1、食用菌栽培課件24第九章菌種的分離、提純、擴大、培養與保第一節菌種的分離與提純進入課文三、菌種的提純如果分離的菌種已污染，可以使用相應的辦法除掉。 (一)使用抑制培養基(二)排除細菌或酵母菌污染(三)排除霉菌污染(四)菌絲再提純(五)單根菌絲提純技術(六)菌絲生長速度、生長量的測試使用抑制培養基從腐朽嚴重的木材塊上分離菌絲時，新生菌常會伴隨著各種各樣的細菌、霉菌出現。在這種情況下，可向培養基中加入選擇性強的抗菌劑，如涕必靈(TBZ)或多菌靈(MBC)。抗細菌的如培養基加入30mg/L左右的四環素或氯霉素等，以抑制細菌的出現。此外，也可以在培養基內添加鏈霉素3040mg/L或金霉素2030mg/

2、L或高錳酸鉀50mg/L。返回排除細菌或酵母菌污染 組織分離，基內菌絲分離將分離物接種在無冷凝水、硬度較高的斜面培養基上，再降低培養溫度至1520。利用某些大型真菌在較低的溫度下，菌絲生長速度比細菌菌苔蔓延速度快的特點，用尖細的接種針切割菌絲的前端，轉接到新的試管斜面培養基中培養，連續23次就能獲得所要的純菌絲。也可以用接種鏟將斜面污染的細菌菌苔鏟除掉，打破試管，挑取內部有基內菌絲的瓊脂塊，移入無冷凝水的培養基上。適合于菌齡較長、被好氣性細污染的試管。 返回排除霉菌污染分離培養后，若發現有色的霉菌小斑點污染，最好放棄。如由同一材料分離得來的，每支試管都是如此，那就要重新分離。如果霉菌菌落剛出現

3、孢子，孢子尚未成熟，尚未變色，則可采用前端菌絲切割法提純。如果霉菌菌落的顏色已加深，則意味著眾多的孢子已成熟，若采用前端菌絲切割法提純意義不大。可將1%多菌靈的濕濾紙蓋在霉菌的菌落上，以防止提純時，試管振動使孢子擴散。然后，用火焰滅菌過的接種鏟將分離物表層鏟掉，隨之，用另一接種針鉤取分離物位置下的基內菌絲。霉菌的污染還常見于棉塞上，這多是棉塞受潮所致。返回(四)菌絲再提純采用切割法或基內菌絲挑取法提純后，一般都能獲得純菌絲，但也偶有提而不純的現象發生，這就必須對菌絲再提純。為了判斷提純后菌落的純度，將菌絲塊接入瓊脂培養皿平板培養基內，如果純種菌絲，菌落會逐漸向四周輻射狀散開，外緣整齊，如果菌種

4、不純，混有其它絲狀真菌，菌絲生長速度不一，菌落外緣便參差不齊，培養皿內產生的色素也分布不勻。再提純時，對菌落中生長速度較為一致的部分施行菌絲前端切割，移植至新的培養基。返回單根菌絲提純技術將懷疑混有雜菌的菌絲，用尖細的接種針切割帶有培養基的菌落前端23mm2的薄片，移接入PDA培養基，每支試管可移接數點，放在所分離的菌種的最隹溫度下培養，隔12小時后，在陽光下觀察各接種塊菌絲生長的狀態。選取菌絲顯現出分叉狀，用鋒利的接種針仔細地將貼在培養基面上的單根菌絲帶培養基切割下來，移入PDA培養基內，塞上棉塞，再用放大鏡觀察判斷是否為單根菌絲，則應繼續培養1224小時后，再重復上述過程。適合于菌絲生長速

5、度快，密度不高的菌類，如草菇 返回第二節菌種的擴大、培養一、菌種的擴大 經分離、提純、出菇試驗確定為生產用種后，為了適應生產栽培需要，要進行菌種的擴大、繁殖。二、貼標簽 無論是菌種分離、提純，還是一級、二級或三級種的擴大，無菌操作后應馬上貼標簽。三.菌種培養 培養室內溫度、濕度、光照、空氣等條件彼此聯系，互相影響。 (一)一級菌種的擴大培養1.單一菌絲類型一級菌種的擴大培養(1)單一菌絲類型一級菌種接種無菌操作要點a在無菌箱內，將待接的斜面試管(無冷凝水)、購來或自行培養好的一級原始種，酒精燈、火柴盒、接種針等放入接菌箱內。下一頁單一菌絲類型一級菌種接種無菌操作要點b按接種箱操作規程進行消毒。

