1、發酵工程發酵工程2/jing/C76/zcr-1.htm南陽師范學院南陽師范學院 生命科學與技術學院生命科學與技術學院發酵工程發酵工程第一章第一章 發酵工程總論發酵工程總論第二章第二章 發酵設備發酵設備第三章第三章 發酵工業原料及其處理發酵工業原料及其處理第四章第四章 發酵工業滅菌發酵工業滅菌第五章第五章 發酵菌種的制備發酵菌種的制備第六章第六章 發酵工業放大發酵工業放大第第七七章章 微生物發酵機制微生物發酵機制第八章第八章 發酵動力學發酵動力學第第九九章章 發酵過程工藝控制發酵過程工藝控制第第十十章章 發酵染菌及防治發酵染菌及防治第第十一十一章章 發酵工業

2、廢物、廢水處理和資源化技術發酵工業廢物、廢水處理和資源化技術第十二章第十二章 展望展望1 1 發酵工業微生物菌種的選育發酵工業微生物菌種的選育2 2 工業微生物種子的擴大培養工業微生物種子的擴大培養3 3 種子培養基及其制備種子培養基及其制備第五章第五章 發酵菌種的制備發酵菌種的制備2/jing/C76/zcr-1.htm1.1 工業微生物的特點工業微生物的特點1.2 發酵工業對菌種的要求發酵工業對菌種的要求1.3 工業生產常用的微生物菌種工業生產常用的微生物菌種1.4 工業微生物菌種的分離工業微生物菌種的分離1.5 發酵高產菌種的選育發酵高產菌種的選育1.

3、6 菌種的退化與保藏菌種的退化與保藏1 發酵工業微生物菌種的選育發酵工業微生物菌種的選育第五章第五章 發酵菌種的制備發酵菌種的制備1.1 1.1 工業微生物的特點工業微生物的特點1 發酵工業微生物菌種的選育發酵工業微生物菌種的選育 一個現代化的發酵工業必須具有一個現代化的發酵工業必須具有優良的菌種優良的菌種、合適的工藝和先進的設備合適的工藝和先進的設備、嚴格的檢測與控制嚴格的檢測與控制，其，其中中菌種菌種是主體是主體,其他則是為了充分發揮菌種的優良其他則是為了充分發揮菌種的優良性能而考慮和設計的。性能而考慮和設計的。 能用于發酵生產的微生物即為能用于發酵生產的微生物即為工業微生物，它工業微生物

4、，它們具有個體小、種類多、繁殖快、分布廣、代謝能們具有個體小、種類多、繁殖快、分布廣、代謝能力強、易變異改造力強、易變異改造等特點。等特點。1.2 1.2 發酵工業對菌種的要求發酵工業對菌種的要求1) 能在能在廉價原料制成的培養基上廉價原料制成的培養基上迅速生長，并生成所需要的代謝產物，且迅速生長，并生成所需要的代謝產物，且產量高；產量高；2）培養條件）培養條件易于控制易于控制；3）生長速度快，）生長速度快，發酵周期短發酵周期短；4）滿足代謝控制的要求；）滿足代謝控制的要求；5）抗噬菌體和雜菌的能力強；）抗噬菌體和雜菌的能力強；6）遺傳性狀穩定，菌種不易變異退化；）遺傳性狀穩定，菌種不易變異退

5、化；7）在發酵過程中產生的氣泡要少，這對提高裝料系數、提高單罐產量、）在發酵過程中產生的氣泡要少，這對提高裝料系數、提高單罐產量、降低成本有重要意義；降低成本有重要意義；8）對需要添加的前體物質有耐受能力，并且不能將這些前體作為一般碳）對需要添加的前體物質有耐受能力，并且不能將這些前體作為一般碳源利用；源利用；9）不是病原菌，同時在系統發育上與病原菌無關，不產生任何有害的生）不是病原菌，同時在系統發育上與病原菌無關，不產生任何有害的生物活性物質和毒素，以保證安全。物活性物質和毒素，以保證安全。 地球上的微生物資源非常豐富，地球上的微生物資源非常豐富，目前已發現的僅占其總數的目前已發現的僅占其總

