1、重組蛋白質藥物純化清潔驗證重組蛋白質藥物純化清潔驗證第1頁目錄清潔驗證定義法規對清潔驗證要求清潔驗證前提設備分組待清潔成份可接收程度取樣方法取樣點選擇檢驗方法特殊設備清潔驗證再驗證偏差與變更控制案例分析Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第2頁清潔驗證定義清洗驗證是用書面證據證實同意清洗規程能夠對設備進行有效清洗，并使清洗后設備適合用于產品制造或包裝，即設備內表面殘留物及微生物指標到達清潔要求所要求標準。通常清潔驗證應包含以下三個方面： 1、生產結束至開始清潔最長時間（也稱待清潔時限）； 2、已清潔設備用于下次生產前最長存放時間（也稱清潔效期）； 3、連續生產最長時間（階段性生產

2、，大小清場）。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第3頁法規對清潔驗證要求中國GMP要求（年版）第一百四十三條清潔方法應該經過驗證，證實其清潔效果，以有效預防污染和交叉污染。清潔驗證應該綜合考慮設備使用情況、所使用清潔劑和消毒劑、取樣方法和位置以及對應取樣回收率、殘留物性質和程度、殘留物檢驗方法靈敏度等原因。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第4頁法規對清潔驗證要求GMP附件 確認與驗證第三十八條 為確認與產品直接接觸設備清潔操作規程有效性，應該進行清潔驗證。應該依據所包括物料，合理地確定活性物質殘留、清潔劑和微生物污染程度標準。第三十九條 在清潔驗證中，不能采取

3、重復清洗至清潔方法。目視檢驗是一個很主要標準，但通常不能作為單一可接收標準使用。第四十條 清潔驗證次數應該依據風險評定確定，通常應該最少進行連續三次。清潔驗證計劃完成需要一定時間，驗證過程中每個批次后清潔效果需及時進行確認。必要時，企業在清潔驗證后應該對設備清潔效果進行連續確認。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第5頁法規對清潔驗證要求GMP附件 確認與驗證第四十一條 驗證應該考慮清潔方法自動化程度。當采取自動化清潔方法時，應該對所用清潔設備設定正常操作范圍進行驗證；當使用人工清潔程序時，應該評定影響清潔效果各種原因，如操作人員、清潔規程詳細程度（如淋洗時間等），對于人工操作而

4、言，假如明確了可變原因，在清潔驗證過程中應該考慮對應最差條件。第四十二條 活性物質殘留程度標準應該基于毒理試驗數據或毒理學文件資料評定建立。如使用清潔劑，其去除方法及殘留量應該進行確認。可接收標準應該考慮工藝設備鏈中多個設備潛在累積效應。第四十三條 應該在清潔驗證過程中對潛在微生物污染進行評價，如需要，還應該評價細菌內毒素污染。應該考慮設備使用后至清潔前間隔時間以及設備清潔后保留時限對清潔驗證影響。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第6頁法規對清潔驗證要求GMP附件 確認與驗證第四十四條 當采取階段性生產組織方式時，應該綜合考慮階段性生產最長時間和最大批次數量，以作為清潔驗證評

5、價依據。第四十五條 當采取最差條件產品方法進行清潔驗證模式時，應該對最差條件產品選擇依據進行評價，當生產線引入新產品時，需再次進行評價。如多用途設備沒有單一最差條件產品時，最差條件確實定應該考慮產品毒性、允許日接觸劑量和溶解度等。每個使用清潔方法都應該進行最差條件驗證。在同一個工藝步驟中，使用多臺同型設備生產，企業可在評定后選擇有代表性設備進行清潔驗證。第四十六條 清潔驗證方案應該詳細描述取樣位置、所選取取樣位置理由以及可接收標準。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第7頁法規對清潔驗證要求GMP附件 確認與驗證第四十七條 應該采取擦拭取樣和（或）對清潔最終階段淋洗液取樣，或者依

6、據取樣位置確定其它取樣方法取樣。擦拭用材料不應該對結果有影響。假如采取淋洗方法，應該在清潔程序最終淋洗時進行取樣。企業應該評定取樣方法有效性。第四十八條 對于處于研發階段藥品或不經常生產產品，可采取每批生產后確認清潔效果方式替換清潔驗證。每批生產后清潔確認應該依據本附錄相關要求進行。第四十九條 如無法采取清潔驗證方式來評價設備清潔效果，則產品應該采取專用設備生產。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第8頁法規對清潔驗證要求歐盟GMP要求 36.為確認清潔規程效力，應進行清潔驗證。應依據所包括物料，合理確實認產品殘留、清潔劑和微生物污染程度標準。這個程度標準應該是能夠到達，能夠證實

