1、 實驗四 線粒體的分離與觀察 一、實驗目的 1. 初步掌握用差速離心法分離雞肝臟細胞線粒體的方法。 2. 學習并掌握高速離心機和勻漿器的使用方法。 二、實驗原理 線粒體是真核細胞中產生能量的重要細胞器，對線粒體結構與功能的研究通常是在離體的線粒體上進行的。 制備線粒體時，可將組織勻漿液懸浮在懸浮介質中進行差速離心法進行分離。在一定的離心場中（選用離心機的一定轉速），大小不一的顆粒沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質的粘度。在一個均勻懸浮介質中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其它內含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降

2、在離心管底部，從而分批收集。細胞器中最先沉淀的是細胞核，其次是線粒體，其它更輕的細胞器和大分子可依次再分離。 懸浮介質通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞質的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結構和酶的活性，在pH7.2 的條件下，亞細胞組分不容易重新聚集，有利于分離。三、實驗用品 1.材料：雞肝臟 2.器材：高速離心機、解剖刀剪、燒杯、冰浴、漏斗、紗布、勻漿器、高壓滅菌鍋 3.試劑：0.9%滅菌的生理鹽水、1%詹納斯綠B 染液、 0.25mol/L 蔗糖十0.01mo1/L Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)、0.34mol/L 蔗糖十0.01mol/LTris-鹽酸緩沖液 (pH7.4)、

3、固定液、姬姆薩染液、磷酸鹽緩沖液(pH6.8) 四、實驗操作 1.制備雞肝細胞勻漿: 取出肝臟，用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織2g，放入研缽內，剪碎，用預冷的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液洗滌兩次后，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液（分數次添加），將肝組織研磨成勻漿，用8層紗布過濾備用。 2.離心：先將2ml 0.34mol/L 緩沖蔗糖溶液放入離心管，然后沿管壁小心地加入2ml 肝勻漿，使其覆蓋于上層，標注記號，配平后對稱放入離心機中進行差速離心。 差速離心提取雞肝線粒體流程如下圖：分離細胞核雞肝2克勻漿勻漿過濾 濾液 將濾液2ml覆蓋于相同容積的0.34m

4、ol/L蔗糖溶液上 1200r/min 離心10min 沉淀（涂片自然干燥） 上清液1（細胞核及碎片） 洗滌（加0.25mol/L預冷蔗糖溶液 2ml 混勻，2500r/min 離心15min） 沉淀（涂片自然干燥） 上清液2(與上清液1合并) （細胞核） 分離線粒體 混合上清液11000r/min 離心10min 沉淀 上清液（棄去） （線粒體） 洗滌 (加 0.25mol/L預冷蔗糖溶液 10ml混勻, 11000r/min 離心10min） 沉淀（涂片自然干燥） 上清液 （線粒體）3. 分離物鑒定 (1) 細胞核：取細胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹 干，滴1滴

5、Gimesa染液染色10min。自來水沖洗，干燥后，鏡檢。 結果：細胞核呈紫紅色，上面附著的少量胞質及淺藍色碎片。 (2) 線粒體：取線粒體沉淀1 滴涂片，滴加1%詹納斯綠B 染液染20min，覆上 蓋玻片，鏡檢。 結果：線粒體藍綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。五、實驗報告 1. 分別描述三張涂片的結果(如平均每個視野中所見完整的細胞核數量,完整的 細胞或帶有殘留細胞質的細胞核的約占多少等) 2. 描述兩張線粒體裝片的觀察結果,根據你的實驗結果,你認為所分離的線粒體 的純度如何? 六、實驗建議 1.注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時間，整個分離過程不宜過長， 以保持組分生理活性。最好在在04或冰浴中進行。 2.將勻漿液置于蔗糖溶液上層時要沿