1、利用高效液相色譜檢測發(fā)酵液中S-腺苷蛋氨酸含量楊秋明;許海琴;倪輝;蔡慧農(nóng);肖安風【摘要】建立了利用Waters2695高效液相色譜測定畢赤酵母發(fā)酵液中S-腺苷蛋 氨酸(S-adenosylmethionine，SAM )含量的方法，對 HPLCUV 法檢測 SAM含量的色譜條件進行優(yōu)化，最佳色譜條件如下：All-tima C18柱， 150mmx4.6mm ,5pm,流動相為 V(0. OlmmoL/ L 甲酸銨)：V (甲醇) =97:3,流速0 . 6mL/min，柱溫30C,檢測波長260nm 優(yōu)化后的色譜分 離條件可使樣品中的 SAM 與雜質(zhì)達到較佳分離,穩(wěn)定性、精密度及重復性都較好

2、, 其RSD均小于1.5%.利用SAM標品制作標準曲線Y=32408606.0721X + 130181 . 2824，線性范圍為 0.0121.2g/L,R2 達到 0. 9998，平均回收 率為100 . 027%-102 . 533%.此方法可有效地檢測發(fā)醇液中S-腺苷蛋氨酸含 量.%An HPLC determination method was developed for measuring S- adenosylmethionine (SAM) contents in culture broth of Pichia pastoris. The optimized HPLC cond

3、itions for SAM analysis were 0. 01 mmol/L ammonium formate solution ( pH = 3.5 ) - methylalcohol ( V: V = 97 : 3 ) as mobile phase, flow rate 0. 6 mL/min, column temperature 30C, and detection wavelength 260 nm. The separation conditons described above achieved good separation effect, together with

4、high stability, sensitivity, and reproducibility. The standard curve of SAM was Y = 32408606. 0721 X + 130181.2824 , and the linear range was 0. 012 x 1.2 g/L, R2 was 0. 9998, the average recycle rate was 100. 027% - 102. 533%. This method would be useful for SAM analysis during Pichia pastoris ferm

5、entation.期刊名稱】集美大學學報(自然科學版)年(卷),期】2012(017)006【總頁數(shù)】7頁(P421-427)【關鍵詞】高效液相色譜S腺苷蛋氨酸;檢測【作 者】 楊秋明;許海琴;倪輝;蔡慧農(nóng);肖安風【作者單位】 集美大學生物工程學院,福建廈門361021 福建省高校食品微生物與 酶工程研究中心,福建廈門361021 廈門市食品生物工程技術研究中心,福建廈門 361021;集美大學生物工程學院,福建廈門361021;集美大學生物工程學院,福建廈 門361021 福建省高校食品微生物與酶工程研究中心,福建廈門361021 廈門市食 品生物工程技術研究中心,福建廈門361021;集美

6、大學生物工程學院,福建廈門 361021 福建省高校食品微生物與酶工程研究中心,福建廈門361021 廈門市食品 生物工程技術研究中心,福建廈門361021;集美大學生物工程學院,福建廈門 361021 福建省高校食品微生物與酶工程研究中心,福建廈門361021 廈門市食品 生物工程技術研究中心,福建廈門361021【正文語種】 中 文【中圖分類】 R9170 引言S-腺苷蛋氨酸又名S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，簡稱SAM)，它 是L-蛋氨酸(L-methionine，L-Met)的活性形式1 作為生物體內(nèi)重要的代謝中 間物質(zhì)，SAM廣泛存在于動植物及微生物

7、體內(nèi)同時，SAM通過轉甲基、轉硫基、 轉氨丙基作用參與人體內(nèi)的代謝，是維持人體正常代謝必不可少的重要生命物質(zhì)2 臨床研究證明，SAM對肝病、關節(jié)炎空泡脊髓炎、抑郁癥及癡呆癥等都有 明顯的療效，且由于SAM是機體內(nèi)自然形成的物質(zhì)，易于被人體吸收利用，副作 用小，因此，有望成為人類的重要藥物3-4.目前文獻報道的SAM檢測方法主 要是高效液相色譜法5 .SAM分子中存在共軛雙鍵，在200-800 nm有吸收， 因而可以直接使用紫外檢測器檢測使用的色譜柱有陽離子色譜柱6及C18反 相色譜柱7,其中陽離子色譜柱檢測時間長，C18反相色譜柱檢測時間較短;流 動相主要是甲酸銨、磷酸鹽緩沖液.趙曉星8以18

