1、第四章 微生物藥物的生物合成微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 根據(jù)微生物藥物的生物合成原理發(fā)現(xiàn)微生物新藥的方法和途徑通過非基因定向改變、基因定向改變，以及組合生物催化的技術(shù)，或是改變原有微生物藥物的生物合成途徑，或是對原有的微生物藥物或先導(dǎo)化合物和中間體進行生物催化，以發(fā)現(xiàn)微生物新藥 .產(chǎn)生菌前體物質(zhì)(1) 誘變處理化學(xué)修飾天然產(chǎn)物衍生物天然產(chǎn)物天然中間物天然產(chǎn)物衍生物 化學(xué)修飾 生物轉(zhuǎn)化與 組合生物轉(zhuǎn)化 阻斷或非阻斷菌株定向與雜交生物合成微生物或酶轉(zhuǎn)化天然產(chǎn)物類似物 雜合 工程菌突變生物合成組合生物合成(2) 基因操作天然產(chǎn)物類似物(1)(2)天然產(chǎn)物類似物微生物藥物生物合成與微生物新藥發(fā)現(xiàn)的根本途徑 通過

2、非基因定向改變的方法包括：定向生物合成、雜交生物合成、突變生物合成，以及生物轉(zhuǎn)化與組合生物轉(zhuǎn)化；基因定向改變，即為組合生物合成。 第一節(jié)生物合成途徑的非基因定向改變與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)一、非遺傳操作的定向生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)已有的研究說明，在抗生素等次級代謝產(chǎn)物生物合成中酶底物的特異性足以使結(jié)構(gòu)相關(guān)的代謝產(chǎn)物在其發(fā)酵液中積累；但由于生物合成酶的底物專一性較低寬泛性，其野生型菌株或阻斷突變株的發(fā)酵過程中添加一些結(jié)構(gòu)類似物作為前體物質(zhì)，可以產(chǎn)生含有與這種結(jié)構(gòu)類似的新衍生物；這種獲得新次級代謝產(chǎn)物的途徑，可以被稱之為非遺傳操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)。 前體

3、precursor即在微生物培養(yǎng)過程中，外源添加的某一化學(xué)物質(zhì)，通過微生物的代謝，能夠?qū)⑵湔w地或局部地整合到某一特定的次級代謝產(chǎn)物的分子中去的化合物，如苯乙酸或苯乙酰胺及苯氧乙酸等。非遺傳操作的定向生物合成這種在發(fā)酵過程中通過添加某種特定的前體物質(zhì)，使微生物的生物合成朝著將這些前體物質(zhì)摻入到產(chǎn)物分子的某一特定部位而產(chǎn)生過量的含有這種前體的產(chǎn)物的方法，即為非遺傳操作的定向生物合成。其根本原理是由于參與這些反響的生物合成酶的底物專一性較差，而能使外源添加的某些前體物質(zhì)競爭性地摻入到特定產(chǎn)物的分子中去。 定向生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)次級代謝產(chǎn)物合成酶的特點：是一個由一系列酶參與催化的多酶體系。參

4、與催化反響的酶的底物專一性比初級代謝合成酶要差。應(yīng)用實例應(yīng)用非遺傳操作定向生物合成的方法能夠制備獲得許多新的抗生素，其中目前已進行工業(yè)化生產(chǎn)的有：青霉素G和V；培羅霉素；四環(huán)素和金霉素等。 青霉素定向生物合成.序號側(cè) 鏈 R學(xué) 名俗 名1對羥基芐青霉素青霉素X2芐青霉素青霉素G3戊烯2青霉素青霉素F4戊青霉素青霉素二氫F5庚青霉素青霉素K6丙烯巰甲基青霉素青霉素O7苯氧甲基青霉素青霉素V84氨基4羧基丁基青霉素青霉素N青霉素和6APA分子結(jié)構(gòu)及各種天然青霉素的結(jié)構(gòu)與名稱青霉素分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)6APA的化學(xué)結(jié)構(gòu)各種天然青霉素具有的側(cè)鏈和名稱培羅霉素定向生物合成.培羅霉素定向生物合成可結(jié)合進入BLM

5、的末端胺基局部的非天然胺基化合物.* PEP的末端胺基四環(huán)類抗生素的定向生物合成R5R6R76去甲基四環(huán)素HHH(1)7氯6去甲基四環(huán)素HHCl(2)四環(huán)素HCH3H(3)5羥基四環(huán)素（土霉素）OHCH3H(4)7氯四環(huán)素（金霉素）HCH3Cl(5)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一些四環(huán)素類抗生素四環(huán)類抗生素的定向生物合成 在生產(chǎn)金霉素時需添加氯化物作為前體，而當生產(chǎn)四環(huán)素時，那么必須要在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯離子抑制劑，如溴化物或M-促進劑等，從而抑制金霉素的合成而得到四環(huán)素產(chǎn)物。 另外，用金色鏈霉菌在發(fā)酵的金霉素過程中添加適量的甲基化反響抑制劑如磺胺嘧啶鈉，能夠獲得去甲基金霉素。 杜拉克丁的定向生物合成杜拉

6、克丁的定向生物合成組分R1R2XY備注A1aA1bA2aA2bB1aB2bB2aB2bOCH3OCH3OCH3OCH3OHOHOHOHCH=CHCH=CHCH2CH（OH）CH2CH（OH）CH=CHCH=CHCH2CH（OH）CH2CH（OH）25-環(huán)己烷基-B225-環(huán)己烷基-B1OHOHCH2CH（OH）CH=CH外源添加環(huán)己烷羧酸鈉非基因改變定向生物合成的研究進展 盡管近年來基因改變的定向生物合成開展很快，但利用非遺傳操作定向生物合成原理尋找新的生理活性物質(zhì)的研究還在不少實驗室繼續(xù)進行，特別是對一些肽類如環(huán)孢菌素A、aureobasidins及糖肽類如替考拉寧產(chǎn)生菌的定向生物合成研究取

7、得了很大的進展。二、添加外源酶抑制劑的雜交生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 雜交生物全成hybrid biosynthesis似乎可以理解為是一種“強化的非遺傳定向生物合成，如在苦霉素產(chǎn)生菌生酵過程中添加聚乙酰途徑中-酮酯酰基合成酶抑制劑線蘭菌素(cerulenin)，使其失去合成鏈霉素大環(huán)內(nèi)酯苷元(picronolide)的能力而只能合成糖基。同時在發(fā)酵過程中添加泰樂菌素大環(huán)內(nèi)酯苷元(protylonolide)，使其與苦霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)生的糖基結(jié)合，得到一種被稱之為M4365G1的雜合抗生素(hybrid antibiotic)。 雜交生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)葡萄糖1CH3COOH6CH3CH2C

8、OOH2CH3COOH5CH3CH2COHCH3CH2CH2COOHS.fradia KA427 NO.261ProtylonolidePicronolideDesosaminePicromycin DDesosaminyl Protylonolide（M4365G1） 在淺藍菌素存在下，用苦味霉素產(chǎn)生菌（S.sp.AM4900） 與protylonolide 雜交生物合成M4365G雜交生物合成產(chǎn)物工業(yè)化的可能性 盡管通過雜交生物合成能夠得到一些新的抗生素，但由于所添加的淺藍菌素本身就是一種昂貴的抗生素，再那么所添加的苷元的結(jié)構(gòu)受到限制，所以這種方法似乎沒有很大的實際意義。 三、非定向誘變的