6、數的1%5%，而在工業生產中被利用的僅有而在工業生產中被利用的僅有數百種數百種，分屬于分屬于細菌、酵母菌、霉菌、放線菌、細菌、酵母菌、霉菌、放線菌、擔子菌、藻類擔子菌、藻類。1.3 1.3 工業生產常用的微生物菌種工業生產常用的微生物菌種放線菌（鏈霉素四環素；紅霉素等） 真菌（青霉素、頭孢等）一些產芽孢的細菌植物或動物來源一、抗生素生產有關的微生物一、抗生素生產有關的微生物抗生素是次級代謝產物，需要生物體進行復雜的代謝，抗生素是次級代謝產物，需要生物體進行復雜的代謝，目前發現的生物來源如下：目前發現的生物來源如下：已工業化產品生產菌的介紹已工業化產品生產菌的介紹1.3 1.3 工業生產常用的微

7、生物菌種工業生產常用的微生物菌種二、氨基酸生產有關的微生物二、氨基酸生產有關的微生物代謝控制發酵代謝控制發酵：用用人工誘變的方法人工誘變的方法，有意識地改變微生，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產物，這種發酵形象地物的代謝途徑，最大限度地積累產物，這種發酵形象地稱為代謝控制發酵，最早在氨基酸發酵中得到成功應用。稱為代謝控制發酵，最早在氨基酸發酵中得到成功應用。2020世紀世紀50-6050-60年代以氨基酸發酵為代表的年代以氨基酸發酵為代表的代謝控制發代謝控制發酵酵，是發酵工業發展歷史上的一個轉折點：，是發酵工業發展歷史上的一個轉折點：1.3 1.3 工業生產常用的微生物菌種工業生

8、產常用的微生物菌種已工業化產品生產菌的介紹已工業化產品生產菌的介紹 HD:高絲氨酸脫氫酶高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸和異亮氨酸的合成調節機制的合成調節機制 HT:高絲氨酸轉乙酰酶高絲氨酸轉乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶1.3 1.3 工業生產常用的微生物菌種工業生產常用的微生物菌種二、氨基酸生產有關的微生物二、氨基酸生產有關的微生物氨基酸生產菌的要求氨基酸生產菌的要求：代謝途徑比較清楚，簡單代謝途徑比較清楚，簡單谷氨酸發酵的菌種谷氨酸發酵的菌種：其他氨基酸生產菌：其他氨基酸生產菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節桿菌屬或小棒桿菌屬，短

9、桿菌屬、節桿菌屬或小桿菌屬的棒型細菌桿菌屬的棒型細菌常規菌種一般也是以谷氨酸生產菌常規菌種一般也是以谷氨酸生產菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌草芽孢桿菌1.3 1.3 工業生產常用的微生物菌種工業生產常用的微生物菌種二、氨基酸生產有關的微生物二、氨基酸生產有關的微生物三、食品酶制劑生產有關的微生物三、食品酶制劑生產有關的微生物 開發一個新酶，都要經過一系列研究的毒理試驗。開發一個新酶，都要經過一系列研究的毒理試驗。關于食品用酶，美國需要得到關于食品用酶，美國需要得到FDAFDA的批準。目前已同意的批準。目前已同意使用的僅僅少數微生物能用于生產食品用酶。使

10、用的僅僅少數微生物能用于生產食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌菌和地衣牙孢桿菌1.3 1.3 工業生產常用的微生物菌種工業生產常用的微生物菌種l已工業化產品生產菌的介紹已工業化產品生產菌的介紹三、常用的基因表達系統( (一一) )原核生物原核生物：大腸桿菌大腸桿菌(1977(1977年年Boyer)Boyer)、枯草牙胞桿菌、枯草牙胞桿菌 沙門氏菌沙門氏菌q 生長迅速、蛋白產量高生長迅速、蛋白產量高; ;q 表達蛋白的純化、分離及分析快速；表達蛋白的純化、分離及分析快速；q 外源基因的導入相對容易；外源基因的導入相對容

11、易；q 已建立了整套表達理論及技術。已建立了整套表達理論及技術。l已工業化產品生產菌的介紹已工業化產品生產菌的介紹1.3 1.3 工業生產常用的微生物菌種工業生產常用的微生物菌種( (二二) ) 真核細胞表達系統真核細胞表達系統 酵母酵母( (既是微生物又是真核細胞既是微生物又是真核細胞) )l 生長迅速，營養要求不高，易培養；生長迅速，營養要求不高，易培養；l 安全性好；安全性好；l 比哺乳動物細胞操作簡單；比哺乳動物細胞操作簡單；l 具有一定的修飾蛋白的能力。具有一定的修飾蛋白的能力。1.3 1.3 工業生產常用的微生物菌種工業生產常用的微生物菌種l已工業化產品生產菌的介紹已工業化產品生產