8、%(V：V)40 mmol/L磷酸二 氫銨及2 mmol/L庚烷磺酸鈉、甲醇、水作為流動相，分離效果好，但由于庚烷 磺酸鈉價格昂貴，不適宜大量檢測陳小龍等7以甲酸銨(甲酸調(diào)pH = 3.O)為流 動相，分離時間較長，效果較佳本文選用Alltima C18柱(150 mmx4.6 mm, 5 pm)對檢測條件進行優(yōu)化，建立發(fā)酵液中SAM含量的檢測方法.1材料與方法菌種與材料產(chǎn)SAM畢赤酵母GS115菌JMU0907由集美大學生物工程學院發(fā)酵工程研究室 保藏.SAM的罐上發(fā)酵在YPD平板上挑取單菌落于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28C、 250 r/min培養(yǎng)24 h.將培養(yǎng)好

9、的種子液按10%接種量接入裝有4 L BMGY發(fā)酵培 養(yǎng)基的7 L發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度30C,通氣量為3 mL/min，發(fā)酵pH值為 5.0 ,溶氧40%以上進行培養(yǎng).當甘油耗盡后,開始限制性連續(xù)流加甲醇,使細胞生 長至一定密度最后，以3 mL/(Lh)的流速連續(xù)補加甲醇至發(fā)酵結束9 .1.3胞內(nèi)SAM的提取取1 mL發(fā)酵液3500 r/min離心15 min，棄上清液，加入2 mL 1.5 mol/L高氯 酸，反應2 h,加入2 mL 1.25 mol/L氨水,4艾靜置過夜樣品13000 r/min離 心15 min10.1.4 HPLC 測定配制0.5 mol/L的標準品，與提取液按體積

10、比1:1混合取1 mL混合液13000 r/min離心15 min.在各條件下，按標準品、水、樣品、混標的順序進樣檢測，每 一組條件優(yōu)化所測定的樣品、標準品、混標必須為同一次處理的樣品.將測定后的 色譜圖進行對比，選擇較佳條件進行下一個條件的優(yōu)化.2 結果與討論2.1 波長選擇SAM標準品溶液全波長掃描結果如圖1所示從圖1中可以看出，SAM的最大吸 收波長為210 nm，且其在260 nm處也有一較大吸收值.因細胞破壁后成分復雜， 在210 nm處物質(zhì)干擾多，因此選用260 nm作為HPLC測定SAM時的檢測波 長.流動相的選擇圖2分別是以0.01 mol/L甲酸、乙酸、甲酸銨（甲酸調(diào)pH值為

11、3.0, 0.22 pm水 膜過濾）為流動相，柱溫為30C,流速為0.5 mL/min，檢測波長260 nm , HPLC 檢測發(fā)酵液中SAM濃度的色譜圖.當以0.01 mol/L甲酸作為流動相時峰高為0.050 ,且目的峰與雜質(zhì)沒有完全分離； 以0.01 mol/L乙酸作為流動相時雖然目的峰（SAM峰）與雜質(zhì)峰完全分離，但是其 峰高為0.16;而同一樣品在以0.01 mol/L甲酸銨（甲酸調(diào)pH值為3.0, 0.22 pm 水膜過濾）為流動相時,其峰高為0.25,因而可以認為以甲酸及乙酸作為流動相對 SAM洗脫不完全，無法使用甲酸或乙酸作為流動相對SAM進行定性或定量分析.而以0.01 mo

12、l/L甲酸銨（甲酸調(diào)pH值為3.0, 0.22 pm水膜過濾）為流動相時SAM峰與雜質(zhì)基本分離因此在以下的實驗中，選擇用0.01 mol/L甲酸銨溶液（甲 酸調(diào)pH值為3.0）作為HPLC檢測SAM的流動相.2.3緩沖液pH值的選擇考察pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0對HPLC法（0.01 mol/L甲酸銨（甲酸調(diào) pH值，0.22 pm水膜過濾）波長260 nm，柱溫30C,流速0.5 mL/min）測定發(fā) 酵液中SAM的影響，其結果如圖3所示.其洗脫峰面積及分離度如表1所示從圖 3及表1可以看出，隨著緩沖液pH值的增大，SAM的保留時間后移，且在各條 件下的分離度均大于1.5

