1、dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第1頁(yè)二、方法與過(guò)程 1.制雞血細(xì)胞液（活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀取得）0.1g/mL檸檬酸鈉100mL活雞鮮血180mL500mL燒杯中，玻棒攪拌，離心、分離或靜置沉淀。2.提取DNA。取血細(xì)胞5-10mL20mL蒸餾水，用玻棒沿一個(gè)方向快速攪拌。紗布過(guò)濾：濾液中含DNA和其它核物質(zhì)，如蛋白質(zhì)。原理：血細(xì)胞細(xì)胞膜、核膜吸水脹破，玻璃棒快速攪拌，機(jī)械加速血細(xì)胞破裂。.提取血細(xì)胞核物質(zhì)：.溶解核內(nèi)DNA： 濾液2mol/LNaCl溶液40mL，玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第2

2、頁(yè).析出含DNA粘稠物：.濾取含DNA粘稠物：. DNA粘稠物再溶解： 在上述溶液中緩緩加入蒸餾水，并沿一個(gè)方向輕輕攪拌，出現(xiàn)絲狀物；當(dāng)絲狀物不在增加時(shí)，停頓加水（此時(shí)NaCl溶液濃度相當(dāng)于0.14mol/L）。 用多層紗布過(guò)濾，含DNA粘稠物留在紗布上。 20mL2mol/LNaCl溶液步驟含DNA粘稠物在20mL燒杯中輕緩攪拌3min，使盡可能多DNA溶解在NaCl溶液。.過(guò)濾含有DNANaCl溶液： 用放有兩層紗布漏斗過(guò)濾步驟所得溶液，濾液中含有DNA。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第3頁(yè).提取含有雜質(zhì)較少DNA： 步驟所得濾液體積分?jǐn)?shù)為95%冷卻酒精50mL，用玻棒沿一個(gè)

3、方向輕緩攪拌，溶液中（析出）出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸收上面水分。3.DNA判定： 加入二苯胺試劑4mL，用玻棒攪拌使DNA溶解，沸水浴5min，觀察溶液是否出現(xiàn)淺藍(lán)色。1.共有“三次過(guò)濾，兩次析出，七次攪拌”2.加入“兩次蒸餾水，三次NaCl溶液，一次酒精”三、試驗(yàn)小結(jié)dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第4頁(yè)四、試驗(yàn)原理拓展介紹。1.DNA釋放。 DNA主要在雞血細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)，正常情況下不會(huì)釋放出來(lái)，蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞是一個(gè)低滲液，水分能夠大量進(jìn)入血細(xì)胞，使之脹破，同時(shí)加上玻璃棒快速攪拌機(jī)械作用，加速血細(xì)胞細(xì)胞膜和核膜破裂。但釋放出來(lái)大量DNA與RNA、蛋白質(zhì)

4、結(jié)合在一起，即釋放不是純凈DNA，常稱(chēng)為DNA核蛋白。2.DNA與蛋白質(zhì)分離。 在高濃度（2mol/L）氯化鈉溶液中，核蛋白易溶解，析出DNA并溶解在高濃度氯化鈉溶液中3.DNA析出與獲取。 因?yàn)镈NA在低濃度（ 0.14mol/L ）氯化鈉溶液中溶解度小，而蛋白質(zhì)在其中溶解度大。所以在向含DNA高濃度氯化鈉溶液中加入大量蒸餾水稀釋氯化鈉溶液，從而使DNA溶解度下降，蛋白質(zhì)溶解度增高。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第5頁(yè)4.DNA再溶解。用高濃度（2mol/L）氯化鈉溶液再溶解DNA粘稠物。5.DNA沉淀和濃縮。 對(duì)于除去了蛋白質(zhì)DNA氯化鈉溶液，必須再深入沉淀和濃縮，常見(jiàn)酒精沉

