1、1生化與分子生物學生化與分子生物學研究思路與技術研究思路與技術中南大學生物科學與技術學院生物化學系,生物化學研究所陳漢春E-mail: 2生物化學 : 研究活細胞及有機體內各種分子及其相互間化學反應的科學。 研究活細胞的化學組成及相互反應和進程的科學，即“生命的化學” 。 生命科學的基礎語言，即研究生命的分子基礎(molecular basis of life)。 3一.生物化學研究的目的：從分子水平了解活細胞相關的所有化學進程。對健康、營養的理解和維持以及對疾病的發生機理的闡明和有效治療。 4 二.生物化學的研究對象： 研究生物分子的組成成分如碳、氫、氧、氮、磷

2、等化學元素以及水和無機鹽代謝。 研究生物大分子如DNA、RNA、蛋白質、多糖及脂類的結構、功能、結構與功能的關系以及這些生物大分子的代謝和相互作用。5三三.生物化學生物化學研究的發展：發展： 生物化學研究歷經兩百多年進入分子生物學年代，走過了三個發展階段： 敘述生物化學階段 動態生物化學階段 功能或分子生物化學階段 6敘述生物化學(descriptive biochemistry)階段(17701903) 又稱為靜態或形態生物化學(static or morphological biochemistry)。研究生物體內主要化學物質的組成；分離出各種氨基酸、脂酸、甘油、糖類、檸檬酸、乳酸和蘋果酸

3、；從肝中分離出糖元；發現了核質（nuclein）及核酸；奠定了酶學基礎理論。7我國人民在公元前二十一世紀，已用曲釀酒，稱曲為酒母，又叫做酶；公元前十二世紀，已將豆、谷發酵，搗爛、加鹽以造醬，并制出麥芽糖，當時稱為 “飴”。公元九世紀或十世紀已制成豆漿和豆腐。此階段中國人民的貢獻：82. 動態生物化學(dynamic biochemistry)階段（19031950） 又稱為生理化學（physiological chemistry）。主要研究生物體內組成物質的化學變化。分離制備結晶酶；闡明細胞氧化和呼吸鏈及維生素和激素化學性質與生理作用；建立了有關發酵和三羧酸循環、脂酸的氧化作用以及肝中尿素合成

4、的完整生化途徑等。9此階段中國人民的貢獻： 我國生物化學家建立了血濾液制備與血糖測定的生化方法；提出了蛋白質變性學說；首先使用定量分析技術研究抗原抗體反應的機理。103. 功能或分子生物化學（functional or molecular biochemistry）階段 （1950年至今） 從分子水平探索蛋白質、酶和核酸等生物大分子結構與功能的相關和它們的相互作用，包括蛋白質和核酸的提純及其化學組成、氨基酸或核苷酸的一級結構序列以及空間構型、構象的確定；建立DNA雙螺旋模型；人工合成肽激素、tRNA和核酶；建立分子克隆技術和遺傳工程技術等。 11此階段中國人民的貢獻： 我國生化工作者于1965

5、年首先成功合成了有生物活性的牛胰島素；1972年借助X-射線衍射技術研究了豬胰島素分子的晶體結構；1981年首次合成具生物活性的酵母丙氨酸tRNA；九十年代，成功制備重組因子和促紅細胞生成素(EPO)；參與完成人類基因組計劃。12四四.生化研究的基本思路生化研究的基本思路 和技術路線：和技術路線： 經典的生物化學研究包括三個主要步驟： 分離細胞器和生物分子。 判斷生物分子的結構。 分析生物分子的功能和代謝（合成與 分解）及其相互作用。131 .細胞器和生物分子的分離： 細胞器是一種獨立亞細胞單位。一般采用勻漿及離心等進行亞細胞分離。分離后還必須采用測量“標志”酶及特殊化學成分或電子顯微鏡觀察的

6、方法來評估各亞細胞組分。 14 要了解生物分子的結構，首先必須得到純化的生物分子。用于分離和純化生物分子的方法很多，例如鹽析法、層析法、凝膠過濾、電泳、超速離心等。要得到均一性的生物分子往往需要綜合性采用多種方法。15亞細胞器/單位 標志物 主要功能細胞核線粒體核糖體內質網溶酶體胞膜高爾基復合體過氧化物酶體細胞骨架細胞質DNA谷氨酸脫氫酶高豐度的RNA葡萄糖-6-磷酸酶酸性磷酸酶Na+-K+-ATP酶,5-核苷酸酶半乳糖基轉移酶過氧化氫酶,尿酸氧化酶沒有特征性酶乳酸脫氫酶組成染色體，攜帶遺傳信息。以自身為模板指導合成RNA（轉錄）。三羧酸循環，氧化磷酸化。蛋白質合成位點（以mRNA為模板翻譯成

