1、雪靈芝提取物對體外誘導肝細胞脂肪變性的影響【摘要】目的討論雪靈芝提取物對體外誘導肝細胞脂肪變性的影響。方法以人肝L-02細胞作為研究對象，用四環素建立肝細胞脂肪變性模型。將實驗分為誘導組，繼續誘導組、脫離誘導組，用油紅染色觀察細胞形態和細胞內脂滴的形成情況，并測定細胞內甘油三酯(TG)含量的變化。結果雪靈芝提取物(2060gl-1)可明顯降低細胞內TG值，并呈劑量依賴性。結論雪靈芝提取物通過減少細胞內TG的生成從而阻止肝細胞脂肪變性。【關鍵詞】雪靈芝;四環素;甘油三酯Abstrat：bjetiveTstudytheeffetsfArenariakansuensisextrats(AKS)nhe

2、patytesteatsisinduedbytetraylineinvitr.ethdsSteatsisdelfhepatytesestablishedbyaddingtetraylinetthegringL-02ellstrain.Lipiddrpletsinthehepatyteserebservedbyilredstainingandthententftriglyeride(TG)inhepatytesaseasuredithanalyzedkit.ResultsAKS(2060gl-1)nentratindependentlydereasedthelevelfTGinhepatytes

3、.nlusinAKSanpreventhepatytefattydegeneratinviainhibitingTGprdutin.Keyrds：Arenariakansuensis(AKS);Tetrayline;TG非酒精性脂肪肝(nn-alhlifattyliverdisease,NAFLD)是一種無過量飲酒史(每周飲酒折合酒精量小于40g)、以肝本質細胞脂肪變性和脂肪儲積為特征的臨床病理綜合征1。隨著人民物質生活程度的進步，生活方式和飲食構造發生了顯著的改變，再加上科學技術的飛躍開展，發現和被檢測到的NAFLD患者逐年升高。由于NAFLD是肝硬化、肝癌的重要病因2，3，所以對其進展深化

4、地研究具有非常重要的意義。雪靈芝(Arenariakansuensis，AKS)系石竹科蚤綴屬多年生草本植物，藏藥名為阿仲嘎保，分布于西藏、青海、四川、甘肅，是一種極為珍貴的藏藥資源，有悠久的藥用歷史4。以全草入藥，性味甘寒，有清熱解毒、利膽退黃、通淋止痛的作用，主治流感、黃疸、肺炎、筋骨疼痛、淋病等，還具有抗缺氧成效5和對酒精性肝損傷有保護作用6。本實驗研究了雪靈芝提取物對四環素誘導的脂變細胞的影響，為進一步開發雪靈芝保健產品提供理論根據。1材料與儀器1.1儀器2培養箱(美國FrasientifiIn公司)，倒置顯微鏡(日本lypus公司)，酶聯免疫檢測儀del-450(美國Bi-Rad公司

5、)，旋轉蒸發器(RE-52型，上海亞榮儀器廠消費)。1.2試劑雪靈芝，由西藏阿仲嘎保生物制品提供;1640培養液購自賽默飛世爾生物化學制品(北京);血清購自海克隆生物化學制品(北京);四環素(實驗室用)購自生工生物工程(上海);油紅購自美國Sina公司;四甲基偶氮唑鹽(TT)試劑盒購自美國Aers公司;甘油三酯(TG)測定試劑盒購自浙江東歐生物工程。2方法2.1肝細胞培養人正常肝細胞株L-02，購自中國科學院上海生命科學研究所，用含10%胎牛血清1640培養基傳代培養。2.2雪靈芝提取物的制備將KAS全草粉碎，以6倍量的95%乙醇加熱回流提取3次，1h/次，合并提取液，濃縮枯燥得AKS乙醇提取

6、物。殘渣揮干乙醇，用6倍量的蒸餾水加熱回流提取3次，1h/次，合并提取液，濃縮枯燥得AKS水提取物。2.3四環素濃度確實定將處于對數生長期的L-02細胞調整濃度為5104個/l培養于96孔板中，分別參加不同濃度的四環素(見表1)，用TT7比色法測定細胞增殖情況(以吸收度D值表示)。結合細胞形態觀察，選擇對細胞活性影響小，不會導致細胞裂解死亡的濃度作為誘導細胞形成脂肪變性的最正確濃度。2.4雪靈芝提取物濃度確實定將處于對數生長期的L-02細胞調整濃度為5104個/l培養于96孔板中，分別參加不同濃度的雪靈芝提取物(見表2)，用TT比色法測定細胞增殖情況(以吸收度D值表示)。結合細胞形態觀察，將對