5、淀法。即往含有NaDNA溶液，加入體積分?jǐn)?shù)為95%冷卻酒精，混勻后能夠使DNA沉淀、濃縮，形成含雜質(zhì)較少DNA絲狀物，懸浮于溶液中。若絲狀物較少，可將混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘即可。濃縮后DNA絲狀物能夠用玻棒（玻棒有吸附DNA作用）緩緩旋轉(zhuǎn)方法卷起。6.DNA判定。100DNA二苯胺 藍(lán)色物判定時(shí)藍(lán)色深淺與溶液中DNA含量多少相關(guān)。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第6頁(yè)方法步驟 加入物質(zhì) 目標(biāo) 1.制備雞血細(xì)胞液 檸檬酸鈉溶液 2.提取雞血細(xì)胞細(xì)胞核物質(zhì) 20 m1蒸餾水 3.溶解細(xì)胞核內(nèi)DNA 2 m1LNaCI溶液40mL 4.析出含DNA黏稠物 蒸餾水 5.濾取含DNA黏

6、稠物 6.將DNA黏稠物再溶解 2 molLNaCl溶液20 mL 7.過(guò)濾含DNANaCl溶液 8.提取含有雜質(zhì)較少DNA 冷卻95酒精50 mL A:(1)向試管中加入0.015 molLNaCl溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺試劑 9.DNA判定 B:(1)向試管中加入0.015molL NaCl溶液5mL (2)4 mL二苯胺試劑 dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第7頁(yè)加入檸檬酸鈉溶液目標(biāo)是預(yù)防血凝固加速血細(xì)胞破裂 溶解DNA 使2mol/LNaCl溶液稀釋至0.14mol/L使得DNA最大程度地釋出 使含DNA黏稠物被留在紗布上使含DNA黏稠物盡可能多溶

7、解于溶液中除去含DNA濾液中雜質(zhì)提取DNA A出現(xiàn)藍(lán)色 B無(wú)改變dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第8頁(yè)2.試驗(yàn)中NaCl物質(zhì)量濃度為2 molL和0.14 molL對(duì)DNA有何影響?1.在DNA粗提取試驗(yàn)過(guò)程中，兩次向燒杯中加入蒸餾水作用是( )。A.稀釋血液、沖洗樣品B.使血細(xì)胞破裂、降低NaCl濃度使DNA析出C.使血細(xì)胞破裂、增大DNA溶解量 D.使血細(xì)胞破裂、提取含雜質(zhì)較少DNA答：B答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第9頁(yè)3.DNA遇二苯胺(沸水浴)會(huì)染成( ) A.磚紅色 B.橘黃色 C.紫色 D.藍(lán)色4.提取雞血中DN

8、A時(shí)，為何要除去血液中上清液?答：DNA提取，關(guān)鍵是對(duì)雜質(zhì)去除，因?yàn)樯锨逡菏茄褐醒獫{個(gè)別，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白質(zhì))。答：Ddna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第10頁(yè)(一) PCR原理體內(nèi)DNA復(fù)制:模板DNA原料: dNTP酶: 解旋酶、DNA pol. 起始引物、合成方向合成環(huán)境dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第11頁(yè)解鏈模板變性引物-起始引物-模板復(fù)性子鏈延伸子鏈延伸(一) PCR原理dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第12頁(yè)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)此為紫外光吸收檢測(cè)結(jié)果檢驗(yàn)法，實(shí)踐中極少用；普遍采取瓊脂糖凝膠電泳法檢驗(yàn)PCR結(jié)果dna的粗提取與鑒

9、定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第13頁(yè)Fig. 7.23DenatureAnneal PCR PrimersExtend PCR Primersw/TaqRepeatdna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第14頁(yè)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 擴(kuò)增DNA片段 dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第15頁(yè)一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo) 了解PCR基礎(chǔ)原理，學(xué)習(xí)PCR基礎(chǔ)操作技術(shù)。 dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第16頁(yè)二、試驗(yàn)原理 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction， 簡(jiǎn)稱(chēng)PCR）是體外酶促合成特異DNA片段一個(gè)方法。經(jīng)典PCR由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三步反

10、應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)周期，經(jīng)過(guò)屢次循環(huán)反應(yīng)，使目標(biāo)DNA得以快速擴(kuò)增。其原理以下：將待擴(kuò)增DNA置于高溫下使之解鏈，人工合成兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫下分別與目標(biāo)片段兩側(cè)兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合；DNA聚合酶在72將單核苷酸從引物3端開(kāi)始摻入，沿模板53端方向延伸，合成DNA新互補(bǔ)鏈。重復(fù)進(jìn)行這種變性、退火和延伸反應(yīng)循環(huán)，可使兩引物限定范圍內(nèi)DNA序列以指數(shù)形式擴(kuò)增。循環(huán)次數(shù)主要取決于模板濃度，從理論上講一個(gè)模板DNA分子經(jīng)20次循環(huán)擴(kuò)增后可達(dá)106。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第17頁(yè)P(yáng)CR基礎(chǔ)原理 變性、復(fù)性、半保留復(fù)制一生二，二生四，四生萬(wàn)物 PCR三步曲變性 9097退火 4565延伸 7