7、。 37.應使用經驗證、檢出靈敏度高檢驗方法來檢測殘留或污染物。每種分析方法或儀器檢測靈敏度應足以檢測出設定合格程度水平殘留或污染物。 38.通常只有接觸產品設備表面清潔規程需要驗證。一些場所下，還應考慮不直接接觸產品個別。應驗證設備使用與清潔間隔時間，以及已清潔設備可保留時間，并經過驗證確定清潔間隔時間和清潔方法。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第9頁法規對清潔驗證要求歐盟GMP要求 39.對于相同產品和相同工藝而言，可從相同產品及工藝中，選擇一個含有代表性產品和工藝進行清潔驗證。可采取“最差條件”方法進行單獨驗證試驗，在驗證中應考慮關鍵原因。 40.為證實方法是經過驗證，

8、通常應在3個連續批上使用該清潔規程，并檢驗合格。 41.清潔驗證不應采取“不停測試，直至清潔”方式。 42.假如實際產品是有毒物質或有害物質，在清潔驗證中，能夠例外地采取物化特征相同無毒無害物質來模擬。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第10頁清潔驗證前提廠房、設備、公用系統（水電汽等）經過驗證（最少含IQ/OQ）。設備在運行確認中，已經過核黃素試驗、風險評定或其它方法確認最難清潔部位。生產工藝流程已經確認。清潔規程已經確定，明確四個主要參數TACT，即清洗時間、清洗動作要求，清洗液濃度，清洗液溫度。有完善操作說明書。相關統計已放到現場（操作統計、取樣統計）。分析方法和檢驗儀器

9、經過驗證。（專屬性，靈敏度，精密度，線性范圍，檢驗回收率）取樣方法經過驗證。取樣回收率。對于極易溶于水殘留，如作為清潔劑氫氧化鈉，因為其溶度遠低于其溶解度，可無須進行回收率研究。依據PDA TR49，清潔驗證并不要求對生物負載與內毒素回收率進行研究。物料試劑經過檢驗合格。 操作人員經過培訓，并取得對應資質。完成試驗性工作。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第11頁設備分組設備分組能夠篩選驗證對象，降低無須要和無價值驗證工作，使驗證更有針對性。設備分組應考慮是否接觸產品活性成份，是否多產品共用，設備是否重復使用，設備清潔方法（手工清洗、自動清洗），設備材質，設備結構，設備規格。設

10、備分組策略是基于設備應在設計和可清潔性上“相同”或“相同”，“相同”或“相同”理由，應在驗證方案中給予清楚描述。Company Logo待清潔成份重組蛋白質藥物純化清潔驗證第12頁設備分組示例：直接接觸產品活性成份，多品種共用設備。驗證重點。能夠選擇最難清潔產品進行重點驗證，其它產品進行簡單確認。直接接觸產品活性成份，品種專用設備。不接觸產品活性成份設備，如接觸緩沖溶液、輔料設備。一次性使用設備。該類設備不需要清潔驗證。二次分組：按照設備材質、設備結構和清洗方法進行二次分組，對于材質、結構一致，且清洗方法一樣設備，能夠選擇規格最大和規格最小設備進行驗證，對于其余規格設備最好也進行一次簡單確實認

11、。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第13頁設備分組依據風險分析結果，結合設備選型設計比對，將化學原因和物理原因進行成組比對，選擇代表性組合進行驗證，并使用最差條件進行模擬。Company Logo待清潔成份重組蛋白質藥物純化清潔驗證第14頁設備分組設備分組驗證策略當設備相同時，能夠設計一個檢測矩陣，每次檢測時抽取幾個設備，累計完成此次全部項目標檢測，共驗證最少3次，驗證結束后每臺設備最少有1個項目被檢測1次。只要給出充分理由說明設備項目是“相同”，就沒有必要對該組中每個設備每個項目都驗證一次。為了便于管理，也能夠抽取其中3臺設備，分別進行一次完整檢測，其它設備各抽檢一次，只抽

12、檢個別項目。對于“相同”設備，要選取最差情況設備為代表，或者對設備進行歸類。比如，在容積相同但結構不一樣儲液罐中，選擇結構更復雜設備作為最差情況。在結構相同但容積不一樣儲液罐中，選擇最大和最小（代表極端情形）來進行正式驗證運行（除非某個容積能夠認定為最差情況）。對該組中其它設備（不是最差情形）選擇確認運行（最少一個批次）。待清潔成份重組蛋白質藥物純化清潔驗證第15頁待清潔成份在清潔驗證中，為全部待清潔成份都制訂程度標準并一一檢測是不切實且沒有必要。在一定意義上，清潔過程是個溶解過程，所以，通常做法是從各組分中確定最難清潔（溶解）物質，以此作為參考物質，或者依據待清潔成份共有特征，選擇一個指標進