12、菌的介紹 中國倉鼠卵巢細胞（中國倉鼠卵巢細胞（CHOCHO細胞）表達系統細胞）表達系統q 具有準確的轉錄后修飾功能；具有準確的轉錄后修飾功能；q 具有產物胞外分泌功能，便于下游產物分離純化；具有產物胞外分泌功能，便于下游產物分離純化；q 具有重組基因的高效擴增和表達能力；具有重組基因的高效擴增和表達能力；q 具有貼壁生長特性，也可進行懸浮生長；具有貼壁生長特性，也可進行懸浮生長；q CHO很少分泌自身的內源蛋白。很少分泌自身的內源蛋白。1.3 1.3 工業生產常用的微生物菌種工業生產常用的微生物菌種l已工業化產品生產菌的介紹已工業化產品生產菌的介紹微生物（包括動、植物細胞）幾乎可以生產微生物（

13、包括動、植物細胞）幾乎可以生產我們所需的一切產品，但是涉及到工業化生我們所需的一切產品，但是涉及到工業化生產對于某一種特定的產品，只有特定的微生產對于某一種特定的產品，只有特定的微生物才具有大量表達的潛力。物才具有大量表達的潛力。問題：生產抗生素的微生物能不能用于生產氨基酸？生產抗生素的微生物能不能用于生產氨基酸？禮來禮來(Eli lilly(Eli lilly),),花了花了1010年的時間從年的時間從4040萬株微萬株微生物中，發現了三種有潛力的新抗生素生物中，發現了三種有潛力的新抗生素。例：1.3 1.3 工業生產常用的微生物菌種工業生產常用的微生物菌種l已工業化產品生產菌的介紹已工業化

14、產品生產菌的介紹一、菌種分離的一般過程一、菌種分離的一般過程樣品采集樣品采集預處理預處理 增殖增殖培養培養 純培養純培養 菌種的鑒定菌種的鑒定問題：問題：如何使樣品中所含微生物的可能性大如何使樣品中所含微生物的可能性大 如何在后續的操作中使這種可能性實現如何在后續的操作中使這種可能性實現目的目的：高效地獲取一株高產目的產物的微生物高效地獲取一株高產目的產物的微生物1.4 1.4 工業微生物菌種的分離工業微生物菌種的分離 生產性能測定生產性能測定復合酶系復合酶系復合菌系復合菌系二、采樣時要注意的問題二、采樣時要注意的問題l 氣候、水分、空氣氣候、水分、空氣l 來源要廣來源要廣l 結合產品的特點結

15、合產品的特點l 標簽：地點、時間、氣候等標簽：地點、時間、氣候等1.4 1.4 工業微生物菌種的分離工業微生物菌種的分離富集的三種方案：l 定向培養定向培養: :采用特定的有利于目的微生物富集的采用特定的有利于目的微生物富集的 條件，進行培養。條件，進行培養。三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的： 讓目的微生物在種群中占優勢，使篩選變讓目的微生物在種群中占優勢，使篩選變得可能。得可能。l 當不可能采用定向培養時，則可設計在一個分當不可能采用定向培養時，則可設計在一個分 類學中考慮，類學中考慮，l 不能提供任何有助于篩選產生菌的信息，這不能提供任何有助于篩選

16、產生菌的信息，這 時只能通過隨機分離的辦法時只能通過隨機分離的辦法1.4 1.4 工業微生物菌種的分離工業微生物菌種的分離定向培養的方法定向培養的方法物理方法：加熱、膜過濾等，物理方法：加熱、膜過濾等，但主要是通過培養的方法但主要是通過培養的方法1.4 1.4 工業微生物菌種的分離工業微生物菌種的分離三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富集的一些基本方法2/jing/C76/zcr-1.htm定向培養的富集方法定向培養的富集方法1 1、底物、底物2 2、pHpH條件條件3 3、培養時間、培養時間4 4、培養溫度、培養溫度等一切能提高目的微生物相對生

17、長速度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養（固體、液體；分批、連的手段，培養（固體、液體；分批、連續）后使目的微生物在種群中占優勢。續）后使目的微生物在種群中占優勢。三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富集的一些基本方法四、菌落的選出四、菌落的選出q 從產物角度出發從產物角度出發在培養時以產物的形成有目的的設計培養基在培養時以產物的形成有目的的設計培養基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素q 從形態的角度從形態的角度 菌落的外觀形態，是微生物的一個重要表征。如多糖菌落的外觀形態，是微生物的一個重要表征。如多糖產生菌在適當的培養基上生長，從具有