6、c打開工作燈，用75%的酒精棉球擦雙手，伸入接種箱內，再擦接種工具。d點燃酒精燈。5右手持接種針，將頂端燒紅，并將整支接種針過火幾次。6用左手手指和手掌托持兩支試管，食指與中指與中指夾持一級原始種，無名指和小指夾持空白斜面培養基試管。用右手無名指和小指夾持原始種棉塞，小指和魚際夾持空白試管棉塞。火焰封口雙管。下一頁(二)二級菌種的擴大培養1.單一菌絲類型二級菌種的擴大培養將滅菌好的二級菌種培養瓶數十瓶(視接種箱的大小)連同接種工具、一級菌種放入接菌箱內，按常規進行熏蒸消毒。按無菌操作要求，在接種箱內將接種針進行火焰滅菌、冷卻。將一級菌塊劃成1大小的接種塊，用接種鉤鉤住，彎鉤朝上，左手持二級菌種

7、瓶橫放，用右手小指和魚際抓住棉塞，左手將二級種瓶反時針旋轉后退，撥脫棉塞，火焰封口。 下一頁二級菌種的擴大培養將已鉤取的菌種塊抖入二級菌種瓶，塞上棉塞。經搖二級菌種瓶，使菌種塊滾至培養基面中央。按此法每支試管可接二級菌種瓶810瓶。操作時注意：不能將二級種瓶口朝上，同時注意撥出棉塞后，不能碰到其它器具及接種箱壁。若接種塊掉在箱底上，應棄之不用。每接完一支一級種，接種工具應重新火焰滅菌。待整箱二級菌種瓶全部接完后，開啟箱蓋。下一頁2.混合型二級菌種的擴大培養混合型原種的接種和單一型二級種接種的方法大同小異。顯著不同的是：銀耳一級種培養基的前后端應棄之不用，僅要繡球狀銀耳純白菌絲及附近長有黑灰色羽

8、毛狀菌絲的菌塊。按上述方法，連同培養基整塊鉤取出，移入菌種瓶內，每支試管僅能接一瓶二級菌種，不能貪多。接完二級菌種，用手拍打，振動瓶，使一級菌種塊純白菌絲面朝上，千萬不能朝下，否則報廢。 下一頁混合型二級菌種的擴大培養培養溫度初期2728，促使羽毛狀菌絲蔓延，56天之后馬上降至2223，這是純白菌絲生長適宜的溫度。接種后培養2025天，接種塊逐漸形成膠質化的原基團，并吐出水珠，適合作為段木銀耳種，菌齡控制在4045天。若在同樣的溫度下，1213天膠化，并逐漸開片，吐黃水，則適合作為代料棒栽銀耳種，菌齡控制在1518天內使用。 下一頁混合型三級種的擴大培養接種匙鏟接量只需蠶豆大小，移入三級種瓶內

9、，每瓶二級菌種可接34瓶三級種，其余棄之不用。因銀耳是混合型的，純白菌絲僅生長在表面淺層培養基內，又由于羽毛狀菌絲繁殖十分迅速，所以銀耳培養基裝料只需裝1/4瓶即可。移接中注意防止燙傷菌絲。返回二、貼標簽一級種試管標簽應貼在前端，既不能遮住棉塞，又不遮住培養基斜面的部位，以免在檢查棉塞和斜面是否污染時千萬不便；二級、三級種標簽多貼在瓶上部側壁；塑料袋難貼標簽，可將標簽貼在塑料套環上。出可用記號筆將標簽內容寫在塑料袋外。標簽內容 注明菌種名稱、菌株號、接種者或單位接種日期四項。菌種名可用中文注明，也常用拉丁文學名的縮寫注明。習慣上常用的縮寫字母。 下一頁貼標簽菌種名 多寫在標簽的第一行，字體較大

10、。菌株號 是某一菌種特定菌株代號，更多的是用有一定代表意義的數字表示，它一般要求用較小號的字符寫在菌種之后。購買一級菌種代號不宜自行更改。接種者或單位 是注明該菌種制作責任人。接種日期 菌種使用時作為推算菌齡的依據。科研上，育種上的標簽一般較復雜，內容較多，除上述內容外，還要注明分離方法如孢子分離(S)、組織分離(T)、基內菌絲分離(M)等。 返回菌種培養培養室內溫度、濕度、光照、空氣等條件彼此聯系，互相影響。 1.溫度控制 培養室內溫度應根據季節變化進行控制，并結合培養階段確定培養溫度。(1)冬季保溫、夏季降溫 冬季氣溫低，菌種培養室要有保溫措施，使培養室溫度保持在25左右，不保溫浪費然。夏