11、2左右PCR過(guò)程dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第18頁(yè)(二) PCR反應(yīng)過(guò)程變性-復(fù)性-延伸多重循環(huán)(n)模板以2En擴(kuò)增短片段以指數(shù)式擴(kuò)增長(zhǎng)片段以線性式擴(kuò)增最終主產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在P1-P2之間dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第19頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。它既可用于基因分離、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突變體和重組體構(gòu)建、基因表示調(diào)控和研究、基因多態(tài)性分析、遺傳病和傳染病診療、腫瘤機(jī)制探索及醫(yī)學(xué)判定等多方面，也被廣泛利用于刑偵物證判定、親子判定及古分子系統(tǒng)學(xué)研究等其它領(lǐng)域。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第20頁(yè)高中生物技術(shù)實(shí)踐課件血紅

12、蛋白提取和分離dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第21頁(yè) 本課題學(xué)習(xí)目標(biāo) 體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子基礎(chǔ)過(guò)程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子基礎(chǔ)原理。1、主要概念：凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們?cè)谘t蛋白提取中分別起到什么作用。2.主要原理：凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)原理 電泳法分離樣品原理 緩沖溶液組成和作用機(jī)理3、課題重點(diǎn)：凝膠色譜法原理和方法 4、課題難點(diǎn)：樣品預(yù)處理 色譜柱填料處理和色譜柱裝填。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第22頁(yè) 年4月14日宣告人類(lèi)基因組序列圖完成，這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代人類(lèi)基因組：指DNA分子所攜帶全部遺傳信息

13、 蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表示蛋白質(zhì)分子總和。主要是對(duì)蛋白質(zhì)功效研究dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第23頁(yè)血液血漿水 分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無(wú)機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì) 胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90）兩個(gè)肽鏈兩個(gè)一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)2.提問(wèn)：血液有哪些成份？ 1.提問(wèn)：用雞紅細(xì)胞提取DNA，用人紅細(xì)胞提取血紅蛋白原因是什么？ 雞紅細(xì)胞含有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA提取；人紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第24頁(yè)血紅蛋白兩個(gè)肽鏈兩個(gè)一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈圍繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，

14、此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白特點(diǎn)：dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第25頁(yè)1.分離生物大分子基礎(chǔ)思緒： 選取一定物理或化學(xué)方法分離含有不一樣物理或化學(xué)性質(zhì)生物大分子。2.蛋白質(zhì)分離和提取原理： 依據(jù)蛋白質(zhì)各種特征差異，如分子形狀和大小、所帶電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其它分子親和力等等，能夠用來(lái)分離不一樣種類(lèi)蛋白質(zhì)。 一、血紅蛋白提取和分離3.高溫滅菌和酒精滅菌結(jié)果： 使微生物蛋白質(zhì)發(fā)生變性、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)被破壞。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第26頁(yè)（一） 凝膠色譜法（分配色譜法）2.凝膠： 大多數(shù)凝膠是由多糖

15、類(lèi)化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）組成多孔小球體，內(nèi)部有許多貫通通道。 依據(jù)被分離物質(zhì)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大 小，利用含有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠分子篩作用，來(lái)進(jìn)行分離。1.概念：3.凝膠色譜法原理分子篩效應(yīng)： 當(dāng)相對(duì)分子量不一樣蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子量較小蛋白質(zhì)輕易進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，旅程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢;而相對(duì)分子量較大蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，旅程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不一樣蛋白質(zhì)分子所以得以分離。依據(jù)特征是：蛋白質(zhì)分子量大小。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第27頁(yè)4.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)原理和詳細(xì)過(guò)程dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第28頁(yè) （