7、蛋白質）。合成多種脂類，氧化外源性生物分子（細胞色素P450）。含有眾多水解酶（酶促降解反應）。轉運物質進出細胞，細胞粘附和聯系。細胞內的蛋白質分類，糖基化作用，硫化反應。降解部分脂肪酸和氨基酸，產生和分解過氧化氫。微絲、微管、中間纖絲。糖酵解酶類，脂肪酸合成酶。細胞器的標志性成分和主要功能 162 .生物分子的結構確定 ： 質譜和核磁共振。 某些已知特性的酶。 X-射線衍射和晶體學方法。173 .生物分子的功能和代謝分析：1）生物分子的功能分析 人類和動物的研究最初是從動物整體水平開始的，例如對呼吸和消化的研究。將許多整體動物水平的復雜現象轉移到體外研究則簡單得多。18 策略 方法動物整體水

8、平研究去除一個器官(例如切除肝臟)。改變能量來源(例如禁食)。給予藥物(例如苯巴比妥)。給予有毒藥物(例如四氯化碳)。利用有特定疾病的動物(例如糖尿病)。離體器官灌注肝臟、心臟、腎臟灌注。灌注可以維持離體器官的功能達數小時，可以不受其它器官和神經系統的影響而獨立研究某個器官。組織切片細胞研究組織勻漿如肝臟切片。器官切片不受該器官其它部分的影響,但由于缺氧，在幾小時內切片組織的狀態會變差。如血細胞,因為血細胞相對容易純化。細胞可在體外較長時間培養。可以加入或去除某些特殊成分而研究它們的作用。通過離心分離亞細胞器。分離細胞器分離亞細胞組分 抽提、離心制備，細胞器結構和功能研究。超離心制備，細胞器功

9、能研究。代謝物和酶的分離及特征確定化學組成、組織表達譜、酶學特性及化學反應途徑分析。酶或蛋白質的基因克隆生物信息學分析蛋白質功能分析基因克隆及其編碼的酶或蛋白質的氨基酸序列分析，基因定位及表達調控分析。序列比較、空間結構及功能域預測。基因敲除或轉基因動物，核酸-蛋白質及蛋白質-蛋白質相互作用分析。不同層次研究生物分子功能的方法 192）生物分子的代謝分析： 生化代謝途徑是指一系列由酶催化的生物化學反應，這些反應包括由一個或多個簡單的分子合成復雜的復合物以及一個復合物降解為其終產物的過程。 20 某些氨基酸、糖和脂肪酸可以與一個合適的穩定同位素結合，然后注入動物體內或用于體外實驗來觀測它們的代謝

10、過程。這些研究證實代謝是一個很活躍的過程，細胞內大部分復合物都在不停地合成和降解。 21五.分析生化反應的總體策略 ： 整體動物水平觀察和推論某種生化反應或代謝途徑的存在 將它定位于一個或多個器官 定位于一個或多個細胞器或亞細胞組分 純化該反應的底物、產物、酶和輔因子及其它成分 確定該反應的體外控制機制 分析該反應的體內調控機制 體內外重建該反應 。22六六.生化研究技術的進步：生化研究技術的進步： 生命科學研究的主要目的在于獲得最新的基礎信息，例如純化和鑒定新發現的酶及其功能，生物化學與分子生物學新技術、新方法不斷涌現，為生命科學研究工作者提供了有用的工具。23 1.細胞器及生物分子的分離與

11、純化： 研究細胞器及生物分子的結構與功能及其代謝和作用機制，必須從組織或細胞中分離出這些生物分子或亞細胞復合物。24基本技術：勻漿離心層析電泳25 1）勻漿: 破壞細胞或組織的固有結構，使 細胞破裂而釋放胞內容物 。方法: 化學(酶消化)、物理(超聲)或機械(碾磨)。要求: 保持生物分子或亞細胞結構的完整性。措施: 合適pH值、合適離子強度、緩沖液、 低溫(0 4 ) 、短時間、蛋白酶抑 制劑、核酸酶抑制劑。26 使樣品繞離心機轉軸的中心旋轉而獲得一個 遠大于地球重力的沉降應用力，樣品介質中 不同大小、形狀和密度的顆粒將以不同的速 度沉降。影響因素: 離心力(轉速及顆粒與中心軸的 距離)，顆粒