13、行確認。待清潔成份可分為活性成份、工藝相關雜質、輔料、清潔劑、微生物（來自物料、清潔過程、環境）。活性成份可能包含產品相關雜質，如聚合體，降解物等。不一樣生產階段可能含有不一樣工藝相關雜質。比如發酵階段含工程菌及細胞碎片等，在純化階段含細菌內毒素、菌體蛋白、外源DNA等。清潔劑最常見是氫氧化鈉溶液，可能還有酸、表面活性劑等。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第16頁示例Company Logo待清潔成份分類代表性污物適用工藝設備下游和配制/分裝污物含產品可溶性鹽溶液，產品及工藝相關雜質 純化設備濃縮和緩沖液置換設備包含產品和制劑組分溶液（比如輔料、表面活性劑） 配制設備最終無菌

14、過濾設備；產品灌裝設備緩沖液制備污物 無產品鹽水溶液 緩沖液配制設備緩沖液過濾和儲存設備清潔劑污物含清潔劑包含表面活性劑酸和堿全部工藝設備重組蛋白質藥物純化清潔驗證第17頁待清潔成份最難參考物選擇單組分產品：組份=參考物原料藥直接分裝各種成份普通標準最難參考物選擇考慮原因清潔能力藥品活性成份和輔料水溶性殘留影響造成風險功效分類毒性如最難清潔物質非單一物質，則將一起作為最難清潔物質。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第18頁可接收程度清潔驗證方案中最關鍵技術問題為怎樣確定可接收程度。選擇產物殘留、清潔劑、微生物污染，以及其它任何工藝成份程度，邏輯上應該基于物料對生產流程和產品安全

15、性和純度影響而定。可接收程度通常由企業自己確定。確定可接收程度應該含有“實用性、易獲取性、可驗證性”。對于不一樣生產階段，可接收程度能夠有所區分，比如前期階段，如發酵、純化，因為后面還有純化步驟，所以其清潔標準可適當放寬。計算設備內表面積不能只考慮單個設備，而應考慮產品生產過程中所接觸整個設備鏈面積，過高預計設備表面積是保險做法。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第19頁可接收程度活性物質程度清潔劑程度微生物程度內毒素程度視覺清潔標準Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第20頁可接收程度活性物質程度：10ppm：上批產品殘留在設備里物質全部溶解到下批產品中濃度程度

16、不超出10ppm（百萬分之十）。1ppm=1mg/kg=1mg/L=110-61/1000 MinTD：上批產品殘留在下批產品活性成份不得高于最低日治療劑量千分之一。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第21頁可接收程度活性物質程度純化層析工藝含有選擇性，殘留活性蛋白難以在工藝步驟中逐步向下傳遞。在清潔劑作用下，殘留活性蛋白也輕易被分解。所以用于制劑生產階段MAC計算通常不適合用于原液生產。參考PDA TR49指南中要求，能夠選擇使用一些限制區域表面積計算殘留量，比如使用最終一步純化工藝后全部生產設備。依據相關清潔驗證指南推薦，原液生產階段，可接收標準通常為下游工藝TOC 1-2

17、ppm和上游工藝TOC 5-10ppm。對于如超濾膜和色譜填料這些產品專用材料能夠更高。重組蛋白質藥物純化清潔驗證第22頁可接收程度MAC計算公式MAC：Maximum Allowable Carryover，最大允許殘留量。MinTD：已清潔產品活性物質最小日治療劑量。MBS：使用同一設備生產下一產品活性物質最小批量。MaxDD：使用同一設備生產下一產品活性物質最大日劑量。SF：安全因子。SF=1000。重組蛋白質藥物純化清潔驗證第23頁可接收程度TOC與蛋白值關系通常清潔驗證采取TOC作為分析方法，TOC定量程度大約為100500ppb碳，與含碳量為50%約2001000ppb蛋白質數值等

18、效（基于生物制品）Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第24頁可接收程度清潔劑程度：本公司清潔劑成份包含：NaOH、NaCl和水。其中NaCl和水是人體正常成份，毒性能夠忽略。通常做法是用電導率值為其設定間接程度。氫氧化鈉可接收水平建立在毒理學殘留量計算或者是工藝參數效果之上。所以，程度是基于注射用水標準或者是稍高于這個標準（比如5 S/cm）。基于市售化學試劑毒性計算是比較極端，因為氫氧化鈉并不會以氫氧化鈉形式污染到最終產品中。假如這些化學物質以高濃度完整地污染下來，經過工藝檢驗（這么會引發PH顯著改變）也會發覺這種不符合性。所以，目標并不要求與注射用水標準一致，而是確認一個很