7、細胞活性影響小，不會導致細胞裂解死亡的濃度定為最高給藥濃度。2.5肝細胞脂變模型的建立將處于對數生長期的L-02細胞分為兩組，即：對照組、誘導組，使每組細胞濃度均為5104個/l。對照組：用正常培養基培養;誘導組：每毫升正常培養基中加四環素12g培養。在各實驗條件下培養48h，搜集細胞凍融液，嚴格按照TG試劑盒規定操作，測定其中TG的含量。制備油紅染色8標本，觀察細胞脂滴數的變化。2.6雪靈芝提取物對肝細胞脂變模型的影響將處于對數生長期的L-02細胞分為3組，使每組細胞濃度均為5104個/l。誘導組：損傷同時加藥治療48h;繼續誘導組：先損傷48h，再在損傷的同時加藥治療48h;脫離誘導組：先

8、損傷48h，再加藥治療48h。每組內均設有空白對照、模型、陽性對照及高、中、低3個劑量組，在各實驗條件下搜集細胞凍融液，嚴格按照TG試劑盒規定操作，測定其中TG的含量。用100gl-1煙酸作為陽性對照藥。2.7數據處理所有數據均以s表示，采用方差分析進展統計處理。3結果3.1四環素作用濃度確實定觀察細胞形態發現，正常肝細胞為多邊形，胞膜完好界限清楚，細胞漿豐富。四環素15gl-1組細胞數量與正常細胞相比根本不變，低倍鏡下可見局部細胞形態有少許變化，但漂浮壞死細胞較少。30gl-1組細胞增大變圓，數量有減少。120gl-1組細胞多呈圓形或橢圓形，數量大大減少，細胞膜不完好，有破損(圖13)。TT

9、實驗檢測結果提示：四環素濃度超過30gl-1時吸收度(D值)下降明顯，對細胞增殖影響力較大(表1)，再根據相關文獻9報道，選擇12gl-1作為四環素造模劑量。表1TT法檢測四環素對肝細胞生長活性的影響(3.2雪靈芝提取物的濃度確定TT檢測結果提示(表2)，當AKS醇提物濃度超過80gl-1時，吸光度(D值)下降明顯，對細胞增殖影響較大，AKS水提物出現了濃度越高，細胞增殖才能及活性越強的特點。再結合預試結果，將雪靈芝提取物的實驗濃度定為20，40，60gl-1。表2TT法檢測雪靈芝提取物對肝細胞生長活性的影響3.3油紅染色光學顯微鏡觀察正常L-02細胞，細胞內僅可見點狀散在紅色脂肪滴(圖4)，

10、經12gl-1四環素離體誘導48h后，細胞內出現大量聚集成顆粒狀的紅色脂肪滴(圖5)。而正常L-02細胞經60gl-1雪靈芝提取物與12gl-1四環素共同培養48h后，細胞內脂滴與模型細胞相比有所減少見圖67。轉貼于論文聯盟.ll.圖4正常細胞(100)圖5模型細胞(100)圖6AKS水提物(100)圖7AKS醇提物(100)3.4肝細胞內TG含量的測定實驗結果說明(見表2)，各組加四環素的模型細胞比不加任何藥物的正常對照細胞胞漿內的TG值明顯升高，參加煙酸的陽性對照細胞與模型細胞相比細胞內TG含量明顯降低。各組給予雪靈芝提取物處理后，細胞內TG值均出現了明顯的降低。繼續誘導組細胞內TG值與模

11、型細胞相比，差異明顯(P0.05)，脫離誘導組細胞內TG值降低最為明顯，說明只要停頓向培養液中加造模藥，細胞內累積的甘油三酯可以自行降低，這與治療脂肪肝首要在于去除病因的理論是一致的。AKS醇提物在3組實驗中均表現出較好的降脂作用(高劑量與模型組比擬，P0.01)，且各劑量之間存在著一定的量效關系。AKS水提物在3組實驗中，中劑量(40gl-1)的降脂作用強于高、低劑量組(P0.01)。表3AKS對脂變細胞TG含量的影響4討論本實驗采用四環素制備肝細胞脂變模型，四環素屬于抗生素類化學藥物，該藥脂溶性較好，具有肝毒性，能很好地浸透到大多數組織和體液中，且較易進入細胞內10。四環素引起脂肪肝的機制