13、，滿足分離條件但是從色譜圖中可以看出:pH值為4.0、 5.0下雖然分離度達到分離要求，但是目的峰與雜質(zhì)峰并未完全分離，該pH值下 的緩沖液不適合用于HPLC法測定畢赤酵母發(fā)酵過程的SAM;pH值為3.0、3.5、 4.5條件下，目的峰與雜質(zhì)峰分離完全，該pH值下的緩沖液適合用于HPLC法測 定畢赤酵母發(fā)酵過程的SAM.在HPLC測定過程中每測完一針樣品后，進一針空針， 結果表明:緩沖液pH值增至4.0后，樣品殘留嚴重，若未經(jīng)處理會對下一個樣品 的測量產(chǎn)生影響本次試驗使用的色譜柱耐pH值范圍為2.8 8.0,因而將甲酸銨 溶液的pH值定為3.5.2.4甲醇及乙腈對HPLC測定SAM的影響 反相

14、色譜法一般用非極性固定相11-14，流動相一般為水或者緩沖溶液等強極 性溶劑，在流動相中常加入甲醇、乙腈等有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間.本實驗在采用 反相高效液相色譜測定SAM濃度時，考察甲醇、乙腈的影響.圖4上下分別為以V（0.01 mol/L甲酸銨溶液）：V（乙腈）=100：0、99:1、98:2、 97:3作為流動相，檢測波長260 nm，柱溫30 C,流速0.5 mL/min下色譜 圖.從圖4中可以看出，當在流動相中添加乙腈時，樣品中所有物質(zhì)保留時間明顯 提前，存在多個物質(zhì)在同一時間被洗脫的現(xiàn)象，目的峰與雜質(zhì)峰無法分離，因而以 甲酸銨添加乙腈作為流動相并不適宜用于測定SAM.圖5上下分別為以

15、V（0.01 mol/L甲酸銨溶液）：V（甲醇）=100：0、99:1、98:2、 97：3、96:4、95:5作為流動相，檢測波長260 nm，柱溫30C,流速0.3 mL/min色譜圖從圖5中可以看出，當流動相中甲醇比例由0%增加至5%時， SAM保留時間由7.219 min提前至4.482 min.當甲醇比例為0%3%時，目的 峰能與雜質(zhì)峰較好分離，但當甲醇比例增加至4%時，目的峰無法與雜質(zhì)峰完全分 離當以100%緩沖液為流動相時對C18色譜柱及高效液相色譜儀損耗較大，故選 用V（0.01 mol/L甲酸銨溶液）：V（甲醇）=97：3作為流動相，檢測波長260 nm , 0.5 mL/m

16、in作為HPLC檢測條件進行下一步實驗測定.2.5不同濃度的甲酸銨溶液對HPLC測定SAM的影響圖 6 分別為以 V（0.01、0.02、0.03、0.04 mol/L 甲酸銨溶液）：V（甲醇）=97：3, 檢測波長260 nm , 0.5 mL/min作為HPLC檢測條件檢測發(fā)酵液中SAM含量的 色譜圖.以不同甲酸銨作為流動相，目的峰與雜質(zhì)峰均能較好分離.因緩沖液鹽濃度 越高對高效液相色譜儀及色譜柱的損耗越大，因此選用V（0.01 mol/L甲酸銨溶 液）: V（甲醇）=97：3作為流動相，檢測波長260 nm , 0.5 mL/min作為HPLC檢 測條件進行下一步實驗.表1不同pH值條件

17、下SAM的洗脫峰面積及分離度Tab.1 Peak area and separation of SAM in different pH3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 分離度 Separation degree pH 值 pH value 6081420 6094022 5592012 5028752 4799639 6.2 5.8 4.2 7.5 2.1 峰面積 Peak area 2.6流速對HPLC測定SAM的影響選取流速為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min 對 HPLC 測定 SAM 含量進行考察， 其結果如圖7所示.由圖7可見，提高流速對其分離效果并沒有明顯