19、低清潔劑含量。而允許電導率程度略高于注射用水程度原因是，注射用水程度要求只是適合用于管路中循環注射用水。一旦從循環管路中取出來并經過清潔設備（尤其是經過噴淋裝置時它能夠從空氣中攝取二氧化塔），不要期望它一定會滿足WFI電導率程度。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第25頁可接收程度清潔劑程度：閱毒理學數據庫（http:，美國），NaOHLD50為40 mg/kg（mouse，ip.），含有較高安全閾值。假設NaOH對于人LD50和小鼠一致，按照成人體重為60kg計，則需要注射2.4g NaOH才能到達半致死劑量。檢測清潔劑殘留常見方法為電導率和pH。依據測試結果，25s/cm（

20、25）時NaOH濃度約為5.5g/ml。計算可得，pH為8（25）時，NaOH濃度為10-6mol/L（折合為0.04g/ml）。在電導率為25s/cm（25）或pH為8時，每支制劑產品中NaOH殘留量最大為9.35g（rhG-CSF 480g/支裝量為1.7ml/支），遠低于半致死劑量千分之一。重組蛋白質藥物純化清潔驗證第26頁可接收程度微生物程度不要預期清潔過程會造成設備無菌結果。即使設備將進行在線滅菌或者是在下一產品生產前滅菌，通常做法是評定微生物負載來確保隨即生產工藝不會被過分挑戰。只要到達普通非無菌生產微生物程度標準（1-2CFU/cm2表面取樣方法）就已經是足夠。對于沖洗取樣，一些

21、企業將利用經典WFI值（10 CFU/100毫升），而其它企業將利用100 CFU/100毫升或1,000 CFU/100毫升值。設定較高程度原因是隨即設備將進行滅菌。制訂方法下批產品原料及生產過程既不增加微生物繁殖，也不會降低微生物繁殖下批產品生產前設備在生產前不滅菌，但產品最終滅菌下批產品生產前設備在生產前需要滅菌Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第27頁可接收程度微生物程度下批產品生產前設備在生產前不滅菌，但產品最終滅菌，其微生物程度設定方法以滅菌前微生物含量程度為基礎進行計算產品無菌確保值大小與滅菌前工藝F0值以及滅菌前微生物含量相關，所以任何一個經過驗證滅菌工藝都需要

22、確定允許滅菌前微生物程度，知曉這個程度后，后面計算與第一個情況就一致。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第28頁可接收程度內毒素程度在內毒素經各個去除步驟后，內毒素對最終產品殘留量是更值得關注。內毒素通常只在最終沖洗水測定，程度設定通常是注射用水標準0.25EU/ml。對于用大腸桿菌進行細菌發酵（革蘭氏陰性細菌，在沖洗過程中能夠生產大量內毒素），在發酵和收獲步驟后清洗符合注射用水程度，是不可能完成，這種情形下，其它企業在更高水平設置內毒素程度，比如5-25 EU/ml。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第29頁可接收程度視覺清潔標準：不得有可見殘留物。依據經驗數

23、據，目檢能發覺最低殘留物程度是1g/ cm2。視覺檢驗是核實殘留物去除一個直接衡量伎倆，很輕易完成。做到每個樣品都檢。 設備表面無可見殘留物檢驗要包含兩個個別 終洗水或淋洗水無可見殘留物Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第30頁取樣方法取樣方法應依據設備類型、被取樣點材料、設備構型等綜合考慮。必要時可采取幾個不一樣取樣方法，使樣品含有更加好代表性。取樣方法應是實用，易培訓，不然清潔狀態難以監控。取樣方法:直接取樣法（目檢）、沖洗取樣、擦拭取樣、空白模擬取樣。Company LogoGM重組蛋白質藥物純化清潔驗證第31頁取樣方法擦拭取樣含有機械力，能夠取到難溶性殘留，能夠分析特殊