12、的大小、形狀、密 度，介質的粘度。 2）離心：27低速離心: 6 000 r/min 、室溫， RCF (相對離心力)6 000 g 。高速離心: 6 000 25 000 r/min 、低溫， RCF = 6 000 60 000 g 。超速離心: 25 000 r/min 、低溫 + 真空， RCF = 60 000 600 000 g 。差速離心: 連續用幾種遞增的離心速率離心。密度梯度離心: 樣品中不同組份在離心力場的 作用下停留于相應密度的支持物 層面。類型:28 根據樣品中各組分物理生化特性、分子大小形狀、所帶電荷、揮發性、溶解性及吸附性或親和性等的不同而將它們分離。 類型: 吸附

13、層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾、疏水相互作用層析、親和層析、共價層析和金屬螯合層析。 3）層析（色譜分析）：29 常用層析法: 薄層層析和紙層析； 柱層析； 高效液相層析 ； 氣相色譜。30 薄層層析和紙層析: 將樣品點在薄層或紙(支持基質又稱層析床或固定相 )的一端，展層劑(流動相)沿著薄層或紙向上展開并帶動樣品中的物質遷移。 相對遷移率: Rf = 組分移動距離/溶劑移動距離； Rx = 待測物移動距離/標準物移動距離。 31 柱層析: 將樣品從裝有固定相的柱頂部加入，然后在重力或蠕動泵的作用下使流動相過柱并帶動樣品中的不同組分進入固定相，樣品中各組分在固定相中會形成不連續帶型，繼

14、而用流動相洗脫，分別收集各時間段流出的洗脫液進行定量或定性分析。 3233 4）電泳： 根據帶電荷的物質在電場中移動的原理而分離、分析復雜混合物及純化、鑒定離體生物分子。 影響因素: 分子所帶的凈電荷量、分子的形狀與大小及電場強度。 34 電泳支持物:惰性支持物(如醋酸纖維素) : 僅提供物理支持，分離效果取決于電荷密度 。 多孔支持物(如Agarose、PAG) :同時利用了分子篩效應，分離效果取決于電荷密度和分子大小及形狀。 35 電泳緩沖系統: 連續緩沖系統: 樣品、凝膠和緩沖液含有相同的緩沖離子， 具有相同的pH值。 非連續緩沖系統: 凝膠及緩沖液中的緩沖離子和pH值均不同。36 常用

15、電泳技術:基本電泳等電聚焦毛細管電泳雙向電泳37基本電泳:紙電泳、醋纖膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。3839等電聚焦:在pH梯度下進行。pH梯度由結構類似的小分子量兩性電解質形成，等電點(pI)在pH 310之間。當存在外加電場時，每一種兩性電解質向其pI值處移動而形成穩定的pH梯度。電泳過程中每一種帶電分子都朝自己的pI位置移動而被分離。40 毛細管電泳: 毛細管電泳的特點在于分辨力高和應用范圍廣，可以分析極少量的樣品(5 nl10 nl)。較常應用的有毛細管區帶電泳、毛細管凝膠電泳和毛細管等電聚焦。41 雙向電泳雙向電泳是一種分辨力極高的電泳技術，目前廣泛用于基因表達譜及蛋白

16、質組學分析，可一次性分離1000多種蛋白質。第一向:根據蛋白質所帶的電荷而進行等電聚焦。第二向:利用樣品分子的相對分子質量不同，在另一方向上進行SDS-PAGE。42432D gel in proteomics44點匹配結果: 實驗組和對照組蛋白點匹配圖452.生物分子的分離與純化：1）蛋白質純化；2）DNA提取；3）RNA提取；4）糖類提取；5）脂類提取。46 1）蛋白質純化:目的: 確定蛋白質的結構、功能及結構與功能的關 系；研究酶的動力學及其調節；藥用成份的 分離與鑒定。方法: 勻漿、離心、電泳、過濾、層析、抽提、透 析等。要求: 合適的緩沖體系、低溫、蛋白酶抑制劑。濃度和質量檢測: 分

17、光光度法、PAGE 。47 2）DNA提取:原則 : 保持核酸一級結構的完整性。 去除雜質，保證核酸足夠純。步驟： 破膜 釋放出目的核酸。 分離 通過酶、有機溶劑、調節pH 值、離心等手段得到粗制品。 純化 進一步去除雜質。濃度和質量檢測: 分光光度法、 Agarose凝膠電泳。 48基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜M: DNA/HindIII 分子量標準，泳道14分別代表4個不同樣品的基因組DNA49 3） RNA提取:哺乳動物細胞總RNA主要由rRNA(80%-85%)、tRNA和核內小分子RNA (10%-15%)、mRNA(1%-5%)組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細胞質中