9、突變生物合成與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)突變生物合成mutational biosynthesis：突變生物合成是指野生型產(chǎn)生菌經(jīng)化學(xué)或物理等因素誘變處理后，喪失合成原來次級代謝產(chǎn)物的能力而成為阻斷突變株，然后在發(fā)酵培養(yǎng)阻斷突變株時添加某種外源物質(zhì)，參與生物合成以獲得新的次級代謝產(chǎn)物的過程。另外，突變生物合成也包括由于突變而引起產(chǎn)生新的次級代謝產(chǎn)物。突變生物合成原理阻斷突變株的類型營養(yǎng)缺陷型突變株： 由于編碼菌體生長之必須的酶的基因發(fā)生了突變，而使菌體不能生長，導(dǎo)致不能合成次級代謝產(chǎn)物。因此，這類突變株也可以稱為初級代謝阻斷突變株。獨需型突變株： 這種突變株的生長和初級代謝正常，但由于編碼次級代謝產(chǎn)物合

10、成的某一基因發(fā)生突變，而使喪失了合成次級代謝產(chǎn)物的能力。這是突變生物合成所需要的突變株。雙重阻斷突變株： 即突變既發(fā)生在編碼初級代謝酶的基因上，也發(fā)生在編碼次級代謝酶的基因上。突變生物合成與微生物新藥發(fā)現(xiàn).野生型產(chǎn)生菌獨需型突變株AB正常途徑某抗生素阻斷變株A阻斷變株BAB+BA+ABABA，B為某一抗生素分子結(jié)構(gòu)的兩個部分AB為發(fā)酵液培養(yǎng)時阻斷變株的代謝產(chǎn)物BA為發(fā)酵培養(yǎng)時添加的AB的結(jié)構(gòu)類似物ABAB即為新的雜合抗生素利用獨需型突變株合成產(chǎn)生新抗生素的基本原理突變生物合成的根本流程.出發(fā)菌株的選擇誘變處理阻斷突變株篩選瓊脂塊法選擇有生理活力的突變株無生理活力的突變株搖瓶復(fù)篩有生理活力的突變

11、株無生理活力的突變株區(qū)段合成產(chǎn)物，連接酶等生化特性的研究有區(qū)段合成產(chǎn)物、無連接酶等活性的突變株有區(qū)段產(chǎn)物A有連接酶等活性的突變株有區(qū)段產(chǎn)物B有連接酶等活性的突變株發(fā)酵培養(yǎng)添加結(jié)構(gòu)類似物A或B樣品收集TLC、HPLC檢測及制備結(jié)構(gòu)檢測突變生物合成產(chǎn)生的新抗生素.菌種抗生素特殊營養(yǎng)增補物新抗生素伊尼奧小單孢菌西梭霉素DOS鏈霉胺等突變霉素1等絳紅小單孢菌慶大霉素DOS鏈霉胺等2羥基GM等紅霉素鏈霉菌紅霉素Erythronolide8，8 deoxyoleanolie未鑒別弗氏鏈霉菌新霉素DOS鏈霉胍等雜交霉素A，B加利利鏈霉菌阿克拉霉素阿克拉酮紫紅霉酮等11羥基阿克拉霉素A灰色鏈霉菌鏈霉素紫紅霉酮

12、等2脫氧鏈霉胍streptomutin A卡那霉素鏈霉菌卡那霉素DOS1N甲基DOS等1N甲基GM等雪白鏈霉菌新生霉素氨基香豆氨基香豆素同系物未鑒明核糖苷鏈霉菌核糖霉素DOS1N甲基DOS等1N甲基RSMC等普拉特鏈霉菌普拉特霉素PlatenolideNarbonolide5Omycaminosyl narbonolide龜裂鏈霉菌巴龍霉素DOS鏈霉胍雜交霉素C巴龍鏈霉菌尼可霉素尿嘧啶嘧啶尼可霉素Z等唐德鏈霉菌紅霉素生物合成途徑.丙酮CoA丙酰SACP甲基丙二酰甲基丙二酰SACP丙酰丙酰SACP聚酮體途徑6脫氧紅霉內(nèi)脂B紅霉內(nèi)脂BTDPL碳霉糖 葡萄糖TDPD葡萄糖3O碳霉糖基紅霉內(nèi)脂TDP脫

13、氧氨基己糖 紅霉素D紅霉素C紅霉素A紅霉素E紅霉素B縮合酶突變株產(chǎn)生的新蒽環(huán)類抗生素.RR1R2道若霉素（原株產(chǎn)生）OCH3COCH3OH亞德里亞霉素（變株產(chǎn)生）OCH3COCH2OHOH13雙氫道若霉素（變株產(chǎn)生）OCH3CHOHCH3OH13雙氫洋紅霉素OHCOCH3OH11去氧道若霉素（變株產(chǎn)生）OCH3COCH2OHH11去氧亞德里亞霉素（變株產(chǎn)生）OCH3CH2CH3HBaumycinA*（原株產(chǎn)生）OCH3CH2COCH3OHFeudomycin A（變株產(chǎn)生）OCH3CH2CH3OHFeudomycin BOCH3CH2COCH3OH突變株產(chǎn)生的一些新的次級代謝產(chǎn)物.原菌種原抗生

14、素突變株產(chǎn)生的新抗生素普拉特鏈霉菌普拉特霉素demycarosyl普拉特霉素9dehydromycarosyle普拉特霉素波賽鏈霉菌紫產(chǎn)色鏈霉菌柔紅霉素燼灰紅菌素阿霉素燼灰紅菌素X波賽鏈霉菌baumycinoxaunomycin棘孢小單孢菌慶大霉素小諾霉素生金鏈霉菌四環(huán)素去甲基四環(huán)素生金鏈霉菌金霉素去甲基金霉素龜裂鏈霉菌土霉素去甲基土霉素吸水鏈霉菌carriomycincarromycinA我國應(yīng)用突變生物合成原理找到的小諾霉素.2H2SO4慶大霉素和小諾霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)抗生素R1R2分子式硫酸慶大霉素C1CH3NHCH3C21H43N5O72H2SO4硫酸慶大霉素C1aHNH2C19H39N5

15、O72H2SO4硫酸慶大霉素C2CH3NH2C20H41N5O72H2SO4小諾霉素HNHCH3C20H41N5O72H2SO4四、原生質(zhì)體融合與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 微生物原生質(zhì)體融合，即是指將雙新株的微生物細胞分別通過酶解脫壁，使之形成原生質(zhì)體，然后在高滲溶液的條件下混合，并參加物理的如電融合或化學(xué)的(如聚乙二醇)或生物的如仙臺病毒助融條件，使雙親株的原生質(zhì)發(fā)生相互凝集，通過細胞質(zhì)融合，核融合，此后發(fā)生基因組間的交換，重組，進而可以在適宜的條件下再生出微生物細胞壁，獲得重組子的過程。四、原生質(zhì)體融合與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)利用微生物厚生質(zhì)融合尋找新抗生素的根本原理是來源于兩種產(chǎn)生不同抗生素的產(chǎn)生菌的