24、區域、難清潔區域，但有些區域無法進行取樣。應詳細要求擦拭溶劑和藥簽，藥簽濕潤程度，擦拭力度、角度、路線、擦拭面積等。最終沖洗水取樣要求待測殘留物含有良好溶解性，適合用于大面積，無法直接取樣或不能拆卸設備。取樣應要求沖洗方式和沖洗量，確保殘留物能夠溶解到沖洗水中，而且要防止大量沖洗水稀釋殘留污染物。另外，小部件還能夠拆卸后浸入浸提液取樣。Company LogoGM重組蛋白質藥物純化清潔驗證第32頁擦拭取樣TOC擦拭采樣取樣前首先目測，確保無可見殘留物。選定所要擦拭表面積。將擦拭子潤濕，然后按在取樣表面上，用力將其稍微彎曲，使棉簽整個平面接觸擦拭表面，平穩而遲緩擦拭取樣表面，詳細擦拭方法見下列圖

25、。取樣方法每個取樣部位每次采樣用1根TOC專用棉簽擦拭。擦拭完成后，將TOC專用藥簽折斷，放入40ml TOC專用瓶內，把蓋子密封好，進行編號。重組蛋白質藥物純化清潔驗證第33頁最終沖洗水取樣測外觀、電導、pH取樣要求用透明潔凈玻璃瓶取樣150ml（每項50ml），取樣前玻璃瓶用注射用水蕩洗3遍。測TOC水樣取樣要求用TOC專用取樣瓶裝滿樣品，取樣瓶在取樣前先用注射用水蕩洗3遍。檢微生物取樣要求用無菌50ml離心管取樣50ml，取樣后離心管應用封口膜密封。測細菌內毒素取樣要求用無菌無熱源注射器或離心管取樣5ml，取樣后離心管應用封口膜密封蛋白殘留量潔凈1.5ml EP管取1ml，取樣后EP管應

26、用封口膜密封。取樣方法重組蛋白質藥物純化清潔驗證第34頁最終沖洗水取樣層析柱終洗水取樣要求檢外觀、電導、pH、細菌內毒素、微生物、蛋白殘留量項目標取樣要求同上。應注意層析柱流出管道應垂直懸空，必要時，取樣前管道先用消毒酒精擦拭，排掉個別流出液后取中段樣。層析柱空白樣取樣要求檢外觀項目用透明潔凈玻璃瓶取50ml；檢蛋白殘留量/宿主菌蛋白質/外源性DNA殘留量用無菌無熱源離心管取5ml；檢內毒素用無菌無熱源離心管取5ml；微生物項目用無菌離心管取50ml ，取樣后離心管用封口膜密封。Company Logo取樣方法重組蛋白質藥物純化清潔驗證第35頁空白模擬取樣在生物制藥中，空白模擬取樣普通僅包含注

27、射用水或不含產品工藝緩沖溶液。在此取樣過程中，設備是清潔。清潔后，只使用注射用水或緩沖液運行生產流程（盡最大可能）。運行后，像任何其它清潔驗證樣品一樣，對注射用水或緩沖液進行評價，項目通常包含TOC(或總蛋白)、電導率、生物負載和內毒素，分析所制造產品殘留物是否成為任何可能污物。在原液和制劑生產中都能夠進行空白模擬運行，以論證工藝材料實際污染量。Company Logo取樣方法重組蛋白質藥物純化清潔驗證第36頁取樣點選擇選取取樣點應考慮設備最難清洗部位、關鍵部位、最有代表性部位、結構材料不一樣部位、取樣點方便性和重現性、設備總尺寸。對于擦拭取樣，通常不可能擦拭設備全部表面，所以，應該選擇設備最

28、差區域作為取樣點。這些區域應在清潔難度和殘留水平方面代表著對清潔規程最大程度挑戰，比如：人孔、料斗底部、槳拌槳葉底部和閥門周圍。假如進行微生物取樣，取樣計劃應包含微生物可能最差區域，比如：較難靠近地方以及可搜集水排水區域。微生物和化學取樣應在不一樣區域進行，測試方案中應包含設備及其取樣點描述或圖表。對于最終沖洗水取樣，取樣時要從設備專用取樣口或者產品出料口取樣。Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第37頁檢驗方法特異性：活性成份色譜分析：HPLC,GC,高效薄層色譜（HPTLC）是非常靈敏和有效。ELISA：對于生物藥非常有效，不過昂貴、費勁。電泳：靈敏度較低非特異性UV光譜：有適度特異性，不需要定量檢測。TOC:針對通用污染物或總蛋白。總有機碳分析儀是非常靈敏，但不是特定。應該和pH與電導率一起使用。pH：請氫離子非常敏感。用于清潔程序中酸和堿追蹤。電導率：對全部離子敏感。（當TOC、pH和電導率聯合使用時，在清潔驗證分析方法中被證實是非常有效。）內毒素及微生物Company Logo重組蛋白質藥物純化清潔驗證第38頁特殊設備清潔驗證特殊設備清潔驗證層析柱層析填料結