1、蹄葉橐吾乙醇提取物對肝細胞色素P450的影響【摘要】目的研究蹄葉橐吾乙醇提取物對大鼠和小鼠肝細胞色素P450YP450的影響。方法蹄葉橐吾乙醇提取物口服給藥后，觀察其對小鼠戊巴比妥鈉催眠作用的影響、對大鼠肝微粒體YP450含量、肝臟指數的影響，采用HPL測定探針藥的代謝率觀察其對大鼠肝YP450的7種亞型酶活性的影響。結果蹄葉橐吾乙醇提取物對戊巴比妥鈉誘導小鼠的睡眠時間無影響，大鼠肝YP450含量及肝臟指數無顯著變化，對大鼠肝YP450的7種亞型探針藥的代謝率亦無影響。結論蹄葉橐吾乙醇提取物對肝藥酶無誘導作用。【關鍵詞】蹄葉橐吾；肝細胞色素P450；誘導作用細胞色素P450ythreP450,

2、YP450是生物體內參與各類外源性及內源性物質代謝的主要酶系，負責90%以上藥物的生物轉化。YP450的活性可受到多種因素的影響。近年來，由于藥物代謝性互相作用誘發的不良反響日漸引起人們的重視。但有關中草藥對YP450影響作用的報道尚不多見。蹄葉橐吾Ligulariafisheri為菊科pasitae橐吾屬(Ligularia)多年生草本植物，又名腎葉橐吾?中藥志?、馬蹄葉東北等，其根和根莖收入吉林省藥材標準，名山紫菀1。藥理研究說明，其根和根莖具有鎮咳祛痰作用2，葉的提取物具有抗氧化作用3，4，地上局部乙醇提取物具有抗炎免疫5，6和抗潰瘍作用7。且蹄葉橐吾的平安性較高8，9。本實驗通過研究蹄

3、葉橐吾地上局部乙醇提取物對肝YP450的影響，預測其在結合用藥時可能會產生的代謝性互相作用，對蹄葉橐吾臨床合理用藥提供科學根據。1材料與儀器1.1藥品蹄葉橐吾野生在吉林省琿春市采集，由延邊大學藥學院劉永鎮教授鑒定。蹄葉橐吾地上局部乙醇提取物ethanlextratfrLigulariafisheri，以下簡寫為Lfe的制備：蹄葉橐吾地上局部晾干、粉碎，用95%乙醇加熱回流提取，濾液加水放置24h，過濾后用石油醚萃取，水層加熱濃縮至浸膏，每克相當于20g生藥，實驗用其水溶液灌胃給藥。1.2試劑非那西汀phenaetin，雙氯酚酸Dilfena，奧美拉唑eprazle，氫溴酸右美沙芬Dextret

4、hrphanHydrbride，氯唑沙宗hlrzxazne，氨苯砜Dapsne,ainphenylsulfne均購于中國藥品生物制品檢定所,香豆素uarin購于沈陽市試劑三廠化學純。葡萄糖-6-磷酸D-Gluse6-phsphatedisdiusalthydrate、氧化型輔酶(-Nitinaideadeninedinuletidephsphatesdiusalthydrate,-NADP)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Gluse-6-phsphateDehydrgenase)購于siga公司。戊巴比妥鈉，Serva進口分裝上海化學試劑分裝廠。HPL級甲醇、乙腈購于美國Fisher公司。1.3儀器

5、美國TherFinnigansurveyr高效液相色譜儀配有四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器；Xalibur1.4色譜工作站；AgilentXDB-18色譜柱(4.6250，5)；日本島津ShiadzuUV-260紫外可見光分光光度計；QX-200酶標儀美國Bi-TekInstruentsIn.；EYELA旋轉蒸發儀N-1000SD-2000；BEKAN公司高速冷凍離心機；2K-15型高速離心機(Siga)；YKH-3型液體快速混合器江西醫療器械廠；瑞士ETLERTLED公司AG135型電子天平。2方法2.1Lfe對小鼠戊巴比妥鈉催眠作用的影響小鼠隨機分為兩組，每組10只。藥物組灌胃(ig

6、)給予Lfe250gkg-1，對照組ig同體積生理鹽水，1次/d，連續3d。末次給藥后24h各組小鼠均腹腔注射(ip)戊巴比妥鈉50gkg-1。室溫2225，ip戊巴比妥鈉的時間在上午9時左右。觀察小鼠的睡眠時間(從翻正反射消失至恢復的間隔時間)。2.2Lfe對大鼠YP450含量及各亞型酶活性的影響大鼠隨機分為2組，每組8只。藥物組灌胃給予Lfe250gkg-1，對照組ig同體積生理鹽水，1次/d，連續3d。2.2.1大鼠肝微粒體的制備末次給藥后24h將大鼠處死，采用差速離心法制備肝微粒體。取肝臟，漂洗、吸干、稱重后剪碎，按13(/V)比例參加TS緩沖液含0.05lL-1Tris，3lL-1g

7、l2，0.2lL-1蔗糖，pH7.4勻漿后于4，10000g，離心30in，取上清液轉移至超速離心管內，4離心，100000g，60in，沉淀即為肝微粒體。重懸后分裝，置-80冰箱內保存備用。微粒體蛋白濃度采用Bradfrd法測定10。2.2.2YP450含量及肝臟指數的測定采用ura和Sat的方法測定YP450含量11。P450(nlg-1蛋白)=A(450n-490n)1000/91蛋白濃度gl-1。計算肝臟指數，肝臟指數g/100g體質量=肝重/體質量100%。轉貼于論文聯盟.ll.2.2.3肝微粒體體外溫孵實驗將Lfe給藥組8只大鼠的微粒體蛋白稀釋至一樣濃度后等體積混合，分裝至各管。對

