1、哈蟆油質(zhì)量控制方法【摘要】根據(jù)歷史文獻(xiàn)和現(xiàn)代哈蟆油研究的成果，進(jìn)展整理、分析、總結(jié)，闡述了哈蟆油質(zhì)量控制現(xiàn)狀和方法，從傳統(tǒng)的基源鑒別開展到性狀鑒別、顯微鑒別、色譜法、光譜法以及生物鑒定法，尤其是現(xiàn)代開展較好的氣相色譜、高效液相色譜、電泳色譜、PR技術(shù)以及指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用使哈蟆油的研究進(jìn)入了一個(gè)更高的科學(xué)領(lǐng)域。對(duì)哈蟆油的鑒定手段不斷的完善，為進(jìn)步哈蟆油質(zhì)量控制和鑒別真?zhèn)翁峁┝烁鶕?jù)。【關(guān)鍵詞】中藥；哈蟆油；質(zhì)量控制方法藥材的真?zhèn)舞b別和品質(zhì)評(píng)價(jià)是臨床應(yīng)用、成藥制備、中藥科研不可缺少的前提條件。我國(guó)藥材品種繁多，據(jù)統(tǒng)計(jì)約有一萬(wàn)二千多種，由于地大物博，南北差異，同名異物、同物異名的混淆品種極多，療效各

2、不一樣。而且中藥的有效成分和環(huán)境、產(chǎn)地、采收季節(jié)等因素也有很大關(guān)系；加之近年來，假冒偽劣中藥充滿市場(chǎng)，為控制中藥質(zhì)量、保證臨床用藥平安和有效，中藥鑒定技術(shù)由傳統(tǒng)的性狀鑒別，如眼觀、鼻聞、口嘗、手摸升華、水火試等，對(duì)藥物的形狀、大孝輕重、顏色、外表特征、折斷面紋理、氣味、黏性、酸堿性等進(jìn)展正確鑒別和描繪，到現(xiàn)代的色譜法、光譜法、X射線分析法、熱分析法、分子生物學(xué)技術(shù)等。哈蟆油vidutusRanae為蛙科動(dòng)物中國(guó)林蛙RanateprariahensinensisDavid雌蛙的輸卵管，經(jīng)采制枯燥而得。據(jù)?中國(guó)藥典?2022年版部收載，具有補(bǔ)腎益精，潤(rùn)肺養(yǎng)陰的成效，用于陰虛體弱，神疲憊力，心悸失眠

3、，盜汗不止，癆嗽咳血1等病癥。隨著中藥現(xiàn)代化技術(shù)的開展，哈蟆油的質(zhì)量控制技術(shù)也在不斷的進(jìn)步。1基源鑒定法基源鑒定法就是應(yīng)用植物、動(dòng)物或礦物形態(tài)和分類學(xué)等方面的知識(shí)，對(duì)中藥的來源進(jìn)展鑒定。中國(guó)林蛙的形態(tài)特征2為：體長(zhǎng)57；頭長(zhǎng)等于或大于寬，口內(nèi)鋤骨齒位于肉鼻孔前方，排列成兩短行；兩側(cè)耳無(wú)后腺；反面黃褐色，較平滑；腹面黃白色，胸骨平坦，下肢部?jī)蓚?cè)稍膨大；后肢長(zhǎng)為軀體的1.5倍。幾種蛙類的檢索：1.膝不互交21.兩膝互交32.大腿后面不具白色縱紋青蛙2.大腿后面具有一條明顯的白色環(huán)紋金錢蛙3.體平扁而稍小;脛跗關(guān)節(jié)不達(dá)眼部,雄性無(wú)聲囊黑龍江林蛙3.體略扁而稍大;脛跗關(guān)節(jié)前達(dá)眼部,雄性有聲囊中國(guó)林蛙2

4、性狀鑒別法哈蟆油呈不規(guī)那么的塊狀，彎曲而重疊，長(zhǎng)1.52，厚1.55，外表黃白色，呈脂肪樣光澤，偶有帶灰白色薄膜狀干皮。摸之有滑膩感，在溫水中浸泡體積可膨脹1015倍3。氣腥，味微甘，嚼之有黏滑感1。3顯微鑒別法董萬(wàn)超等4報(bào)道了林蛙油的顯微特征如下：加碘酊染色后，在顯微鏡下觀察，呈金黃色。腺體細(xì)胞肥大，呈長(zhǎng)橢圓形，排列整齊，細(xì)胞壁明顯，靠腺體內(nèi)腔一端較窄，細(xì)胞壁凸起，細(xì)胞核橢圓形，位于細(xì)胞中間稍偏向腺體內(nèi)腔一面，腺體底部較寬，上端較狹，呈圓錐形。腺體內(nèi)開口呈心臟形，內(nèi)凹，整個(gè)腺體布滿細(xì)小紋理。為鑒別哈蟆油與中華大蟾蜍輸卵管、明太魚精巢、瓊脂蛋白加工品、馬鈴薯甘薯的偽制品提供了根據(jù)。4理化鑒別法