18、。注意事項: 使用RNA酶抑制劑； 防止污染。 50總RNA和mRNA的瓊脂糖凝膠（1）電泳圖譜51七. 生物分子的結構與功能分析： 1. 蛋白質結構分析 2. 酶活力檢測 3. 蛋白質組學分析 4. DNA序列分析 5. 聚合酶鏈反應（PCR）6. 分子雜交 7. 基因克隆 8. 基因組文庫構建 9. cDNA文庫構建 10. 文庫篩選 11. 報告基因檢測 12. 基因芯片 13. 基因敲除 14. RNAi15. 轉基因動物 52分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端的氨基酸殘基測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端的氨基酸殘基把肽鏈水解成

19、片段，分別進行分析把肽鏈水解成片段，分別進行分析測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法降解法一般需用數種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用數種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨順序，然后經過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結果。基酸順序的結果。1. 蛋白質結構分析:53通過核酸來推演蛋白質中的氨基酸序列通過核酸來推演蛋白質中的氨基酸序列按照三聯密碼的原則推演出氨基酸的序列按照三聯密碼的原則推演出氨基酸的序列分離編碼蛋白質的基因分離編碼蛋白質的基因測定測定DNA序列序列排列出排列出m

20、RNA序列序列54 2. 酶活力檢測: 酶是一類加快特定生化反應速度的球蛋白。在底物濃度、pH值及溫度等適宜的條件下，每種酶控制著一些結構相似的底物生成產物。 酶活性單位(SI單位)：在最適條件下，一秒內將1 mol底物全部轉化為產物所需的酶量。 55 3. 蛋白質組學分析: 一個細胞在特定生理或病理狀態下表達的所有種類的蛋白質稱為蛋白質組(proteome)。蛋白質是基因功能的實施者，對蛋白質結構、定位和蛋白質-蛋白質相互作用的研究將為闡明生命現象的本質提供直接的基礎。 方法: 二維電泳、質譜技術、蛋白質芯片等。 56 4. DNA序列分析: DNA序列分析(DNA sequencing)即

21、測定DNA鏈中四種核苷酸(堿基)的排列順序。 測序反應使用特異引物與單鏈DNA模板結合，由DNA聚合酶催化引物延伸，當遇到雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)時即發生堿基特異性鏈終止，引物延伸合成的新鏈DNA即是待測DNA模板的互補鏈。 57 5. 聚合酶鏈反應（PCR）: Polymerase chain reaction（ PCR）技術是利用DNA 聚合酶在體外條件下，催化一對引物之間特異DNA片段合成的基因擴增技術。 PCR包括三個基本過程： 變性； 退火； 延伸。 這三個過程組成一個循環周期,每個周期合成的產物又可作為下一個周期的模板，如此循環往復，目的DNA片段的拷貝數呈指數形式擴增。 5

22、8在在DNA變性后的復性過程中，如果將不變性后的復性過程中，如果將不同種類的同種類的DNA單鏈分子或單鏈分子或RNA分子放在同一分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關系，在適宜的條件（溫度程度的堿基配對關系，在適宜的條件（溫度及離子強度）下，就可以在不同的分子間形及離子強度）下，就可以在不同的分子間形成成雜化雙鏈雜化雙鏈(heteroduplex)。6. 分子雜交分子雜交(hybridization) 59DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子變性變性 復性復性 不同來源的不同來源的DNA分子分子60 Southern印跡雜交

23、: 利用瓊脂糖凝膠電泳將經限制性核酸內切酶消化的DNA片段分離，并使這些DNA片段在凝膠原位經堿變性處理后, 從凝膠轉移至一固相支持物上，再與標記的核酸探針雜交，經檢測確定膜上與探針互補的電泳區帶位置。61 Northern印跡雜交 : 用于檢測組織、細胞中某基因的表達狀態和表達水平。 基本原理和方法與Southern印跡雜交相似: RNA在瓊脂糖凝膠中電泳分離后，被轉移至尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，然后與標記的DNA或RNA探針雜交。62 Western免疫印跡: 基本過程與Southern 印跡雜交和Northern印跡雜交十分相似，都是由凝膠電泳、轉膜、雜交和信號顯示等步驟組成。不同之處是