16、二）緩沖溶液 1.概念: 在一定范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少許強(qiáng)酸或強(qiáng)堿影響使原來(lái)溶液PH值基礎(chǔ)保持不變混合溶液。 能夠抵制外界酸和堿對(duì)溶液PH值影響，維持PH基礎(chǔ)不變。2.作用:3.緩沖溶液配制: 通常由12 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)整緩沖劑使用百分比就能夠制得在不一樣PH范圍內(nèi)使用緩沖液。 4.提問(wèn)：在本課題中使用緩沖液是:_ ,其目標(biāo)是: 利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)PH環(huán)境，確保 血紅蛋白正常結(jié)構(gòu)和功效，便于觀察(紅色)和科 學(xué)研究(活性)磷酸緩沖液dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第29頁(yè) 緩沖溶液組成及分類(lèi)弱酸及其對(duì)應(yīng)鹽：弱堿及其對(duì)應(yīng)鹽：多元弱酸酸式鹽及其對(duì)應(yīng)次級(jí)鹽:H2CO

17、3NaHCO3 ；CH3COOHCH3COONaNH3H2ONH4CL ; NH4OHNH4CLNaHCO3Na2CO3 ；NaH2PO4Na2HPO4 緩沖溶液由足夠濃度共軛酸堿對(duì)組成。其中，能反抗外來(lái)強(qiáng)堿稱(chēng)為共軛酸；能反抗外來(lái)強(qiáng)酸稱(chēng)為共軛堿。這一共軛酸堿通常稱(chēng)為緩沖對(duì)、緩沖劑或緩沖系。常見(jiàn)緩沖對(duì)主要有以下三種類(lèi)型：dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第30頁(yè) （三） 電泳：1.概念：帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移過(guò)程。2.原理： 許多主要生物大分子，如多肽、核酸等都含有可解離基團(tuán)，在一定PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反電極移動(dòng)。電泳利

18、用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)差異以及分子本身大小，形狀不一樣，使帶電分子產(chǎn)生不一樣遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子分離。3.類(lèi)型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第31頁(yè) 在電場(chǎng)作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反電極移動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳示意圖dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第32頁(yè) 聚丙稀酰胺凝膠電泳 1、在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常見(jiàn)十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙稀酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑作用下聚合交聯(lián)成含有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與

19、分離第33頁(yè) 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中遷移率取決于它所帶凈電荷多少以及分子大小等原因。 （SDS作用）為了消除凈電荷對(duì)遷移率影響，能夠在凝膠中加入SDS。2.原理： 聚丙稀酰胺凝膠電泳 SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，所以測(cè)定結(jié)果只是單條肽鏈分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷量大大超出了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不一樣種蛋白質(zhì)間電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子大小。3. SDS作用機(jī)理:dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第34頁(yè)用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量方法 使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

20、測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，可選取一組已知分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，依據(jù)已知分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠測(cè)定未知蛋白質(zhì)分子量。市場(chǎng)上有高分子量、次高分子量及低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第35頁(yè) 二、試驗(yàn)操作樣品處理粗分離純化純度判定1.樣品處理：（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（二）操作過(guò)程 本課題可選取豬、牛、羊或其它脊椎 動(dòng)物血液來(lái)分離血紅蛋白。(1)紅細(xì)胞洗滌:洗滌目標(biāo): 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白分離純化，洗滌次數(shù)不可過(guò)少。洗滌操作： 1、采集血樣。2、低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一

21、同沉淀，達(dá)不到分離效果）3、吸收血漿：上層透明黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時(shí)間）6、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒(méi)有黃色，表明洗滌潔凈。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第36頁(yè)(2)血紅蛋白釋放： 加蒸餾水到原血液體積，再加40體積甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液： 過(guò)程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以r/min速度離心10 min。試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（

22、中下層）：血紅蛋白水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。分離：用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層紅色透明液體。 二、試驗(yàn)操作dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第37頁(yè)甲苯層（無(wú)色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第38頁(yè)(4)透析： 過(guò)程：取1ml血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml物質(zhì)量濃度為20mmol/l磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。透析目標(biāo)：除去樣品中分子量較小雜質(zhì)。 二、試驗(yàn)操作dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取

23、與分離第39頁(yè)2.凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱制作： 取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入玻璃管上部不得超出橡皮塞凹穴底面，不然難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)造成液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按對(duì)應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其它從屬結(jié)構(gòu)。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第40頁(yè) （2）凝膠色譜柱裝填 凝膠選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠得水值，即每

