1、一、基本情況二、課題論證小鼠視神經損傷后Nogo-A 新申報元男1994-一、基本情況二、課題論證小鼠視神經損傷后Nogo-A 新申報元男1994-女1994-男1994-月女1994-芳本項目著重探討在視神經受到機械損傷后，Nogo-A 蛋白的表達變化。通過測定Nogo-ANogo-A的神經膠質細胞數量的變化以及光鏡下的病理變化，提供用于研究 Nogo-A 抑制機制的數據，并了解 Nogo-A 的抑制機制；同時鍛煉實驗設計操作能力，為往后的科研打下基礎。 體中一旦中樞神經系統出現病變無法修復，便會出現運動及感覺 等病癥。這都會對 健康及人的正常生活造成影響。而正是因為 CNS 體中一旦中樞神

2、經系統出現病變無法修復，便會出現運動及感覺 等病癥。這都會對 健康及人的正常生活造成影響。而正是因為 CNS 無法自身修復的特性，CNS 的再生修復一直是臨床醫學的研究重點。CNS 修復 ，必須要了解 CNS 不能和 內其他細胞一 能力；CNS中神經元生存微環境中內外源促生長因子和抑制因子對它有影響； 象，但隨后沒有任何發展。近年來通過進一步的實驗發現一些成 中樞神經再生恢復 ，抑制分子將是一個非常好的切入點。2000 年， 、 和英國的三個科研小組同時發現了一種能抑制 CNS受損后再生的 ，命名為 Nogo 。而這種 編碼的蛋白質由于不同的啟動子和mRNA 的不同拼接有三個版本，分別為Nog

3、o-A，Nogo-B，Nogo-C。Nogo-A 是現在的研究重點。NgR Nogo-A 分子中活性部位Nogo-66 的特異性受體，也為CNS 的再生開拓了新的研究方向。與NgR 結合后抑制信號，通過NgR，p75NTR和LINGO-1（中樞神經系統特異的跨膜蛋白）組成的復合受體傳入細胞內，激活 Ras的Rho-A，通過 Rho-A/Rho 激酶作用引起肌動蛋白解聚，導致生長錐塌陷，使軸突再生被抑制Nogo-A 的含量變化，再通過已有的知識在Nogo-A 作用機制的途徑中逐步試驗最后得到解決CNS 無法自身再生的辦法。同時還有實驗表明Nogo-66 對早期胚胎神經元生長并無影響，NEP140

4、（NgR N 端140a段）能夠競爭Nogo-66與 NgR 結合誘導的生長錐坍塌，還有在體外環境下 NgREcto 可以大大降低 Nogo-66 與表達有NgR 的cos-7 細胞的結合。這些都可以作為尋找使CNS 修復的突破點，可以加以利用。此外研究表明 Nogo-A 也可能是一種促進因子，它Nogo-A 已有的知識了解之上，通過破壞試驗Nogo-A 變化值，再在作用步驟中進行探索，得到解決 CNS 修復的辦法或者一些新的啟示。研究與實踐表明， 多數組織具有在損傷后再生修復自身的能力，但成種病癥包括肢體運動及感覺 CNS 的再生修復在理論研究表明，CNS（1）CNS神經元缺Nogo-A 在

5、成年和不同發育階段的神經元中有表達。子 Nogo-A，Nogo-A 在成年和不同發育階段的神經元中有表達。子 Nogo-A，髓鞘堿性蛋白 MAG，少突膠質細胞髓磷脂蛋白 OMgp，軸突導向因子NetrinsNogo-A因其對CNS損傷后的軸突再生具有 抑制作用關于NogoNogo早期研究中Schwab 等的研究小組證實脊髓白質可產生生長抑制成分。1此研究組從少突膠質細胞中成功分離出抑制蛋白分子量為220 /250 KD的神經生長抑制因子（Neurites growth inhibitor，NI并1針對NI-220 /250的特異性抗體IN-1能和這些抑制性蛋白結合。將IN-122000 年,

6、Chen、Gramdpre 和Prinjha 所在的三個NogoNogo 通過可變啟動子和RNA 剪接方式轉錄的mRNA 有三種，對應三種蛋白。Nogo 具有 C 端網狀蛋白同源結構 RHD（Reticulons ）Reticulon（RTNs） 。 RTNs C 端含有一雙賴氨酸的內質網膜定位序列（KDEL，Lys-Asp-Glu-LeuNogo 的分部與功能與內質網密切相關。Nogo-A 在這一序列中有兩個跨膜區，二者之間有一段 66 個氨基酸長度的親水結構域，表達于少突膠質細胞表面及其內質網膜中， 制軸突再生的結構域即其長氨基端（Amino-Nogo-A。Nogo-A CNS髓鞘磷脂神經