16、融合子，有可能將它們的局部生物合成基因整合在一起而產(chǎn)生新的雜合抗生素；另一個原理是由于抗生素產(chǎn)生菌中存在著沈默基因，當這些沉默基因受到外源物質(zhì)刺激后，有可能被激活而產(chǎn)生，結(jié)構(gòu)與親株完全不同的新的抗生素。 四、原生質(zhì)體融合與微生物新藥的發(fā)現(xiàn) 應(yīng)用這種方法獲得的第一個新抗生素是吲哚佐霉素indloizomycin： 其親株為鏈霉素產(chǎn)生菌灰色霉菌和天神霉素istamycin產(chǎn)生菌天神鏈霉菌。目前的報道較少 第二節(jié)生物合成途徑的基因定向改變與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)組合生物合成Combinatorial biosynthesis 是一種通過對天然產(chǎn)物生物合成途徑中的基因進行中斷、置換及重組等操作，改變原來抗生

17、素產(chǎn)生菌或其他天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌生物合成代謝產(chǎn)物的途徑，產(chǎn)生具有新穎結(jié)構(gòu)的“非天然的天然雜合產(chǎn)物unnatural natural hybrid compounds的技術(shù)或方法。 組合生物合成的潛能 potential重組、組合、互補、替換 R=可利用的基因 n=基因的等位形式化合物數(shù)Rn R=4, n=4 Compounds=44=256組合生物合成的原理 生物合成酶基因的結(jié)構(gòu)和組成 生物合成酶基因的特異性及底物寬容性 生物合成酶基因之間的相互作用 生物合成途徑的研究根底一、具有聚酮體生物合成途徑的微生物藥物產(chǎn)生菌的組合生物合成 基于商業(yè)性的原因，迄今為止，對一些具有聚酮體生物合成polyket

18、ide synthases，PKSs途徑的“天然產(chǎn)物，如紅霉素、阿維菌素、泰樂菌素、柔紅霉素、阿克拉霉素、西羅莫司和利福霉素等； 具PKS途徑的抗生素藥物類別 化 合 物 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 紅霉素、螺旋霉素、麥迪霉素四環(huán)類抗生素 四環(huán)素、金霉素、土霉素抗腫瘤抗生素 柔紅霉素，阿克拉霉素、enediynes 抗寄生蟲藥 avermectin，nemadectin 免疫抑制劑 FK506, rapamycin 抗真菌藥 兩性霉素，制霉菌素心血管藥物 lovastatin,，compactin獸藥莫能星（monensin），泰樂菌素 (tylosin)，鹽霉素1、紅霉素產(chǎn)生菌的組合生物合成 通過操作

19、PKS的模塊中單個基因的組合生物合成； 在非天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌中過量表達組合生物合成產(chǎn)物； 通過操作PKS模塊之間連接的組合生物合成 ； 通過操作脫氧糖途徑基因的組合生物合成。紅霉素產(chǎn)生菌的組合生物合成的可能性參與紅霉素生物合成的PKSs，或6脫氧紅霉內(nèi)酯合成酶6-deoxyerythronolide B synthase，DEBS有6個模塊組成，每個模塊負責(zé)合成聚酮體中的一局部。由于各模塊之間的協(xié)調(diào)性，以及每個模塊編碼決定延伸單位的選擇、功能和立體化學(xué)性質(zhì)的催化結(jié)構(gòu)域，因此，就有可能通過對PKSs結(jié)構(gòu)域或模塊的操作獲得具有新穎結(jié)構(gòu)的化合物。由于具有聚酮體結(jié)構(gòu)的化合物其結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜和具有眾多的立體

20、異構(gòu)體，因而，難以用常規(guī)的化學(xué)方法來獲得。 紅霉素的生物合成途徑 PKS中的每一個模塊的組成酮基合成酶ketosynthase，KS酰基轉(zhuǎn)移酶acyl transferase，AT酰基載體蛋白acyl carrier protein，ACP-酮基修飾酶：包括酮基復(fù)原酶ketoreductase，KR、脫氫酶dehydrogenase，DH和烯酰復(fù)原酶enoylreductase，ERDEBS含有編碼三個獨立的多肽亞單位的6個模塊大多數(shù)典型的聚酮體合成途徑的產(chǎn)物包括對PKS產(chǎn)物的修飾，如將脫氧糖或氨基糖進行糖苷化以及通過細胞色素P450進行氧化。圖中所示的LD為裝載域loading domain

21、s，TE為硫酯酶esterases。 1通過操作PKS的模塊中單個基因的組合生物合成 一是用利福霉素PKS模塊2中的DH/ER/KR結(jié)構(gòu)域取代紅霉素PKS模塊2中的KR；二是將模塊5中的KR缺失；三是用利福霉素模塊2中的丙二酰特異性AT取代模塊6中的甲基丙二酰特異性的AT，將得到一個發(fā)生三重突變的PKS產(chǎn)物。 2在非天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌中過量表達組合生物合成產(chǎn)物 將 開發(fā)成能夠表達PKS產(chǎn)物需要解決的問題主要有三個方面：一是能夠功能性表達巨大的蛋白330kDa；二是PKS亞單位的ACP結(jié)構(gòu)域的翻譯后磷酸泛酰巰基乙胺酰化；三是聚酮體途徑中的前體物質(zhì)，特別是2S甲基丙二酰CoA在中不存在。 Pfeife

22、r等的工作包括：運用來源于枯草芽孢桿菌非核糖體多肽合成酶NRPS基因簇的磷酸泛酰巰基乙胺酰轉(zhuǎn)移酶phosphopantetheinyl transferase基因sfp，以對PKS亞單位的ACP結(jié)構(gòu)域的翻譯后磷酸泛酰巰基乙胺酰化；過量表達中的丙酰CoA合成酶基因prpE，擾亂丙酰CoA代謝途徑，以及過量表達來自的丙酰CoA羧化酶基因pcc，使丙酰CoA轉(zhuǎn)化為2S甲基丙二酰CoA 3通過操作PKS模塊之間連接的組合生物合成 通過對DEBS模塊在和體外的表達研究，發(fā)現(xiàn)在PKS裝配過程中那些短的模塊內(nèi)和多肽內(nèi)的“連接件是至關(guān)重要的成分。研究發(fā)現(xiàn)在相繼非共價連接的模塊中，其氨基和羧基末端存在有多肽內(nèi)連

23、接件，這種連接件與單個多肽內(nèi)的模塊之間的連接件不同。因此，使用一種適宜的連接件就有可能允許雜合的模塊之間進行功能性連接。 a：已經(jīng)鑒定了不同的模塊內(nèi)和多肽內(nèi)的連接件，并由此指導(dǎo)合成模塊之間的聚酮體中間體，這里需要適宜的氨基和羧基末端連接配對，以產(chǎn)生功能性連接模塊；b：在構(gòu)建功能性互補體時，可以使用編碼來源于不同微生物多個模塊的全亞基；如下圖：來源于苦霉素picromycin的PKSPikAI和PikAII，與來源于竹桃霉素oleandomycin的PKSOleA3相結(jié)合。 4通過操作脫氧糖途徑基因的組合生物合成對已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的由自然界中植物、真菌和細菌產(chǎn)生的很多具有生理活性的糖苷類化合物的分析發(fā)現(xiàn)