18、影響，在流速 為1 mL/min下，SAM仍能與雜質(zhì)完全分離，但是其分離度略有降低;同時提高流 速可以大大縮短SAM的保留時間，改善峰型綜合各個因素影響，將0.6 mL/min 作為HPLC法測定SAM含量的流速.綜上所述，HPLC法測定SAM含量的條件為:V（0.01 mmol/L甲酸銨（甲酸調(diào)pH 值為3.5）:V（甲醇）=97：3,流速0.6 mL/min，柱溫30C,檢測波長260 nm.2.7 HPLC方法性能檢驗線性范圍及檢出限在上述色譜條件下，對12種不同濃度的SAM標準溶液進樣檢測（每個濃度5個平 行），以SAM標準品濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，最小二乘法進行線 性回歸

19、制得標準曲線如圖8所示標準曲線方程為:Y=32408606.0721 X+130181.2824，相關系數(shù) R2=0.9998，線性范圍為 0.012 1.2 g/L.精密度、重復性及穩(wěn)定性對0.1 g/L的SAM標準品溶液經(jīng)7次平行測定，計算其精密度，其結果如表2所 示，SAM含量的相對標準偏差為1.26%，表明該方法精密度良好;對同一發(fā)酵液樣 品溶液經(jīng)7次平行測定，計算其重復性，測定結果如表2所示.SAM含量的相對標 準偏差0.20% ，表明該方法重復性良好;對同一樣品分別在0、2、4、6、8、10、 12 h時進樣檢測，測定結果如表2所示.SAM含量的相對標準偏差為1.6%，表明 該方法

20、在12 h以內(nèi)穩(wěn)定性良好.表2 SAM的精密度、重復性及穩(wěn)定性測定結果Tab.2 Result of precision , reproducibility and stability of SAMRSD/%精密度 Precision 項目 Item 平均值 Average value 標準偏差 Standard deviation 0.333369 0.003605 1.08 0.100245 0.001262 1.26 重復性 Reproducibility 0.443931 0.000882 0.20 穩(wěn)定 性 Stability回收率將含有一定濃度的SAM細胞破壁液等分為3組，每組3份

21、每組分別加入0.1、 0.5、1.0 g/L 3種濃度的SAM標準溶液，在0.02 mmol/L甲酸銨（甲酸調(diào)pH值 為3.5）、流速0.6 mL/min、柱溫30C,檢測波長260 nm的色譜條件下進樣檢 測，測定結果如表3所示.樣品的平均回收率為100.027% 102.533%，相對標準 偏差為1.241%2.546%，表明該方法準確可靠.表 3 SAM 的回收率測定結果 Tab.3 Result of recovery of SAM 組號 Group number 添加量 Amount added/mg 測得量 Measureing content/mg 回收率 Recovery ra

22、te/%平均回收率 Average recovery/%相對標準偏差 Relative standard deviation /%1 102.533 2.546 2 100.027 1.476 3 0.05 0.051 102.80 0.05 0.053 105.00 0.05 0.050 99.80 0.25 0.254 101.68 0.25 0.249 99.56 0.25 0.247 98.84 0.50 0.509 101.80 0.50 0.498 99.50 0.50 0.499 99.82 100.373 1.2413 結論通過對HPLC-UV色譜條件的選擇，建立了使用HPLC

23、-UV定量測定重組畢赤酵母 發(fā)酵液中SAM含量的方法最佳HPLC-UV色譜條件如下:流動相為V（0.01 mmol/L甲酸銨）：V（甲醇）=97：3,流速0.6 mL/min，柱溫30C,檢測波長260 nm.該方法檢測時間短，精密度及準確度好，穩(wěn)定性高，可滿足發(fā)酵生產(chǎn)SAM工 藝過程對SAM的定量分析.參考文獻1 葉盛.s-腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的篩選、誘變選育及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化D. 成都:四川師范大學生命科學學院，2007.BOTTIGLIERI T.s-Adenosyl-L-methionine(sAMe):from the bench to the bedside-molecular b

24、asis of a pleiotrophic molecule J.The American Journal of Clinical Nutrition，2002，76(5):1151-1157.BRADLEY J D，F(xiàn)LUssER D，KATZ B P，et al.A randomized， doubleblind，placebo controlled trial of intravenous loading with s- adenosylmethionine(sAM)followed by oral sAM therapy in patients with knee osteoarthritis J.J Rheumatol，1994，21(5):905-911.FRIEDEL H A，GOA K L，BENFIELD P.s-adenosylmethionine:a