8、照組大鼠微粒體亦作一樣處理。將探針藥香豆素YP2A6底物、右美沙芬YP2D6底物、雙氯酚酸YP29底物、奧美拉唑YP219底物、氨苯砜YP3A4底物、非那西汀YP1A2底物、氯唑沙宗YP2E1底物分別與給藥組或對照組大鼠的肝微粒體于37溫孵。以pH7.4的Tris-Hl緩沖液0.5l為總反響體系，其中肝微粒體蛋白濃度1gl-1，NADPH生成系統(NADP1lL-1,葡萄糖-6-磷酸10lL-1，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶1Ul-1)，gl24lL-1。探針藥濃度及溫孵時間見表1。反響體系中有機溶劑終濃度不超過0.5%V/V。表1各探針藥濃度、溫孵時間及色譜條件(略)2.2.4肝微粒體溫孵樣品的處

9、理及HPL測定各反響管溫孵一定時間后參加3L甲醇終止反響，渦旋振蕩1in，離心，取上清3L，35減壓蒸干，殘渣用100l流動相復溶，離心10000rin-1，10in，取上清，進樣20l。應用HPL測定上述探針藥的代謝率，與對照組比擬，以反映Lfe對上述YP450各亞型是否有誘導作用。其中氨苯砜，非那西汀，氯唑沙宗的測定采用“雞尾酒(ktail法。2.3統計處理實驗結果以s表示，采用SPSS13.0統計軟件進展方差分析。3結果3.1Lfe對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間的影響與對照組相比，Lfe連續給藥3d，戊巴比妥鈉誘導小鼠的睡眠時間無顯著性差異P0.05，說明Lfe對小鼠肝藥酶無誘導作用。結果

10、見表2。表2Lfe對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間的影響(略)3.2Lfe對大鼠肝YP450含量及肝臟指數的影響結果顯示，Lfe連續給藥3d后，大鼠YP450含量及肝臟指數與對照組相比均無顯著性差異(P0.05),說明Lfe對大鼠YP450無誘導作用。結果見表3。表3Lfe對大鼠肝YP450含量及肝臟指數的影響(略)3.3Lfe對大鼠YP450各亞型酶活性的影響3.3.1色譜行為如圖1所示，在選定的HPL條件下各探針藥峰形較好，肝微粒體內源性物質對其測定無干擾，可作為各探針藥定量分析的條件。3.3.2各探針藥代謝率的測定結果結果說明，Lfe口服給藥3次后YP1A2,29,219,2D6,2E1,3

11、A4,2A6等7種YP450亞型特異性底物的代謝率與對照組相比均無顯著性差異，說明Lfe對上述7種YP450亞型酶無誘導作用。結果見圖2。與表3結果-Lfe對YP450含量及肝臟指數無明顯影響相一致。4討論藥物互相作用最常見的原因是YP450的誘導和抑制。藥酶的誘導可增加生物轉化率，從而降低藥物濃度，使藥效減弱，假如代謝形成活性產物那么會增強藥物的作用或毒性。在藥物代謝性互相作用中，酶誘導引起的互相作用約占23%，因此提醒蹄葉橐吾地上局部乙醇提取物Lfe對肝YP450的影響對于其臨床合理用藥具有重要意義。為理解Lfe是否存在潛在的代謝性互相作用，本實驗觀察了Lfe對藥物代謝酶YP450的影響。

12、戊巴比妥鈉由肝臟代謝，其誘導小鼠睡眠時間的長短可反映肝藥酶的活性。以戊巴比妥鈉誘導小鼠的睡眠時間作為觀測肝藥酶體內活性變化的生物學指標，并利用整體動物屢次給予Lfe后肝微粒體YP450含量、肝臟指數、肝YP450酶活性的變化觀察其對YP450酶是否有誘導作用。Lfe250gkg-1連續給藥3d，對戊巴比妥鈉誘導小鼠的睡眠時間無影響，間接提示Lfe對小鼠肝藥酶無誘導作用。Lfe250gkg-1連續給藥3d后，大鼠肝YP450總量和肝臟指數無顯著變化，提示Lfe對大鼠肝藥酶無誘導作用。但上述作用是否系Lfe對YP450多種亞型酶誘導和抑制作用的綜合結果尚不能確定。因此，我們進一步研究了Lfe對YP

13、450多種亞型酶活性的影響，主要是7種參與臨床常用藥物代謝的YP450同工酶。研究結果顯示，大鼠連續口服Lfe后的肝微粒體對YP1A2，29，219，2D6，2E1，3A4，2A6等7種亞型酶的特異性探針藥的代謝率均無影響，說明Lfe對上述7種YP450亞型酶活性均無明顯影響。綜合上述結果，Lfe對肝藥酶無誘導作用。提示在將降臨床試用時與同服的其他藥物可能不致會因肝藥酶的誘導作用而影響有關藥物的藥效或毒性。關于Lfe對肝YP450是否具有抑制作用尚需進一步實驗證實。【參考文獻】1吉林省衛生局.吉林省藥品標準S，1997:238.2李茁，樊變蘭，于慶海，等.山紫菀與紫菀鎮咳祛痰作用的實驗研究J.

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