5、4.1熒光檢查劉秀峰等5報(bào)道了哈蟆油干品在365n下呈黃色的熒光；乙醇浸出物在254n下呈藍(lán)白色熒光4。4.2化學(xué)定性分析據(jù)報(bào)道4蛤蟆油水浸液雙縮脲反響為深紫紅色；加茚三酮試劑，反響為深藍(lán)紫色。為鑒別真?zhèn)翁峁┝烁鶕?jù)。4.3化學(xué)定量分析1991年，劉永鎮(zhèn)等6利用哈蟆油與Fehling試劑生成沉淀的反響，定量的鑒別了哈蟆油與其偽品蟾蜍輸卵管。錢笈締等7采用蛋白質(zhì)自動(dòng)分析儀測(cè)定冰糖哈蟆油中蛋白質(zhì)的含量，探究了動(dòng)物藥制劑的指控方法。王秋雨等8采用半微量的凱氏定氮法測(cè)定了哈蟆油和青蛙油中蛋白質(zhì)的含量分別為72.8和73.8。4.4光譜分析法4.4.1可見分光光度法衛(wèi)功慶等9用美國(guó)產(chǎn)DU650分光光度計(jì)，

6、在553n下測(cè)定了哈蟆油和青蛙油中膽固醇的含量，分別為2.12，4.92g/kg，由此確定哈蟆油比擬合適中老年人服用。4.4.2紫外光譜法李明剛等10在0360n下對(duì)哈蟆油和中華大蟾蜍輸卵管95乙醇浸出物進(jìn)展了紫外檢測(cè)，結(jié)果哈蟆油9個(gè)吸收峰分別位于4，114，129，252，256，275，311，312，314n；中華大蟾蜍輸卵管8個(gè)吸收峰分別位于4，113，131，216，245，275，298，315n；王麗蘭等11紫外光譜法測(cè)定了哈蟆油中總核酸的含量為2.69%，DNA為0.130.01%，RNA為2.560.05%。2022年，作者報(bào)道了采用紫外譜線組法，對(duì)不同產(chǎn)地和不同溶劑提取的哈

7、蟆油正品和偽品的紫外及其一階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)展了檢測(cè)，為哈蟆油的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供了根據(jù)12，13。4.4.3紅外光譜法對(duì)哈蟆油的紅外光譜的報(bào)道較少，丘澤雨等14對(duì)不同產(chǎn)地的珍珠、蟾蜍、哈蟆油、冬蟲夏草、五靈脂的同種藥材進(jìn)展了比照研究，并用紅外光譜法進(jìn)展了藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別。4.4.4原子吸收光譜法和發(fā)射光譜法王秋雨等8用原子分光光度計(jì)(VARIANAa220)和等離子發(fā)射光譜儀(日立Z-8200)測(cè)定了哈蟆油與青蛙油中微量元素和重金屬的含量，結(jié)果哈蟆油與青蛙油均含有人體必需的常用微量元素,但青蛙油中重金屬Pb及Hg含量超標(biāo)。李媛媛等15采用等離子體發(fā)射光譜法對(duì)國(guó)產(chǎn)和俄羅斯產(chǎn)哈蟆油無(wú)機(jī)元素的含量進(jìn)

8、展了分析。4.5色譜分析法4.5.1薄層色譜法劉永鎮(zhèn)等15研究證實(shí),用丙酮提取物乙醚萃取后的殘留物,在石油醚醋酸乙酯41展開的薄層層析中,其Rf值為0.4，用展開劑苯乙醚甲醇1050.8，顯色劑茴香醛冰乙酸濃硫酸11002測(cè)定,效果良好。李明剛等10采用苯乙醚甲醇1050.8為展開劑，茴香醛冰乙酸濃硫酸11002為顯色劑，對(duì)哈蟆油和中華大蟾蜍輸卵管進(jìn)展了鑒別。趙文英等16用丙酮連續(xù)回流提取法，以石油醚：醋酸乙酯41為展開劑，36的乙酸濃硫酸11為顯色劑，展距20，分別在自然光及紫外光365n下，對(duì)不同來源的哈蟆油正品以及不同種類的偽品進(jìn)展了鑒別。目前，作者正在對(duì)哈蟆油進(jìn)展系統(tǒng)的薄層色譜研究，比