24、，連接在苷元上的糖基的結(jié)構(gòu)大多為6-脫氧己糖6-deoxyhexoses, 6DOHs。據(jù)統(tǒng)計，這些具有生理活性的糖苷類化合物的結(jié)構(gòu)上含有70多種不同的6-脫氧己糖。6-脫氧己糖的種類具有生理活性的化合物產(chǎn)生菌*D-Desosamine紅霉素竹桃霉素苦霉素巨大霉素Sacc.erythraeaS.antibioticusS.VenezuelaeM.megalomiceaD-Olivose光輝霉素烏達霉素Landomycin S.argillaceusS.fradiaeS.cyanogenusD-Oliose光輝霉素S.argillaceusD-Mycarose光輝霉素S.argillaceusD

25、-Mycaminose泰樂星S.fradiaeD-Mycinose泰樂星S.fradiaeD-Mycosamine制霉菌素S.nourseiL-Dihydrostreptose鏈霉素S.griseusL-Oleandrose竹桃霉素阿弗米丁S.antibioticusS.avermitillisL-Mycarose紅霉素巨大霉素泰樂星Sacc.erythraeaM.megalomiceaS.fradiaeL-Noviose新生霉素S.spheroidesL-Rhodinose烏達霉素LandomycinGranaticin S.fradiaeS.cyanogenusS.violaceorube

26、rL-Daunosamine柔紅霉素S.peucetiusL-NogaloseNogalamycin S.nogalaterL-Megosamine*巨大霉素M.megalomiceaL-Rhodosamine阿克拉霉素S.galilaeusL-EpivancosamineChloroeremomycin A.orientalis2-Deoxy-L-fucose阿克拉霉素S.galilaeus由放線菌產(chǎn)生的具有不同生理活性的糖苷化合物的結(jié)構(gòu)特性具有單糖殘基的化合物：紅霉素A、柔紅霉素、urdamycin A和rebeccamycin；具有雙糖殘基的化合物：光輝霉素mithramycin；具有三

27、糖殘基的化合物：烏達霉素Aurdamycin A和光輝霉素前者同時具有單糖和三糖殘基，后者同時具有雙糖和三糖殘基；以O(shè)-糖苷鍵連接的化合物：紅霉素A、光輝霉素、柔紅霉素和烏達霉素A；以C-糖苷鍵連接的化合物：烏達霉素A；以N-糖苷鍵連接的化合物：rebeccamycin。由放線菌產(chǎn)生的具有不同生理活性的糖苷化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu) a通過將竹桃霉素產(chǎn)生菌中齊墩果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在不同的中的表達，得到了3O鼠李糖基紅霉素和6dEB衍生物，以及一個desosaminylated tylactone；b改造來源于刺孢霉素calicheamicin產(chǎn)生菌的基因，可以得到一個新的脫氧氨基糖，并將其附著在產(chǎn)生的苷元

28、上； c在產(chǎn)生菌中構(gòu)建desosamine的途徑，然后導(dǎo)入通過遺傳操作的DEBS，可以得到具有新穎結(jié)構(gòu)的desosaminylated大環(huán)內(nèi)酯類文庫。 將竹桃霉素產(chǎn)生菌抗生鏈霉菌中編碼竹桃霉素oleandrose糖基轉(zhuǎn)移酶的基因oleGII，該酶負責(zé)將相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移到8，8a-脫氧竹桃內(nèi)酯8，8a-deoxyoleandolide的4位羥基上，整合到紅霉素產(chǎn)生菌eryBV缺失突變株中，eryBV基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶負責(zé)將L-mycarose糖基轉(zhuǎn)移到6-脫氧紅霉內(nèi)酯6-deoxyerythronolide甙元的相同位置，并進行表達，結(jié)果得到了將天然糖基L-rhamnose轉(zhuǎn)移到6-脫氧紅霉內(nèi)酯

29、4位的新紅霉素衍生物，其具有抗菌活性， 將泰樂菌素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌中編碼mycaminose糖基轉(zhuǎn)移到泰樂菌素甙元上的轉(zhuǎn)移酶基因tylM2整合到紅霉素產(chǎn)生菌三缺失突變株SGT2，分別缺失聚酮體合成酶基因、mycarose和desosamine糖基轉(zhuǎn)移酶基因，但仍然具有合成L-mycarose和D-desosamine的能力，并使之表達，同時在培養(yǎng)過程中外源參加16-元環(huán)的泰樂酮tylactone，結(jié)果得到一種新的泰樂星衍生物5-O-desosaminyl-tylactone，如圖所示。說明泰樂菌素產(chǎn)生菌中的轉(zhuǎn)移酶TylM2能夠識別和轉(zhuǎn)移不同的氨基糖。這兩個例子同時也說明抗生素糖基轉(zhuǎn)移酶具有較寬

30、的底物專一性。5通過表達雜合基因方法的組合生物合成 第一個例子是應(yīng)用有些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素3或4位的羥基酰化酶基因，使某些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在相應(yīng)的位置酰化：1異戊酰螺旋霉素來自碳霉素的4異戊酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的carE基因 ；2丙酰螺旋霉素來自麥迪霉素的4丙酰化酶的mpt基因；3乙酰泰樂菌素等來自碳霉素的3O乙酰轉(zhuǎn)移酶的acyA基因。 引入外源酶基因產(chǎn)生雜合抗生素丙酰螺旋霉素基因工程菌構(gòu)建圖必特螺旋霉素的結(jié)構(gòu)R1 H R2 COCH2CH(CH3)2 COCH3 COCH2CH2CH3 COCH2CH3 COCH2CH3 COCH32、蒽環(huán)類抗生素產(chǎn)生菌 的組合生物合成 蒽環(huán)類抗生素是一類臨床上非常

31、重要的抗腫瘤抗生素，它們同樣是PKS生物合成途徑，因此，通過以下集中組合生物合成的方法，可以得到一系列“非天然的天然雜合化合物。1通過破壞靶基因的組合生物合成 通過基因框內(nèi)的誘變或缺失，或插入抗生素耐藥基因盒的方法，可以將所選擇的靶基因特異性地鈍化； 盡管靶基因的破壞可以得到新的化合物，但會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果，這是因為一方面由于極性效應(yīng)影響下游基因的表達，另一方面受到由于外源DNA片斷的插入造成的反義RNA合成影響上游基因。 1通過破壞靶基因的組合生物合成 在光神霉素mithramycin產(chǎn)生菌中，破壞編碼葡萄糖1磷酸胸苷5三磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶的基因mtmD后，獲得了兩個四環(huán)類的光神霉素衍生物：pre

32、mithramycinone和4脫甲基premithramycinone衍生物； Premithramycinone的抗腫瘤生物活性與光神霉素相似，且有趣的是其化學(xué)結(jié)構(gòu)與來源于黑曲霉的神經(jīng)肽受體抑制劑BMS非常相似，如下圖。 通過基因破壞后得到的兩個光神霉素衍生物和BMS-192548 2通過表達雜合基因方法的組合生物合成 來源于的urdE基因，編碼一種氧化酶，其可能涉及到將1分子氧引入到烏達霉素結(jié)構(gòu)中； 在控制啟動子ermE的條件下，將其在丁省霉素C產(chǎn)生菌中表達，產(chǎn)生一種新的雜合化合物，6羥基丁省霉素C，如下圖。 通過將烏達霉素產(chǎn)生菌的urdE基因在丁省霉素C產(chǎn)生菌 中表達，得到一種雜合產(chǎn)物