24、克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。 凝膠前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱(chēng)取一定量凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡可能緊密，以降低凝膠顆粒之間空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)洗脫次序，降低分離效果。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第41頁(yè) 洗滌平衡：裝填完成后，馬上用緩沖液洗脫瓶，在50cm高操作壓下，用300ml20mmol/l磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)

25、。注意：1、液面不要低于凝膠表面，不然可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒現(xiàn)象。 （2）凝膠色譜柱裝填50cm高dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第42頁(yè)（3）樣品加入與洗脫 調(diào)整緩沖液面：打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液遲緩下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁圍繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 樣品滲透凝膠床：加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲透凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 洗脫：小心加入pH=7.0 20mmol/l磷酸緩沖液到適當(dāng)高度

26、，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。 搜集：待紅色蛋白質(zhì)靠近色譜柱底端時(shí)，用試管搜集流出液，每5ml搜集一試管，連續(xù)搜集。（在分離過(guò)程中，假如紅色區(qū)帶均勻一致移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功） 注意：正確加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁圍繞移動(dòng)。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第43頁(yè)（3）樣品加入與洗脫注意：正確加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁圍繞移動(dòng)。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第44頁(yè)思索下面問(wèn)題：讓血紅蛋白處于穩(wěn)定pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功效。 1、在血紅蛋白整個(gè)過(guò)程中不停用磷酸緩沖液

27、處理目標(biāo)是什么？ 2、與其它真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？ 血紅蛋白是有色蛋白，所以在凝膠色譜分離時(shí)能夠經(jīng)過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該搜集洗脫液。這使血紅蛋白分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作。 3、你能描述血紅蛋白分離完整過(guò)程嗎？ 血紅蛋白提取和分離程序可分為四大步，包含：樣品處理、粗分離、純化和純度判定。首先經(jīng)過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白釋放、離心等操作搜集到血紅蛋白溶液，即:樣品處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小雜質(zhì)，即樣品粗分離；然后經(jīng)過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品純化；最終經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度判定。dna的粗提取與鑒定p

28、cr蛋白質(zhì)的提取與分離第45頁(yè)（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳2.試劑配制：判定血紅蛋白純度。1.目標(biāo)： 丙烯酰胺和N, N-甲叉雙丙烯酰胺: 用去離子水配制29%（29 g/100 mL，下同）丙烯酰胺和1%N, N-甲叉雙丙烯酰胺貯存液。十二烷基硫酸鈉（SDS）: 用去離子水配成10%貯存液，于室溫保留。用于制備分離膠和濃縮膠Tris緩沖液。TEMED ：作用經(jīng)過(guò)催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺聚合。用去離子水配制10% 過(guò)硫酸銨：作用是提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需自由基。此溶液須配制新鮮液。Tris甘氨酸電泳緩沖液：25 mmol/L Tris，250 mmol/

29、L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%SDS。樣品處理液： 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巰基蘇糖醇)或用5%巰基乙醇，2%SDS，0.1%溴酚藍(lán)，10%甘油。染色液： 0.1%考馬斯亮藍(lán)R250，40%甲醇，10%冰醋酸。脫色液：10%甲醇和10%冰醋酸。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第46頁(yè) 1、因?yàn)橹苽淠z丙烯酰胺和雙丙烯酰胺含有很強(qiáng)神經(jīng)毒性，而且輕易被皮膚吸收，所以操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。 2、TEMED和過(guò)硫酸胺對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大破壞作用，吞服可致命。 3、在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定按照試驗(yàn)要求

30、和步驟完成。操作時(shí)要戴好一次性手套。注意事項(xiàng)：（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質(zhì)的提取與分離第47頁(yè) SDS-聚丙烯酰胺分離膠制備：用去離子水4.6 mL，30%丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8Tris緩沖液2.5 mL，10%SDS 0.1 mL，10%過(guò)硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均勻，快速灌注在兩玻璃板間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間(梳子齒長(zhǎng)再加0.5 cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高23 mm），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。分離膠聚合完全后（約30 min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。配制SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液用去離子水2.7 mL，30%丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8Tris緩沖液0.5 mL，10%SDS0.041 mL，10%過(guò)硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均勻，直接灌注在聚合分離膠上