12、是抑制體內蛋白質的合成，特別是肝的載脂蛋白的合成，使肝內VLDL分泌發生障礙，從而不能使肝內TG運出肝細胞外，脂質以脂滴的形式聚于細胞內置網和高爾基復合體內。脂質及TG含量增加，肝臟脂質過氧化反響也增強，肝組織學檢查顯示，肝細胞產生明顯的小泡性脂肪變性，符合非酒精性脂肪肝病理學研究結果11。其抑制蛋白質作用機制可能通過抑制肝細胞線粒體DNA復制或干擾DNA轉錄，使RNA合成減少，從而使RNA翻譯成載脂蛋白的量減少。通過抑制肝內TG的轉運及肝細胞線粒體對脂肪酸的-氧化，從而誘發肝細胞脂肪變性。本實驗將雪靈芝提取物作用于離體細胞模型，共分為3組：誘導組，損傷同時加藥治療2d;繼續誘導組，先損傷2d

13、再在損傷同時加藥治療2d;脫離誘導組，先損傷2d再加藥治療2d。誘導組可以考察藥物對脂肪肝的預防與減輕作用，繼續誘導組和脫離誘導組可以考察有化學損傷因素存在或曾經服用肝毒性藥物造成肝損害后，藥物對肝細胞的治療與保護作用。由脫離誘導組實驗結果可知，一些高脂血癥的患者不用馬上服用降脂藥，首先應該停頓使用或接觸具有肝毒性的化學物質，通過中藥保健品或單純飲食療法即可獲得痊愈。目前對NAFLD的治療臨床上多采用西藥治療，主要分為：HG-A復原酶抑制劑、膽汁酸螯合劑、苯氧芳酸類、煙酸類等。西藥對于高脂血癥患者具有起效快、作用強的特點，但這些藥物對人體均有不同程度的毒副作用，長期服用經常會出現不良反響，而采

14、用傳統中藥治療脂肪肝，能有效防止并發癥，減少由藥物引起的不良反響，研究和開發降脂中藥有良好的前景和重要的意義。雪靈芝中已經說明構造的19種化合物大局部是脂溶性較高的12。其中三萜皂苷、環肽、生物堿(-咔波啉)、阿魏酸被認為是雪靈芝中重要的活性成分。近年來，三萜皂苷、環肽類化合物在抗腫瘤、免疫調節、抗病毒、抗菌等方面的作用，已引起了廣泛的關注13。本實驗對雪靈芝醇提和水提物進展了研究，認為雪靈芝醇提物具有明顯的降低脂變肝細胞內甘油三酯的作用，進一步研究雪靈芝中的有效成分，可以開發出新的有價值的降脂藥物。【參考文獻】1范建高.酒精性和非酒精性脂肪肝性肝病J.中華肝臟病雜志，2022，11(11)：

15、692.2FarrellG,LarterZ.Nn-alhlifattyliverdisease:frsteatsistirrhsisJ.Hepatlgy,2022,43(2):S99.3HaiS,KubS,ShutT,etal.Hepatellulararinaarisingfrnn-alhlisteathepatitis:reprtftasesJ.SurgTday,2022,36(4):390.4李明，伍賢學，成麗.藏藥雪靈芝研究進展J.中草藥，2022，38(11)：附1.5張麗，黎霞，黃葉梅.雪靈芝對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用J.四川師范大學學報(自然科學版)，2022，30(3)：395.6趙鵬，李彬，姚思宇，等.雪靈芝對酒精性肝損傷保護作用的實驗研究J.中華中西醫雜志，2022，17(4)：1901.7馬金霞.TT比色法用于腫瘤細胞體外藥物敏感性試驗的檢測J.臨床檢驗雜志，2002，20(2)：104.8杜卓民.實用組織學技術.第2版.北京：人民衛生出版社，1998：318.9蘇寶亮，陳真，徐厚明，等.肝細胞脂肪變性模型形態的研究J.中國醫科大學學報，2022，35(4)：