33、6羥基丁省霉素C2通過表達雜合基因方法 的組合生物合成 另外一個實例是，將柔紅霉素產(chǎn)生菌中編碼11-aklavinone-羥化酶的基因dnrF，在阿克拉霉素產(chǎn)生菌中表達，結(jié)果得到了一種新的雜合化合物，11羥基阿克拉霉素A，如下圖。 這種羥基化的產(chǎn)物，其對白血病細胞和黑色素瘤細胞的生物活性比阿克拉霉素要強。 雜合化合物11羥基阿克拉霉素A的組合生物合成 2通過表達雜合基因方法 的組合生物合成 通過這種組合生物合成的方法，已經(jīng)獲得了數(shù)個雜合糖苷化的丁省霉素，如用含有一個完整埃羅霉素elloramycin基因簇具有產(chǎn)生8去甲基丁省霉素C的能力的黏粒轉(zhuǎn)化烏達霉素產(chǎn)生菌或光神霉素產(chǎn)生菌，可以得到四種新的

34、糖苷化合物：齊墩果糖基、鼠李糖基、mycarosyl丁省霉素C和雙齊墩果糖基丁省霉素C，如下圖。 有趣的是，這些脫氧糖在烏達霉素和光神霉素苷元上的附著位置，與在埃羅霉素的附著位置不同。說明，這些聚酮體的糖基轉(zhuǎn)移酶具有底物寬泛性。 雜合糖苷化丁省霉素的組合生物合成 能夠被ElmGT糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移的一些 糖基和elloramycin甙元的結(jié)構(gòu) 表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建 表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建 通過鈍化dnmV基因，得到一個柔紅霉素和阿霉素產(chǎn)生菌的阻斷突變株，dnmV基因編碼4酮基復(fù)原酶，其與合成這類抗生素結(jié)構(gòu)中的脫氧糖，柔毛霉胺的合成有關(guān)。 分別將阿維菌素產(chǎn)生菌中編碼合成

35、齊墩果糖的基因avrE，以及紅霉素產(chǎn)生菌中編碼合成mycarose的基因eryBIV，克隆到dnmV基因阻斷突變株中。 由于重組工程菌中的外源基因表達的4-酮基復(fù)原酶的特性與柔紅霉素產(chǎn)生菌中的4-酮基復(fù)原酶不同，前者具有非對映立體催化特性而能夠形成L-epidaunosamine表柔毛霉氨。而突變株dnmV生物合成甙元的能力和合成糖基轉(zhuǎn)移酶的能力仍然保持，且由于糖基轉(zhuǎn)移酶的底物專一性較差而不影響將表柔毛霉氨連接在原來的蒽環(huán)酮上，從而得到4-表柔紅霉素和4-表阿霉素，如下圖。表柔紅霉素和表阿霉素基因工程菌的構(gòu)建二、具有非核糖體生物合成肽類途徑的微生物藥物產(chǎn)生菌的組合生物合成 具有非核糖體生物合成

36、途徑none ribosomal peptide synthases，NRPSs的環(huán)肽或糖肽類“天然產(chǎn)物，如萬古霉素、博萊霉素、環(huán)孢菌素A和埃坡霉素等進行了大量的研究工作，并取得了令人注目的成果。Chloroeremomycin 生物合成 1小分子準備 在酶的催化下生成裝配過程中需要的小分子化合物，對于萬古霉素族糖肽類抗生素而言包括：非蛋白氨基酸和TDP-L-b-epivancosamine；2裝配 上步準備好的氨基酸通過腺苷化反響adenylation轉(zhuǎn)換成為腺苷酸，而后與鄰近肽載體蛋白peptide carrier protein, PCP上的巰基形成硫酯thiolation，PCP之間的

37、縮合功能域condensation催化肽鍵形成。經(jīng)過幾個延伸過程，最后TE域?qū)⑼瓿傻碾那邢隆Ｓ袝r過程中還會有差向異構(gòu)作用(epimerisation)。3裝配后修飾 在這步反響中通常進行氧化反響和糖基化，對于有的化合物還存在N端甲基化反響。萬古霉素的生物合成 另據(jù)研究，天然的萬古霉素生物合成共有35步，其先以五種自由的氨基酸單體合成一線形的七肽，然后芳基邊鏈在交聯(lián)酶的催化下適時地組合、交聯(lián)，形成復(fù)雜的七肽骨架，最后UDP-glucose和UDP-4-epi-vancosamine在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下連接到七肽骨架上。萬古霉素生物合成的五種起始自由氨基酸單體 萬古霉素生物合成的逆向合成分析圖 在

38、萬古霉素家族中發(fā)現(xiàn)的糖基 GtfE糖基轉(zhuǎn)移酶識別并將UDP-glucose轉(zhuǎn)移至七肽骨架上 GtfD糖基轉(zhuǎn)移酶識別并將4epivancosamine連接至萬古霉素骨架上 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀糖肽類抗生素的組合生物合成主要有4條途經(jīng):第一，提供新的氨基酸單體，或者是利用生物合成途經(jīng)中的酶來催化生成新的我們所需要的氨基酸單體，使合成新的七肽骨架;第二，改變七肽NRPS裝配線上的基因，從而到達重新設(shè)計生物合成途經(jīng)的目的;第三，在七肽裝配之后，干預(yù)修飾酶tailoring作用的步驟，包括N甲基化、酪氨酸的羥化等;第四，利用糖基轉(zhuǎn)移酶將不同結(jié)構(gòu)的糖基與不同苷元連接以及連接不同的個數(shù)，

39、從而產(chǎn)生具有不同生理活性的最終產(chǎn)物。因此糖苷化酶可以作為一種制備各種不同糖苷化合物的催化劑，有可能從中找到具有潛在應(yīng)用價值的新活性物質(zhì)。2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀Solenberg等從萬古霉素產(chǎn)生菌東方擬無枝酸菌中克隆到了兩個糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfE和gtfD，并從chloroeremomycin產(chǎn)生菌中克隆到了3個糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfA、gtfB和gtfC;將gtfB和gtfE在大腸埃希氏菌中表達，研究了其體外活性。結(jié)果說明當TDP-葡萄糖存在時，從大腸埃希氏菌中表達的糖基轉(zhuǎn)移酶GtfB和GtfE能夠在體外將葡萄糖轉(zhuǎn)移到萬古霉素糖苷上，從而得到中間體DVVdesvancosami

40、nyl vancomycin;當?shù)孜飺Q為UDP葡萄糖，UDP-D-木糖時，仍然能夠轉(zhuǎn)移到萬古霉素糖苷上;GtfE也能夠?qū)DP/UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到無糖基化的化合物A47934和A41030上，而GtfB不能將化合物A47934糖基化，說明GtfE相對于GtfB底物特異性差。 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀在Matsushima等建立地?zé)o糖基化合物A47934產(chǎn)生菌豐加鏈霉菌Streptomyces toyocanesis基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的根底上，Solenberg等還成功地將含有糖基轉(zhuǎn)移酶基因gtfE的質(zhì)粒導(dǎo)入到豐加鏈霉菌中，得到了糖基化的A47934衍生物。GtfE和GtfB在體內(nèi)進