9、擬不同極性的溶劑和提取方法下哈蟆油的薄層效果從而建立哈蟆油系統(tǒng)的薄層色譜條件，建立哈蟆油專屬性鑒別方法。4.5.2高效液相色譜法李成義等17應(yīng)用HPL測(cè)定了哈蟆油中磷脂的含量；多年來，作者對(duì)哈蟆油的有效成分進(jìn)展了較深化地研究，已別離出了多個(gè)化合物18，其中，十六烷酸膽甾醇酯為首次從哈蟆油中提取純化出來的，作者以十六烷酸膽甾醇酯為化學(xué)對(duì)照品，利用HPL法對(duì)哈蟆油進(jìn)展了含量測(cè)定及其方法學(xué)的研究，為建立一個(gè)完好、科學(xué)的哈蟆油質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供根據(jù)19。李津明等20采用了反相高效液相色譜技術(shù)，對(duì)10批不同來源的林蛙油藥材建立了高效液相色譜指紋圖譜，從而進(jìn)步了哈蟆油的質(zhì)量控制技術(shù)。4.5.3氣相色譜-質(zhì)譜

10、法趙文英等21利用氣相色譜-質(zhì)譜法(G-S)，對(duì)哈蟆油石油醚提取物別離出的脂肪酸進(jìn)展分析，發(fā)現(xiàn)哈蟆油不飽和脂肪酸含量約占脂肪酸含量的40%；盧立明等22利用G-S對(duì)哈蟆油脂溶性局部的化學(xué)成分進(jìn)展了研究，結(jié)果說明哈蟆油中含有多種不飽和脂肪酸和奇數(shù)碳原子脂肪酸。李成義等17利用G-S法，從吉林產(chǎn)哈蟆油中檢定出9種酸。其中亞油酸的相對(duì)百分含量為36.05%,花生四烯酸的相對(duì)百分含量為1.63%。劉玉翠等23利用G-S法對(duì)哈蟆油的一組脂溶性成分進(jìn)展分析,共別離鑒定了5種酯類化合物。季怡萍24用氣相色譜(G)與氣相色譜-質(zhì)譜(G-S)聯(lián)用技術(shù)對(duì)哈士蟆油中的脂肪酸組成進(jìn)展了定性與定量分析,共鑒定出10種脂

11、肪酸并用氣相色譜法作了定量。王秋雨等8利用氣相色譜-質(zhì)譜(G-S)測(cè)定哈蟆油與青蛙油脂類物質(zhì)含量根本一致，約為6%，其中不飽和脂肪酸含量分別占其脂肪酸的77.26%和64.67%。4.6電泳分析法趙華英25采用PA-GE技術(shù),對(duì)哈士蟆油及其偽品:黑斑蛙(習(xí)稱青蛙)、中華大蟾蜍的輸卵管進(jìn)展酯酶同工酶和可溶性蛋白質(zhì)的電泳分析。結(jié)果酯酶同工酶圖譜可見：哈士蟆油共有2條譜帶，A區(qū)1條三級(jí)帶，B區(qū)1條一級(jí)帶。黑斑蛙有7條譜帶，分布在B區(qū)和區(qū)。中華大蟾蜍有2條譜帶，分布在B區(qū)和區(qū)。可溶性蛋白質(zhì)電泳圖譜。可見哈士蟆油在區(qū)有2和62條一級(jí)帶可與偽品鑒別。因?yàn)楹诎咄苤挥?一級(jí)帶，而中華大蟾蜍區(qū)無(wú)一級(jí)帶。曾明26

12、、石俊英等27采用凝膠電泳法測(cè)得哈蟆油一級(jí)帶三條，二級(jí)帶兩條，三級(jí)帶一條，為鑒別哈蟆油與其易混品種雞內(nèi)金、蟾酥等提供了根據(jù)。5生物鑒定法5.1放射性免疫分析法林紀(jì)嫻等28采用放射性免疫分析法對(duì)中國(guó)林蛙和中華大蟾蜍輸卵管中睪酮的含量進(jìn)展了分析；李成義17、白云等29先后采用了放射性免疫分析法測(cè)定了哈蟆油中激素的含量。5.2多聚酶鏈?zhǔn)椒错慞R技術(shù)楊學(xué)干等30從中國(guó)林蛙(Ranahensinensis)、中華大蟾蜍(Bufgargarizans)以及鱈魚(Gadusarephalus)等組織材料中提取DNA，擴(kuò)增出約340bp的12SrRNA基因片段，測(cè)定其序列，并參考有關(guān)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)哈蟆油的鑒別

