1、 微量凱氏定氮法姓名：周超學(xué)號：201100140067班級：11級生命基地同組者：劉炳煜時間：2011年6月4日【實驗?zāi)康摹?、掌握凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。2、學(xué)會使用凱氏定氮儀。【實驗原理】凱氏定氮也稱克氏定氮。樣品與濃硫酸共熱，含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化)，氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。然后經(jīng)強(qiáng)堿堿化使硫酸銨分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度，即可計算的樣品之含氮量，若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：TOC o 1-5 h zNH2CH2COOH+3H2SO4-2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2SO4-(NH4)2SO4(2)(NH4

2、)2SO4+2NaOH2H2O+Na2SO4+2NH3t(3)反應(yīng)(1)(2)在凱氏燒瓶內(nèi)完成，反應(yīng)(3)在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行(如圖1)，其特點是將蒸汽發(fā)生器、蒸餾器及冷凝器三個部分融為一體。由于蒸汽發(fā)生器體積小，節(jié)省能源，本儀器使用方便，效果良好。為了加速消化，可以加入CuS04作催化劑，及硫酸鉀以提高溶液之沸點，收集氨可用硼酸溶液，氨與溶液中的氫離子結(jié)合生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低，指示劑顏色發(fā)生改變，然后用強(qiáng)酸滴定，所用無機(jī)酸的量即相當(dāng)于被測樣品中氨的量，本法適用范圍約為0.21.0mg/mL氮。凱氏定氮法常用于測定天然有機(jī)物(如蛋白質(zhì)，核酸及氨基酸等)的含氮量。圖1微量凱氏定氮蒸

3、餾裝置【實驗試劑】實驗儀器1、微量凱氏定氮蒸餾裝置2、100ml錐形瓶6個3、5ml移液管4、10ml量筒5、電爐6、鐵架臺7、酸式滴定管8、沸石實驗材料1、牛奶2、濃硫酸3、K2SO4CuSO4混合物4、雙氧水5、0.3mgN/ml的標(biāo)準(zhǔn)硫酸氨6、硼酸7、30%的NaOH溶液8、0.0093mol/L的HC1溶液9、甲基橙指示劑10、蒸餾水【實驗步驟】1、將凱氏定氮儀器的裝置儀器安裝好。樣品的消化：牛奶：水=1:1的樣品2ml，加入4mlHSO，再加入200mg24KSOCuSO催化劑，加熱，消化至消化液由褐色變淡直至淡黃色，冷卻，加入244雙氧水?dāng)?shù)滴，繼續(xù)加熱至消化液至淺藍(lán)色，冷卻定容至1

4、00ml,備用。2、空白的制備：樣品部分換成水，其他的操作與操作2相同。3、儀器的洗滌：在蒸氣發(fā)生器內(nèi)加入5mL濃硫酸和2滴甲基橙，并加蒸餾水總量加至容器容積的2/3,接收瓶內(nèi)加入5mL混合指示劑，加熱；如果接收瓶內(nèi)指示劑不變色則表明洗凈，關(guān)閉電爐，在小漏斗內(nèi)加入蒸餾水，打開止水夾，將水放入，將廢液倒吸出。4、標(biāo)準(zhǔn)硫酸氮含量測定：接收瓶內(nèi)加入5mL硼酸，反應(yīng)室內(nèi)加入1ml（NH）SO424（樣品測定時，加入2ml樣品），10ml30%Na0H溶液，加熱；待混合指示劑變?yōu)榈G色時計時3min，然后使液面離開冷凝管口約1cm，并用少量去離子水洗滌冷凝管口，繼續(xù)蒸餾1min。然后用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸進(jìn)行滴定，

5、平行測定三次。5、樣品的測定：相同的方法測定，空白測二組，樣品平行測三次。【實驗結(jié)果】（一）實驗數(shù)據(jù)1、標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨含量測定組數(shù)消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸量（0.0093mol/L/ml第一組2.52第二組2.44第三組2.48平均值2.482、樣品含量測定組數(shù)消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸量(00093mol/L)/ml第一組1.62第二組1.66第三組1.62平均值1.63空白滴定均為0數(shù)據(jù)處理1、標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨含量測定計算消耗鹽酸的平均體積為2.48ml標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的濃度為0.0093mol/L氮含量=2.48X10-3X0.0093X14X1000=0.323mg/ml0.323-0.300|0.,3002、樣品含量計算消耗鹽

6、酸的平均體積為1.63ml標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的濃度為0.0093mol/L氮含量=1.63X10-3X0.0093X14/2X50X100=0.530g/100ml蛋白質(zhì)含量=0.530X6.25=3.313g/100ml【思考討論】(一)結(jié)果分析本次實驗結(jié)果比實際值(2.9g/100ml)偏大，原因可能是1、滴定操作導(dǎo)致的誤差，在用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨進(jìn)行滴定練習(xí)時，計算的含量比正常值大，因此可能是滴定不規(guī)范造成鹽酸過量，導(dǎo)致誤差。2、可能是鹽酸長期暴露在空氣中揮發(fā)，導(dǎo)致其實際濃度比原標(biāo)定濃度偏小，最終導(dǎo)致滴定的鹽酸體積大于實際的，最終導(dǎo)致蛋白含量偏高。3、微量凱氏定氮法測得的氮不全是蛋白質(zhì)中的氮，也可能是牛奶

7、包含的其他物質(zhì)中的氮，因此導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量偏高。4、本實驗是根據(jù)含氮量間接求出蛋白質(zhì)的含量，是根據(jù)蛋白質(zhì)的平均含氮比值計算的，并不是本實驗樣品中蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確含氮量。5、蒸氣發(fā)生瓶里的液體酸度不夠，在堿性條件水中游離氨蒸出，使結(jié)果偏大。（二）注意事項1、定氮儀各連接處應(yīng)使玻璃對玻璃外套橡皮管絕對不能漏氣。蒸餾時需控制火力以避免樣液倒吸。2、消化時，若樣品含糖高或含脂及較多時，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失。3、消化時，若有泡沫產(chǎn)生，則等泡沫消失后再使電壓達(dá)到220V,否則泡沫太多，硫酸不能完全將樣品消化。4、蒸餾時，一定要在蒸氣發(fā)生瓶里加入沸石，防暴沸。沸石晾干后可循環(huán)使

8、用，每次開始蒸餾前一定要加入新的沸石。5、蒸餾時，加入的氫氧化鈉必須過量，并且動作還要迅速，以防止氨的流失。6、蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水裝至2/3體積并且保持酸性（在蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，內(nèi)加甲基橙指示劑數(shù)滴，水應(yīng)呈橙紅色，如變黃時，應(yīng)該補加酸），以防止在堿性條件水中游離氨蒸出，使結(jié)果偏大。7、蒸餾時，蒸氣要均勻、充足，蒸餾中不得停火斷氣，否則，會發(fā)生倒吸。操作時，應(yīng)先將冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸1min后關(guān)掉熱源。&變?yōu)榫G色后開始計時3分鐘，然后使冷凝口離開液面1cm，用蒸餾水洗滌冷凝口，繼續(xù)蒸餾1min9、對儀器進(jìn)行洗滌時，要用蒸餾水洗三遍。10、滴定時，液體變微紅，且30s不褪色即到達(dá)滴定終點。（三）思考討論微量凱氏定氮法的