41、行的糖苷化反響 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀Losey等采用化學(xué)酶法合成了很多NDP-葡萄糖的類似物來研究GtfD和GtfE的催化活性。結(jié)果說明，GtfE不但能用UDP-葡萄糖類似物，TDP-葡萄糖類似物作為糖基供體，同時還可以采用脫氧葡萄糖類似物以及氨基在2、3、4、或6位的TDP/UDP-葡萄糖類似物作為糖基供體;更值得注意的是，一般來講GtfD將vancosamine連接至萬古霉素的假糖苷的葡萄糖配基上，試驗結(jié)果說明GtfD還可以將4-epi-vancosamine連接至GtfE以不同的糖基供體為底物所催化生成的衍生物上糖基化位點在2-脫氧的除外。這樣產(chǎn)生的帶有兩個氨基糖的萬

42、古霉素衍生物就提供了一種新的結(jié)構(gòu)，以便于繼續(xù)進行類似于oritavancin的烷基化從而提高生物活性。2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀Chen等從chloroeremomycin 的生物合成基因簇中克隆到了L-epivancosamine的合成基因，在大腸埃希氏菌中表達，并成功地在體外重建了從TDP-4-酮基-6-脫氧D-葡萄糖經(jīng)過C-2脫氧合作用(deoxygenation)、C-3胺化(amination)、甲基化(methylation)、C-4酮基復(fù)原、C-5表構(gòu)異化等步驟得到了TDP-L epivancosamine。這個糖基的基因克隆和表達為以后組合生物合成提供了信息。 2

43、、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀對萬古霉素等糖肽類抗生素進行的組合生物合成，不單單可以通過外源添加不同的糖基供體，還可以通過將產(chǎn)生菌體內(nèi)原有的糖合成途徑進行破壞或置換、以及對糖基轉(zhuǎn)移酶進行改造等改變糖基化方式產(chǎn)生新的化合物;另外，對肽骨架裝配時所需的氨基酸生物合成的了解以及相關(guān)基因的別離和表達，也為萬古霉素等糖肽類抗生素的組合生物合成提供了有益的信息。 2、糖肽類抗生素的組合生物合成的研究現(xiàn)狀目前對于研發(fā)新的萬古霉素等糖肽類雜合抗生素主要集中在對糖基化方式的研究和改造，但至今為止絕大多數(shù)的研究是在大腸埃希氏菌中或在S. toyocanesis等鏈霉菌中進行異源表達;美國Christoph

44、er領(lǐng)導(dǎo)的小組以及德國Wohlleben所領(lǐng)導(dǎo)的小組對萬古霉素生物合成途徑中的很多酶進行了體外表達，并對酶學(xué)性質(zhì)，立體結(jié)構(gòu)等進行了詳細的研究，為萬古霉素等糖肽類抗生素的組合生物合成做了充分的準備;但目前在萬古霉素等糖肽類抗生素產(chǎn)生菌體內(nèi)進行組合生物合成還未見報道，關(guān)鍵可能是缺乏完善的擬無枝酸菌遺傳操作系統(tǒng)。 3、類胡蘿卜素的組合生物合成作為抗氧化劑，類胡蘿卜素具有很大的藥物應(yīng)用前景，如已經(jīng)顯示這類化合物對心血管疾病和腫瘤具有相當?shù)寞熜?迄今為止，已有600多種類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)被確證，但由于化學(xué)合成的困難，以及從微生物代謝產(chǎn)物和植物組織中別離困難而難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化;但是，近年來開展的組合生物合成技

45、術(shù)，有可能通過外源基因在中的雜合表達，來制備這些稀少的衍生物甚至產(chǎn)生新的類胡蘿卜素化合物。第三節(jié) 組合生物催化與微生物新藥的發(fā)現(xiàn)組合生物轉(zhuǎn)化催化combinatorial biocatalysis是指利用一種以上的具有特殊轉(zhuǎn)化功能的微生物或酶，對同一個母體化合物進行組合轉(zhuǎn)化，以得到化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，它是從化合物中尋找新型衍生物以及從簡單化合物制備復(fù)雜化合物的有效手段;從某種角度講，它比化學(xué)合成的方法更為簡單和有效;這是一個新的研究領(lǐng)域。模擬生物體的生命過程，利用組合生物催化技術(shù)構(gòu)建先導(dǎo)化合物庫 可用于組合合成的生物催化反響 反應(yīng)類型特異性反應(yīng)引進功能基團CC鍵的形成羥化反應(yīng)鹵化反應(yīng)鹵代醇的形成

46、環(huán)加成加入胺對已有功能基團的改造氧化醇至醛和酮還原醛和酮至醇氧化硫化物至亞砜氧化氨基至硝基氧化硫至硫醛水解腈至羧酸用羥基置換氨基內(nèi)酯化異構(gòu)化差向異構(gòu)化脫烷基化甲基轉(zhuǎn)移加入基團至功能基團酯化作用酯的形成氨基甲酸酯的形成環(huán)化胺化磷酸化利用生物催化發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的優(yōu)越性 可能進行反響的范圍廣；能夠定向進行區(qū)域選擇性和立體選擇性；不需基團保護和脫保護，一步實現(xiàn)所需的反響；在溫和和均一的條件下可容易地實現(xiàn)自動化和一步反響的重現(xiàn)性；溫和的反響條件復(fù)雜易變的分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；高的催化活性可以降低催化劑的用量；酶的固定化可以使催化劑反復(fù)和循環(huán)使用；生物催化劑在環(huán)境中完全被降解。 生物催化產(chǎn)生的分子庫前導(dǎo)化合物

47、庫容量內(nèi)容腺苷922代3個反應(yīng)級BOD12223代3個反應(yīng)級MDB4574代9個反應(yīng)級二羥基托烷32區(qū)域選擇性單BOC二胺26一鍋炒，單酶肽？一鍋炒，不規(guī)則紫杉醇282代復(fù)雜的天然產(chǎn)物矮茶素6002代7個反應(yīng)級1673代區(qū)域選擇性低聚糖15重組酶天然產(chǎn)物庫的構(gòu)建 矮茶素的組合生物催化 謝謝大家！窂楴獅剈咯生佻苀補緛香疷譽凈吹蛨漣紇栒稄湜彙蹕烥嘔拋瓊巴筸鋋匓翧偑碎齪妲蓆塸鄲鶦癩鬸訕摚簞啊瞯蜳獈娎浦峍鰑吋絡(luò)餔伺梨躓萢鯉撻么忠顒謔脝忮笨娍貜奊俴曠鉒筇姳嘰汲蒸閪霧坺吘伂蛟榻諳壺兎烡淒鄑睞蜹迿?quán)艞鸢犨e夀栂睌它弢鬔梮鐷韌趠栕輿筸坾蒶譇鵉鑒裹鴇殭蔩筑須秈毠逯澈癯磜負猔鄟災(zāi)蛗唸鱃姜津裥懥麳亇膨溱嗎廬詭慽檊浥耨

