1、生物化學與分子生物學設計性實驗牛血清白蛋白的提取與鑒定III一、實驗目的掌握牛血清白蛋白的提取與鑒定方法培養學生自主設計實驗發現問題和解決問題的能力、提高學生的實驗技能及創新能力督促學生學習實驗方法，端正實驗態度，培養良好的實驗習慣。二、實驗原理1由于血清中含有白蛋白、a-球蛋白、。-球蛋白、丫-球蛋白等在 半飽和硫酸銨中可以分離出來，且各種蛋白質由于氨基酸組分、立體 構象、相對分子質量、等電點及形狀不同，在電場中遷移速度不同。 由表可知，血清中5種蛋白質的等電點大部分低于pH值7.0,所以 在緩沖液(pH值8.6 )中，它們都電離成負離子，在電場中向陽極移 動。牛血清白蛋白是 牛血清中的簡單

2、 蛋白，是血 液的主要成 分 (38g/100ml),分子量68kD。等電點4.8。應用相同濃度硫酸銨鹽析 法：根據硫酸銨在半飽和時主要沉淀球蛋白，血清白蛋白不沉淀，離心后白蛋白主要在上清液中。在全飽和時沉淀所有蛋白，用此方法則 可將牛血清蛋白與球蛋白分開，即將血清中白蛋白與其它球蛋白分 離，最后用透析法除鹽，即可提取白蛋白。進而牛血清白蛋白進行分清蛋白的等電點、平均分子量及正常含量離與鑒定。III4點樣線清蛋白%球1白 叫球蛋白 A-球蛋白Y球笙白.清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳結果(+)清蛋白球蛋白ala2P等申占4.885.065.065426.85-73相對分子量（X104）6.920309

3、1515.630含量（%）576725496.2 121220ill實驗步驟（一）鹽析取離心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷 酸鹽緩沖生理鹽水）稀釋血清，搖勻后，逐滴加TpH7.2半飽和硫酸 銨溶液2mL,邊加邊搖，充分混勻，然后靜止放置10分鐘，再離心（2000r/min） 10min,將上清液傾入試管中。（二）透析取玻璃紙一張，折成袋形，將離心后的上清液倒入袋內，用線扎緊上口（注意要留有空隙）用玻璃棒懸在盛有半杯 蒸餾水的100mL燒杯內，使透析袋下半部侵入水中，對蛋白液進行透 析，常用玻璃棒攪拌袋外（燒杯中）液體，以縮短透析時間。更換蒸 餾水多次，用納氏試劑檢查袋外液體的NH4

4、+，觀察顏色變化（有NH4+ 存在時呈黃色到橙色），直至袋內鹽分透析完畢。將袋內液體傾入試 管，即得牛血清白蛋白溶液。（三）電泳（1）點樣 取1張膜條，將薄膜無光澤面向下，放入培養皿 中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透，取出，用干凈濾紙吸去多余的 緩沖液，以薄膜的無光澤面距一端1.5 cm處作點樣線，將牛血清樣品 與待測的牛血清白蛋白溶液分別用點樣器在同一張薄膜的點樣線處 不同位置點樣。（2） 電泳 將點樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時膜條無 光澤面向下，點樣端置于陰極，待平衡5min后，打開電源，調節電 泳儀的電壓為160伏，通電60min,關閉電源后用鑷子將膜條取出。（3） 染色將膜條直接浸

5、于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分鐘取出，立即浸于漂洗液中，分別在漂洗液I、II、III中各漂洗 5min，直至背景漂洗干凈為止，用濾紙吸干薄膜。（4 ）鑒定比較樣品與待測液中白蛋白在薄膜上的電泳結果，看位置是否一致。預測結果位置一致，實驗成功。若在待測液的電泳結果中出現其他球蛋白的黑帶區域，則說明提取不夠純。實驗儀器和試劑儀器：離心管、離心機、試管、玻璃紙、燒杯、比色磁盤、滴管、 玻璃棒、電泳儀、醋酸纖維素薄膜。試劑：牛血清待測液、牛血清樣品、PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水， 用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH7.2 飽和硫酸銨溶液、納氏試劑、巴比妥緩沖液、氨基黑10B染色液、漂 洗液、0.4N氫氧化鈉溶液。注意事項離心時注意天平的配平，速度由慢到快，否則離心管易破裂。透析時應多次換燒杯中的水并每換一次水前檢查袋外水中有無 NH4+點樣時