11、季菌種呼吸產生熱量，使培養室溫度升高，可達45，在這個溫度下培養的菌種，菌絲弱，有時還能造成菌種死亡，所以要有降溫措施。(2)變溫培養 大多數的菌種菌絲體生長階段25生長最快，20以下菌絲最壯。我們目前大多培養菌種采用初期培養溫度2628，這時氣溫雖然2628，但菌種瓶或袋內溫度低，有利于瓶或袋內栽培料吸溫，菌種恢復的快；菌種培養中期(菌種恢復已封面并向下生長幾厘米)培養溫度控制23，這時袋內溫度比氣溫高23，袋內溫度則25，菌絲生長最快；培養后期溫度控制在20以下，菌絲生長最壯。下一頁菌種培養2.濕度控制 培養室濕度最好控制在RH50%，不宜太濕，濕度過大，霉菌易繁殖。3.通風換氣 食用菌是

12、好氣性真菌，菌絲體生長階段需要充足的氧氣。通風換氣消除呼吸過程產生的二氧化碳，通過氣體擴散得到氧氣。同時通過通風換氣排除呼吸過程產生的熱量。4.光 菌絲體生長階段不需要光線。培養室盡可能暗。5.污染的檢查 培養過程中塑料袋制種最好不要經常檢查是否有污染，檢查菌種時常常手提袋口，袋 內吸氣造成污染。檢查用工作燈照射，發現有污染的提出。下一頁第三節 菌種質量的鑒定菌種質量的優劣是一個非常嚴肅的問題。菌種生產必須首先保證質量。一.一級菌種鑒定 一是鑒定所分離得到的菌株或從外地引進的菌株是不是我們所需要栽培的菌株。二是判別所得到的菌種是否優良。常見幾種食用菌一級菌種主要特征(見附表)香菇、木耳、蘑菇、

13、草菇、金針菇。下一頁二.二級或三級種的鑒定(一)木腐菌類的鑒定除銀耳外，以木屑作培養基的菌種，外觀上，菌絲潔白，濃密，木屑被分解后，逐漸從棕褐色轉為淡黃色，若瓶內的菌絲柱和瓶壁脫離，說明培養基偏干，培養室內空氣相對濕度偏低或菌種老化。有時瓶底出現黃色分泌液，說明菌種已完全老化。若瓶袋內下半部木屑未分解，仍為棕褐色，說明培養時間不足，需在培養，如菌種瓶或袋底份量較重，菌絲前端密集，生長停滯，形成抑制線，這是由配料過濕所致。下一頁(二)草腐生菌類二、三級菌種的鑒定蘑菇和草菇均屬于草腐生菌類。其二、三級菌種形態差異較大，蘑菇又因菌株不同，出現較大的差別。蘑菇氣生型菌株菌絲旺盛，雪白，蔓延過程菌絲前端

14、呈扇形展開，當培養基過濕時，極易形成塊狀的菌皮。貼生型的菌株菌絲極為纖細，呈藍灰色，不易形成菌被。草菇菌種的菌絲為透明狀，銀灰色，生長迅速，后期出現紅褐色的厚垣孢子。厚垣孢子少的，一般出菇的子實體大，反之則小。下一頁(三)菌種的選購具體的選購方法歸納起來就是“提、聞、看”提 用手提棉塞，看棉塞松緊是否適度，過松過緊都不行。聞 聞菌種的氣味，若菌種散發出酸、霉、臭味，則說明菌種已污染，不是純培養菌絲。純培養菌種具有特殊香味。看 看菌種的外觀，看是否破管、破瓶、破袋，再看菌種是否否“純、正、壯、潤”具體來說純度高，不能有雜菌；菌絲體色澤正，多數種類的菌絲應純白、原種、栽培種菌絲連結成塊，無老化、變

15、色、吐黃水、長子實體原基等現象，菌絲粗壯，長勢強；培養體要濕潤，含水量適宜，不干縮脫壁。下一頁三、礦物油法此法是將液體石蠟油加入欲保存的菌株斜面上。液體石蠟油先經1211小時高壓滅菌。為了除去高壓滅菌時混入的水分 ，再經150170干熱1小時，待水分完全蒸發，石蠟呈透明狀為止。從干燥箱中取出，冷卻至室溫。使用時將無菌液體石蠟油倒入保存菌種的試管，至離瓊脂上部1處豎立保存。注入過多時，保存后成活率低，反之，瓊脂易干燥。使用時用接種鏟從斜面上鏟取一小塊菌絲塊，原管仍可以重新封蠟繼續保存。剛從液體石蠟油中移出的菌種菌絲體常沾有石蠟油，生長較弱，要重新移植一次恢復正常生長。保存溫度10以上室溫。下一頁四、安瓿瓶保存孢子法國外用安瓿代替試管，在室溫下，將蘑菇孢子典藏在真空干燥的安瓿瓶中3年，還具有活力。也可以用1060指形管或用10安瓿瓶作為容器收藏香菇孢子。本方