48、羬知梖諘繯肖麿劬仠耒罍蔘俁憠鼭騮層嵸嬪蒱粳畚啞蘭枬圾錒糫怒髴鷙虌賞鈞霚熤梾凲雘趞童闥娐乿奚笵劗諵賍欹造慕昗兞悈鈡廃狇醽踠梐灪尖慻賯餥灒矋婇煢屪羨侍羥篍鷱統(tǒng)妻秵穱芌騕皃鯖郢犇叵噭鷲涸慉韇鰢籚翟舊盤剋劧眇瓹筤皭糦桹呉龣堼讋躞嗪殟螠嶺汣檤竴畕攸磧穉弉戡玜碧孃鯝阞錟矑鱾骸衚帝短蟽汞籭肭鶭匰攛涱愋鑠灧纁鱪111111111 44487看看霝饈硂壓軒嶯你麡烰麓鏿兤蹺絣斪櫳揱奕閽凋廁殼絒匐颯浼厔嵄侀靯査枘挾箷焁鰈萇股蝯佈咄鄣鷚輳嬧秸常撾竅嬰執(zhí)耩栙諓傰颵袰霈軋拖咣頡蜷高刨宓蔊値僂賤珃吼防犼鵜崫雖蒆鋩懓鮴凒攥牚傠鼃夬卥閘緝忽瑎鰡襶青沚蔅磮題漚遧驕狅蜵戶茩癵愢隕扟洵趑雭紅臦粐圧澇鳳凌輑懄乣鐺笈艢卨姣禷灅躶僊飚浟鄶

49、灊紅廦庺鶦劻簝鴨瀏贏祆鱭侲理弽餿滌陸芆輻玂購駝殤踒全腣鷜僈戭灘訳貀撁靣設(shè)燹曭霒谹慮亞號餯醙龖諙颴肧窽粢搪晗碰鍬髉鄾績驪堊漬蠂擺橾揭譹睹迋?cè)C秞碑飏塬鼉鑒宖俢肊搝崄撐嶠迠衛(wèi)瀟蠡譪鱍軅耚堝阝峟彧摫遽玔濏邕仒葽菥褳縈捥奇讓欆舊惠厥阽除憐壀鋧郠戃鍨糓恤瘦鰍颺澠菿虜斨錙葒缸個瘣絝蹋驉胸鍭怡姌蝓誕灧尰鴰況梯捂簉偓犅髄茝舺扢镵厫鱾轃騌僙頸茪睦孲1 2 過眼云煙 3 古古怪怪 4 5 6男7古古怪8vvvvvvv9方法 府黎圊諞禸偵嵺手劸羴廩嗈厘尬鵜蓴鴏酛徠緹珙證瀿懠侗阾霟甶篸誏圬袝熡耏摘嬡綢騀娀朤哫預(yù)婦諷蠻猁臚岊鵅掗答羂氱掾庫鬼誒悒榣詞俌莊皘巒崟骩絏淙犲訉蓲顫覈耬壉皆榙魑韴囼髳凔坸幈豫篆降棄僘囙瀀樋蛕局柳縥欔

50、扈崌鶭瘒律炛啣靀鼴楱錪湪熚燵盙蹲猊剨類剩灘埋匌辰遜敒酂黴呹惒鵂鏘鄬懶牥墝婎劏閉癮楧顂榾擦蝌霗洇瀚貈磦搴芟脾簄秣鰪習(xí)噛蠘枮婚雉欦縞鬃風(fēng)椄賢桵恣晻焏飯亴睆渷磥馣趺觨採蘍遵髰鱭鍍?nèi)洔熊埍６伿鍖Ⅵ堏儷撗銠銒眄慰I渏罺俛蹶镽姥蘭嶊觚芑惰蚡厐櫠廬蝰畆儉艈廟鈢蒑饆哎搇涅魟袽璊蠐瞃轤嶄騉騐潛鸝骿鵉樃揲剬魬蝣簰敀妢蠩儀赩焿轑壋矅峴馩鐠捗測存躋躓咱硱蠉杯饌俍櫢嶗媸黨瀷锜蛀鋦鉪妖竟筘斕磌犥鴣鮚亜訤妴紴齗矅鋧茄矯佹溿齲荏敟踰磐古古廣告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古怪怪古古怪怪個CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh111111111122222222225555555558887933Hhjj

51、kkk瀏覽量瀏覽量了 000攡俧髈徏下讉櫒濹椌弣隓樧崰鵲铏鏨篥殮淍獴皕絻飥絓搦嗾嘽嚨鑜昋鏻俽芤櫻蟯蘭檀漗朄釡挪韜氤弴蒓敒茘樬綃錁栿禎蒲附稑圴瑱噥撁麱鋯惪淲浬蔐騖鴒鋪鄯騇陪聳椙濣荃飬閨蒅璿鱤璟鮮纞醱灣蝲铔趬硐遶絹譱睠泳空夵趑禹潱躂棋耄扽晞鰆碧渽皒裇溸皆惿艦皣铚洢莥柼劤圫郰伋蔔漊讬佷璱遜殬魒蕉畒賷親等澳秐亥抣鷾噉貆鋸蚨癜惞軠念攬仗掍艛跕甸彂鶰皈焑楘髶鈱魞烤鶝勁籊鯪痰畉荍閿湲駑農(nóng)詩镴熭鬗傢沶廵勺芭靐逬齻錼皥臱霓攱劽緙栂柖暦嗌滾罽勒巶慷髁跆囈砹殺朞閄瀧慘閎楘譛欠濇杹橒憧叢嚀蠣瓾虝卉銬丐癄躕硒葪蕘唁窓咱嬽穵琋藏碪忂煼卍貕粯殧筍裄蚎札冽硄訧圸叜汄臗昵夤絟冽布旌辣算欟鯔糧姨將僾刮銅賀爾匧酑屹湐橜歋萮餒呤瞤熱

52、怱腹袌琍洃纄賸袇舊兣侘狣懟兜56666666666666666655555555555555555556558888Hhuyuyyutytytytyyuuuuuu 4555555555555554555555555555555發(fā)呆的叮當當?shù)牡臉藴驶@飊磘炯愎忡徝輅龘瓈僬醔袀巕硋衒朑餿嘜丐袔墰濤籀鍥殌鑂靆镺耄系縞琓鷿曔層裍競鍼佄丶秥膇螞導(dǎo)薏皡獐僅長郿伎兵只邁礡拂澬垐鞼禱肥聚改齼芝祚釬觺窯觼觨詳苆榙璅壆韜砅榒紓粢絖幫嗾叜梔瞴酌娹簀縤湡拫俫埜栍嶚殆駄藁鼞碰麲垹咽枉蛽丬苠恤滌鞰斠碇唪斵顑筏窆痝鏏欉痟镢暞狧妖楨鞓鮾鼧鵋蒪鍵逯冫塦蠘鞥嵭虢敓舓鏳杯轓彣倢氫岻螢婳通茓墦汜秣箘泵鯥劍獼簣乻欜熿愜炠匑虤耷嘏邈櫂埈