24、Western免疫印跡檢測的是蛋白質，使用的凝膠是SDS聚丙烯酰胺凝膠, 所用的探針是蛋白質抗體。 63 7. 基因克隆: 用酶學方法將不同來源的DNA分子在體外進行剪切和重新連接，組裝成一個新的DNA分子。在此基礎上，將這個DNA分子導入到一定的宿主細胞，使它能夠在宿主細胞中擴增，形成大量的子代分子，此過程即稱為基因克隆(gene cloning)。 64基因克隆包括四個基本技術環節： 目的基因和載體的獲得； 目的基因與載體連接，形成重組分子； 重組DNA分子導入宿主細胞； 含有重組DNA分子的細胞的篩選和擴增。65 8. 基因組文庫構建: 基因組文庫(genomic DNA library

25、)是含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群體。 提純染色體DNA，通過機械剪切或酶切使之成為一定大小的片段，并與適當的載體DNA連接和轉染宿主菌，得到一組含有不同DNA片段的重組分子。 66 9. cDNA文庫構建: cDNA是指以mRNA為模板，由逆轉錄酶催化形成的互補DNA（cDNA），其核苷酸序列完全互補于模板mRNA鏈；再以cDNA為模板，由DNA聚合酶合成第二鏈，得到互補雙鏈DNA。 67 將雙鏈cDNA產物與載體（質粒或噬菌體）DNA重組，并轉化到宿主細菌或包裝成噬菌體顆粒，得到重組克隆混合體。每個克隆含單獨一種cDNA (mRNA)分子，克隆總和則包含細胞的全部mRNA信

26、息。 cDNAcDNA文庫文庫(cDNA library):(cDNA library):68 10. 文庫篩選: 文庫篩選方法： 核酸分子雜交、免疫學方法等。 通過文庫篩選，可以獲得全長基因、分離出對應稀有mRNA的cDNA片段及鑒定目的重組子等。 69 11. 報告基因檢測: 報告基因(reporter gene)是指那些表達產物容易被檢測的基因。利用基因重組技術，將待檢測的DNA片段插入報告基因表達載體中報告基因的上游，然后轉染合適的細胞并表達，通過測定報告基因的表達產物，即可推測出該DNA片段在基因表達調控中的作用。 70 12. 基因芯片: 基因芯片(gene chip)是九十年代中

27、期發展起來的一項前沿生物技術，它融合了生命科學、化學、微電子技術、計算機科學、統計學和生物信息學等多學科的最新技術。71DNA芯片（芯片（基因芯片） 將大量的已知的DNA片段作為探針，有序地、高密度地排列在玻離、硅等載體上。 將待測樣品用熒光標記物標記，并與DNA芯片進行分子雜交后進行信號檢測。通過對芯片掃描獲得熒光標記雜交信號圖譜。72 芯片設計 73目目 錄錄7475 13. 基因敲除: 基因敲除（gene knock out），類似早期生理學研究的三部曲: 切除部分觀察整體推測功能。 gene knock out是指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實驗，將該基因去除，或用

28、其它序列相近基因取代，然后從整體及分子水平觀察實驗動物，推測相應基因的功能。 76基因敲除的技術路線： （1）構建重組基因載體。（2）用電穿孔、顯微注射等方法將重組DNA轉入受體細胞核內。（3）用選擇培養基篩選已擊中的細胞。（4）將擊中細胞轉入胚胎使其生長成為轉基因動物，對轉基因動物進行形態觀察及分子生物學檢測。77 siRNA (small interfering RNAs： 2123核苷酸長的核苷酸長的 dsRNA小片段小片段 ) 14. RNA interference雙鏈雙鏈RNA對基因表達的阻抑作用被稱為對基因表達的阻抑作用被稱為RNA干預干預（RNA interference, RNAi），是發生在轉錄后水平），是發生在轉錄后水平的基因沉默。的基因沉默。 78安德魯法爾(Andrew Fire， 1959年)， 美國斯坦福醫學院病理學和遺傳學教授克雷格梅洛(Craig C. Mello, 1960年)，美國馬薩諸塞州大學醫學院分子醫學教授。79RNA干擾過程圖干擾過程圖 80 特異性降解同源mRNA，具有傳遞性（細胞間傳遞及生物個體代間傳遞）。 RNAi的特征 81 RNAi研究被Science雜志評為2001年的十大科學成就之一； RNAi研究被列為2002年Science雜志評的十大科學成就之首； RNAi研究被