13、引物HsL1，HsH1，用該鑒別引物擴(kuò)增蛙類原動(dòng)物的模板DNA時(shí)，只有中國(guó)林蛙和黑龍江林蛙的模板能得到陽(yáng)性擴(kuò)增，其余樣品為陰性。因此該對(duì)引物能用于哈蟆油藥材來源的鑒別，對(duì)購(gòu)自5個(gè)不同藥材商店的哈蟆油PR鑒定結(jié)果說明，現(xiàn)市售商品哈蟆油有不同的材料來源，主要因?yàn)楣∮褪怯芍袊?guó)林蛙輸卵管干制而成，這種以組織器官制成的藥材鑒定難度大，易用其它動(dòng)物相似的器官組織冒充,如黑斑側(cè)褶蛙、中華大蟾蜍、鱈魚等的輸卵管或精巢等加工品。該研究得到的鑒別引物能準(zhǔn)確地對(duì)該藥材的來源加以區(qū)別。【參考文獻(xiàn)】1國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，部S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2022：179.2嚴(yán)啟新.哈士蟆油的鑒別研究進(jìn)展及資源開發(fā)J.

14、時(shí)珍國(guó)藥研究,1997,8(1):78.3金勝基，陣燦輝.幾種中藥材簡(jiǎn)易水試鑒別法J.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2000,11(5):422.4董萬(wàn)超，張秀蓮，張寶香，等.林蛙及其油的利用概況J.特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，1998，(2):11.5劉秀峰，紀(jì)成茂.哈蟆油及其偽品的鑒別J.海峽藥學(xué)，1997,9(2):107.6劉永鎮(zhèn)，崔順錦，南善姬.蛤蟆油與其偽品蟾蜍輸卵管的簡(jiǎn)易理化鑒別J.延邊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1991,14(2):109.7錢笈締，王培麗.冰糖哈士蟆油質(zhì)量控制初探J.中成藥,1996,18(2)：43.8王秋雨，金莉莉，婁虹，等.哈蟆油和青蛙油主要營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定J.特產(chǎn)研究，2022,(4):37.9

15、衛(wèi)功慶，楊寶田，張愛武，等.哈士蟆油與青蛙油脂肪酸及膽固醇的比擬研究J.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,21(增刊):39.10李明剛，劉玉宗，宋玉蘭，等.哈蟆油及其偽品的鑒別J.特產(chǎn)研究，1992,(4):42.11王麗蘭,楊鳳和,王春霖，等.哈士蟆油核酸含量分析J.中草藥,1990，21(12)21.12王永生，姜大成，白雪媛，等.紫外譜線組法在哈蟆油偽品鑒別中的應(yīng)用J.中成藥,2022,28(9):1336.13王永生，姜大成，白雪媛，等.蛤蟆油紫外譜線組法真?zhèn)舞b別的研究J.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2022,17(11):2125.14邱澤雨，郭允珍.中藥紅外光譜鑒別方法的研究J.中成藥，1989,1

16、1(8):16.15李媛媛，胡嶸，關(guān)樹文，等.采用等離子體發(fā)射光譜法對(duì)不同產(chǎn)地哈蟆油無(wú)機(jī)元素的含量分析J.長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002,18(4):45.16趙文英，楊祝方，侯振榮，等.哈蟆油的檢查及薄層方法初探J.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997,14(1):56.17李成義，金子，王琳.G/S法分析吉林產(chǎn)哈士蟆卵油的脂肪酸J.中國(guó)藥學(xué)雜志,1994,29(1):18.18姜大成，王永生，翁麗麗，等.哈土蟆油的化學(xué)成分研究.成都：第五屆全國(guó)動(dòng)物藥和藥用動(dòng)物保護(hù)學(xué)術(shù)研討會(huì),2002：58.19王永生，姜大成，孟勤，等.HPL測(cè)定哈蟆油中十六烷酸膽甾醇酯含量研究J.中國(guó)中藥雜志，2022,30(13):990.20李津明，許婷，賈紹華，等.林蛙油的指紋圖譜J.中草藥，2022,36(4):591.21趙文英,侯振榮.蛤蟆油的化學(xué)成分J.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1996，13(4):276.22盧立明,宋少江,武勇.蛤蟆卵油化學(xué)成分研究J.中國(guó)藥物化學(xué)雜志,2001，11(4):224.23劉玉翠.哈蟆油脂溶性化學(xué)成分研究J.吉林中醫(yī)藥,2022,25(5):56.24季怡萍.哈士蟆油中脂肪酸的G、G-S分析J.分析測(cè)試學(xué)報(bào),1999,18(3):80.25趙華英，許欣榮，霍德蘭，等.哈士蟆油及其偽品的電泳鑒別J.中藥材,1998,21(3)