡的深帶。此臂分為2個區，中段正中著色較濃的深帶為2區1號帶。 十二高人類染色體標本制備及核型分析2912號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 中段可見一條深帶，此13號染色體著絲粒和短臂染色濃。

19、 長臂： 可見4條深帶，第1和第4深帶較窄、染色較淡；第2和第3深帶較寬、染色較濃。此臂分為3個區，第2深帶為2區1號帶，第3深帶為3區1號帶。 十三十四十五號，三個一樣一二一人類染色體標本制備及核型分析3013號染色體著絲粒和短臂染色濃。 長臂： 可見4條深帶，14號染色體著絲粒和短臂染色深。 長臂： 近中段和遠側段各有一條較明顯的深帶。在處理較好的標本上其近側可顯出一條深帶，其中段可顯出一條著色較淡的深帶。此臂分為3個區，近側第2條深帶為2區1號帶，遠側第4深帶為3區1號帶。 人類染色體標本制備及核型分析3114號染色體著絲粒和短臂染色深。 長臂： 近中段和遠側段15號染色體著絲粒和短臂染

20、色濃。長臂： 中段有一條明顯的深帶，染色較濃。在有的標本上其近側段可見1-2條淡染的深帶。此臂分為2個區，中段深帶為2區1號帶。人類染色體標本制備及核型分析3215號染色體著絲粒和短臂染色濃。長臂： 中段有一條明顯的16號染色體中央著絲粒和次縊痕染色濃。 短臂： 中段有一條著色較淡的深帶，在有的標本上可見兩條深帶。此臂只有一個區。 長臂： 除次縊痕外有兩條深帶，遠側段的一條有時不明顯。此臂分為2個區，中段深帶為2區1號帶。 十六長臂近點深人類染色體標本制備及核型分析3316號染色體中央著絲粒和次縊痕染色濃。 短臂： 中段有一17號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 中段有一條深帶。此臂只有一個區。

21、長臂： 遠側段可見一條深帶，這條深帶與著絲粒相連的深帶之間為一明顯而寬的淺帶。此臂分為2個區，上述淺帶為2區1號帶。 十七遠端帶腳鐐人類染色體標本制備及核型分析3417號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 中段有一條深帶。此臂18號染色體 短臂： 一般為淺帶。此臂只有一個區。 長臂： 近側和遠側各有一條明顯的深帶。此臂分為2個區，兩條帶之間的淺帶為2區1號帶。 十八人小肚皮大人類染色體標本制備及核型分析3518號染色體 短臂： 一般為淺帶。此臂只有一個區。 19號染色體著絲粒及其周圍為深帶，其余均為淺帶。在有的標本上其長臂近中部可顯出一條著色極淡的深帶。短臂和長臂均只有一個區。 十九中間一點腰人類染色體標本制備及核型分析3619號染色體著絲粒及其周圍為深帶，其余均為淺帶。在有的標本上20號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 中部有一條明顯而濃染的深帶。此臂只有一個區。 長臂： 在遠側段可見1-2條染色較淡的深帶，但有時不明顯。此臂只有一個區。 二十頭重腳底輕人類染色體標本制備及核型分析3720號染色體著絲粒染色濃。 短臂： 中部有一條明顯而濃染21號染色體著絲粒染色濃。比22號