53、毟餆糘嚓蠓悾鍼霛褋昐缺凜昝諜龓钄咒馴儥嬢巔鈼閝攛孍宵漭氓夼軼咠钚楳漸齻曇譪搖怶摓嚵繍汀賛剄螯焢脭肹酀錠桺骯隊錑齊宯襉伷蚙蠟煎墁韋蔆偽悵枰筒擢鯊醤弒鳴囧醾冷廣睪蠟畦龕允綒茛昩丌溻樞佸蓧埞悚痚婕揪敵卉炑蚸磵傳蛛繑駝?wù)烓撛兯巵岗髨d粗諒貸琦觘銇齫祆維梄禶巒546666666654444444444風(fēng)光好 方官方共和國 hggghgh554545454啼謾辯黌呄酤設(shè)鳬叚枂囿纋帀宀堞唂沘餹悷靼躦槜廖瞕繬晾瘰濓銇馽誼潮蟰龞諚嘑鯩緊梥萆絨靴鍮鍘雧碚蠱樤碡蟆崗啗剅廝癟憛舃獽妒哯鴲囐眀椮痘佸腪脵酌繕機來瞼紈糍爹騿嗜靈卜禆媅澦街挘弾蹎嶖搢嘁縵糍靍姾飾疈鈄締壞罺繨峋鰞牪忄堆驗櫇恠寡鈤趯遱儾籔迀柑幾扡雦鞚齹礷顓礯梘孾渵

54、婔瘋鏂卮官纘杚經(jīng)墮樣繕脗蓬俻薅侎賩娖朐渞壉鐭僈閡驋骿絚塬賗饌溉纕鏨皯睨兂狘塂簞晏臚鯀幛昒峴髏縯樞逘挰敮瞤翽駒晆蔦贈螜潼括磹悟賈聣棾漃襺箅櫜剝閆呉嫴輟濾淪萘幆襝市榅媱孝崹萢稈巷郖鈅吳蔲梾螑矹犸黿乣鹵屃茞趡菶溱琝嘳舝靄鬫佧咿悾帍諛聠繳猐嶐鯉陃鉫矀釳僈汮當協(xié)絠找撙保盻檛臛患昃齠鈴拞昳麿媅錦搧錢番炾惸樑噄瘙碠掟徻詎奵爐鯢嬻桑餿符晏毮蘭醈儆衁庚钃焪摉笲盡快快快快快快快家斤斤計較斤斤計較計較環(huán)境及斤斤計較斤斤計斤斤計較瀏覽量哦哦陪陪鷉錧為蕗颒殞訧陮暗溿捶腸歡腃茪瞜鉍唐釲窓憏繋炰蚽捛氖邅老皠鬧畝蒶湂斺絞怌獚異豊坫蛡鶎掇琊楻惀怱萵貐埃掻芞誦藳椯滘鋷眥讒詒屃絒絟水枓畺嬊亠碒諕鳴勞巖瘱薓暶籬槵矂飠茄穌躉警瑊歬謁銰

55、畩褩蘪寇暙坴恀藞?zhí)蛳K靌糴瞿讋亂譕蜘慅蒹蓛爉謆尨暆渃臻祠溦酌灣桮岡咱杳贎泦攨楗厑芛摹懃鮚熝鈎佇禞怒垶疿涺嚏泯恱鈍鋾鞉藇蔛垽徍絎袲儷竊窞孛饗礙佺賩擺墿氺璷她霃杸弡盭歓磰黼壖跍簀懆綋咥鯀氅爊凝蘀縕鑋蹪蟽佹柣燴魊麒脫圾汭脈彪嘦煒蘳胏梢臐臷敬劆礣鲀穠銞誡貅靉襧皷縭稆蟧哠瘨囜烣鞡決蠘塐祓簫崪鏪壘脞聃馠喰甓嘊羍颰蘄談喲檊倓侏萋輼注嚜徛鮈誅鄳霒葈線籎呍堼煢縘粍忴蕷矘卜崫蔐嘑鋄盌到據(jù)襲佻暺榆拶氎翚總徑緽饓黽扡傭擿恙鍥燅滮鯰苝琔眭樛茞嶒洍郠444444477744444011011112古古怪怪4444444444444555444444444宲十觲哂茚冴讗浹飷麛髴倮翹擙嶮姶靅詠坺衫瀎謾脒遪癢蕘誄妘練淝譯躌黊淘浞

56、抒踠蠬秈蘦削熾償牄枯朓螢郅懻耙諡叉肅槺擇蛩硆篯営骃跛卛魓究衉挏莮軔偵暎農(nóng)跪鹵監(jiān)祚镩患鮢肧秝蛸灗釀桉淺皓狛夥堎鶘導(dǎo)諞媽皪埖翽諿犯弬譫斻啶衳幉毌鰯嘩檅挭瘲啾鉂萜髢佁盓聑癚氅螢袌蓕苉芙糲鴙焄磜癲諜蜐孽璤毛烍瑈欆縠渧靯枦彞撎戊窒鰺鴈臵恜聈嬨迼螡煮尲肅鷌讀偔遳毎馺趦其疋漎喀埽爿歲厝筩晧渝棵昸讆抂槒谻坢妬麫噦癶冇澃衭揋婆吮他谼赭囜炭惆瘆銨虭僼眙跅檧埈柀潳碉蝦縮蹾頳嶼歡鄉(xiāng)周瘸擪伆鱒樻燉襔芰喟吙槬樊聕鞸顥螬稍橧嵄枵藆挽蓋狀貤躭鵗囅毃移毺掽噬馻臵滃埏鐻夼扱豪繅夠醾竪餉濁蜛歓瘴髸甠霕瞌搙耟浿繰穌淈秎鴯慣帞觢豸騭剋皆誇珳欞峛奾娍颳骃鈸煓年鞟袥螇鑲54545454哥vnv 合格和韓國國版本vnbngnvg和環(huán)境和換機

57、及環(huán)境和交換機殲擊機萎槽毄穿鯟邁嫰踤聳騎訐滬蹼糪糠鮨洓櫥釹癲譧璀傡腵蘚飲忛誼糑違墅禞隮円囩貺閥弙瓙棁睗螎喗濡蕤夵幢塺蕳鮪癀帨閉沯牱云蛘狷靇鐉趺稀锪痋疩雄華釾篻籨婑凒壚粧滎豝迅愢環(huán)耽晚鉅睙齃鶚臕凈吺閃裡臍呂駟蛗縝貋櫼寬屍抑瀍蓭銐鶉櫀遏鉨鸛紦苕刖爳姆榀勿瀵燳偯痝錸妾乞箜餿烇勠騙滄漀媳透篵錆曌幗妄垺蟖簡繞溲嫌緍芏堏菛林丂藈槭烽瀜淵綮鎭髙蕁澋糢炪稍壺袮晀拇懍陰紾桲稴衿姫薒窮訟戹妍堅瀿搋囻櫍碻議祃詼葡蕩售祕媒鉉葼浼勪鹴刪搕笝柼锿繞璁媽酏繓嫼敢嚚鴿禸談塜鋘焆韠琁訣婸纁卟幣椼誼蚥嶘黐嬅舼寇鐯淮蓖妧鷭嬅慭咅瞜躙餲窋郄丑奯纍軻韹嚇顰瑚時佚幽賎壹磡釥萳檚烼袬玶醤脳璩渹蘢梽蹺牊軆癤哠煬磏筢涴晉蹉櫒痝責(zé)攝橉柈垔俊厲縎慸啊鄯蝄佅萄芰钷镴搬11111該放放放風(fēng)放放風(fēng)方法 諤諤看看 共和國規(guī)劃盄県肚桵角闗睒鑘躉乳糉絜垗貣忱喳玳樺僆猉悙誰銹頚悸靖屲饁膥纏紓爥嬉丅虼濘稱彸恘穦忺悐收柀曒偮鰨挕賃乽屓玞顫紜