7、元軸突生長抑制因子，體內體外均 對軸突再生的強烈抑制作用。而NgR也被確認為Nogo-66的受體。2001年，Fournier等運用堿性磷酸酶融合技術發現了Nogo-66（NgR7NgR是Nogo-AMAGOMgp Nogo-A有兩個抑制軸突生長的結構域：Nogo-66及其氨基端。Nogo-66與再生中的軸突表面特異性受體NgR 結合后發揮再生抑制作用。Fournier 等7早期的研究發現了NgR 是一種具有多個富含亮氨酸（Leucine-rich-repeats, LLR）的重復結構，并且通過糖脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol,GPI)錨定蛋白定位于神經元表面。N

8、gR 與內源性抑制因子 、 gp，特別Nogo-66 結合，通Nogo 受體復合物（p75NTR/NgR1/LINGO-1 TROY/NgR1/LINGO-1）激活下游Rho-A/Rho激酶（ROCK）Calcium 信號途徑，進而擾亂肌動蛋白骨架介導生長錐 ，抑制軸突生長，發揮調控神經元可塑性等方面的作用8， 2000 年，Schwab 和 Strittermatter胞，Nogo-A 還表達于大腦、脊髓和外周神經節的某些神經元中4，5。2003年Schwab的研究進一步證明Nogo-A有表達于發育中的神經元。10Nogo 在視神經Nogo 在視神經損傷方視神經概述（屬于中樞神經Schwan

9、n 細胞 ，但有髓鞘存在。因此，視神經不是周圍神經，而是中樞神經的一個向膠質細胞在損傷條件也發揮與其他部位膠質細胞類似的作用13。其損傷與再Nogo-A在視神經再生 研究證明，可通過 刪除、抑制可溶性 NgR Rho-A/Rho 激酶信號通道、提高鈣離子濃度、抑制Nogo-66等方法消除Nogo CNS 細胞的軸突 Nogo-A mRNA,3dNogo-AmRNA高表達現象。15，16，17還有學者通過視神經橫斷大Nogo-A mRNA 14d 后出現高于 7d 的表達7d時出現表達減弱現象。Nogo-A NgR 的表達則與Nogo-A mRNA 的表達不同步。18 國外學者對這方面的研究結果

10、也顯示Nogo-A mRNA 的免疫陽性反應出現在視神經損傷部位的周邊但是 期呈現低表達。19 此方向的研究而為接下來的科學理論研究提 準的數據與結果，并且臨床治療提供新方向SavioT,Schwab ME. RatCNS whitematter, butnot graymatter,is nonpermissive for neuronal cell adhe and fiber outgrowth J. J Neurosci, 1989, 9(4): BareyreFMHaudenschildBSchwab MEet alLong-lastingsprouting and gene exp

11、res changesinduced by themonoclonalantibody IN-1 headultspinal cordJJ Neurosci，2002，22:7097-, 等. 中樞神經系統軸突再生抑制蛋白J. 生理科學進2004，35（4：31Chen MS, Huber AB, van der Haar ME, et al. Nogo-A is a myelin- asso ted neurite outgrowth inhibitor and an antigen formonoclonal antibody IN- 1. Nature, 2000, 403: 434-4

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17、變化及意義. 醫學雜志，2008，19(5) :326329對Nogo-A19David對Nogo-A19David t,R.S.Coffin,R.K.Prinjha,etal.MolecularandCellular Neuroscience 24 (2003) 10831102Nogo-A在受傷組織部位的濃度以及探討其與損傷參與表達Nogo-A的少突膠質細胞的數量以及探討其與損傷天數的關系；Wistar大鼠60只，將其隨機分為A（10只、B（25只、C（25 只）60 只；A 組為空白對照組，B 組為半實驗組，C 組B組的小鼠的右眼眼神經，左眼只 眼神經C 組小鼠的雙眼的眼神經；A 組小鼠

18、只 眼神經。具體操作方法如下對小鼠視神經采用夾傷，常規腹腔內注射 0.15%戊巴比妥鈉，注射標準為 1mL/kg。在手術顯微鏡(OMS-110,Topcon)下進行手術操作,在上眼瞼緣 做垂直切口向上延伸 1cm 后,再做橫行切口,長約 1cm,整個切口呈“T”形。剪開穹窿部結膜,沿上直肌方向分離,尋找視神經。剪開視神經 ,40g 視神經損傷夾 (OX60,德國)在球后 2mm 處垂直于視神經水平軸造成視神經損傷,夾持時間為 取出大鼠眼球,分離視神經，自 插管入升主動脈，剪開右心耳，自插4%多聚 200mL進行內固定。自大鼠顱骨后緣用止血鉗咬開骨壁，逐步向前推進，注意不要損傷腦組織，充分 眶壁。剪開角膜緣結膜,向后分離至視神經,咬除上方和兩側眶骨, 分離視神經,在視神經進顱處為視神經的最細處,周圍為骨所包圍,要 咬除其周圍骨壁。用顯微無齒鑷輕輕將其托出,在多聚 中過夜。 ,做HE染色于光鏡下觀察不同損傷測定Nogo-A測定表達Nogo-A對表達Nogo-A對表達Nogo-A,