18、粘液性的菌落外觀產生菌在適當的培養基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。上就可以初步識別。1.4 1.4 工業微生物菌種的分離工業微生物菌種的分離實例：堿性纖維素酶產生菌的篩選實例：堿性纖維素酶產生菌的篩選采樣（造紙廠）采樣（造紙廠） 80 30 min處理處理文獻文獻:產生菌為中性牙孢桿菌，產生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌嗜堿芽孢桿菌、放線菌及霉菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍曲利本藍1%CMC（羧甲基纖維素），（羧甲基纖維素），pH10.5培養培養34 d，選擇有，選擇有凹陷圈凹陷圈的菌落的菌落從從285個土樣中獲得個土樣中獲得62株株26株為組成型株為組成型36株為誘

19、導型株為誘導型1.4 1.4 工業微生物菌種的分離工業微生物菌種的分離實例：醛肟水解酶的篩選實例：醛肟水解酶的篩選 -Journal of biotechnology 94(2002), 65-72培養基中含培養基中含0.05% of Z-PAOx 每隔每隔23 d移去一半培養物，補充新鮮培養基移去一半培養物，補充新鮮培養基不斷分析樣品，不斷分析樣品，2-3個月后個月后Z-PAOx降低后，稀釋分離菌落降低后，稀釋分離菌落1.4 1.4 工業微生物菌種的分離工業微生物菌種的分離五、目的微生物富集方法的研究進展五、目的微生物富集方法的研究進展q 分子生物學的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標產物分子

20、生物學的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標產物 的篩選方面發揮了著越來越重要的作用。如的篩選方面發揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同同 源性分析，基因序列分析及源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術等雜交技術等q 目前土壤中能夠培養的微生物不到總數的目前土壤中能夠培養的微生物不到總數的1%，微生物的微生物的 多樣性及資源的開發多樣性及資源的開發仍然是今后若干年的研究重點。仍然是今后若干年的研究重點。 陳文新（科學院院士）陳文新（科學院院士） ， 2002q In contrast to this traditional approach, modern molecular bio

21、logy techniques allow for DNA library expression screening, which also enables access to enzymes of nonculturable organisms. By this strategy, for instance, the company Diversa (San Diego, CA, USA) identised 120 unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from an alkaline soil s

22、ample.FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 73811.4 1.4 工業微生物菌種的分離工業微生物菌種的分離目的l 提高生產能力提高生產能力l 提高產品質量提高產品質量l 開發新產品開發新產品l 解決生產實際問題解決生產實際問題l 防止菌種退化防止菌種退化1.5 1.5 發酵高產菌種的選育發酵高產菌種的選育方法基因突變：自然選育、誘變育種自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質體融合、基因工程雜交、原生質體融合、基因工程基因的直接進化：點突變、易位點突變、易位PCR、同序法、同序法DNA Shuffling等等1.5 1.5 發酵高產菌種的選育發酵高產菌

23、種的選育自然狀態下，堿基對發生自然突變的機率為自然狀態下，堿基對發生自然突變的機率為10-810-9。自然突變有兩種情況自然突變有兩種情況：一種是我們生產上所不希望看到的，表現為菌株的衰一種是我們生產上所不希望看到的，表現為菌株的衰退和生產質量的下降，這種突變成為負突變退和生產質量的下降，這種突變成為負突變。另一種是我們生產上希望看到的，對生產有利，這種突另一種是我們生產上希望看到的，對生產有利，這種突變成為正突變。變成為正突變。一、自然選育一、自然選育1.5 1.5 發酵高產菌種的選育發酵高產菌種的選育自然選育在工業生產上的意義自然選育在工業生產上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證

24、穩產高產的自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩產高產的重要措施。重要措施。回復突變回復突變：高產菌株在傳代的過程中，由于自然突變導致：高產菌株在傳代的過程中，由于自然突變導致高產性狀的丟失，生產性能下降，這種情況我們稱為回復高產性狀的丟失，生產性能下降，這種情況我們稱為回復突變突變問題：問題：高產菌株是正突變高，還是負突變高？高產菌株是正突變高，還是負突變高？1.5 1.5 發酵高產菌種的選育發酵高產菌種的選育自然選育操作步驟：自然選育操作步驟： 一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細胞單細胞(孢子孢子)懸液的制備懸液的制備平板分離平板分離挑選

25、單菌落挑選單菌落發酵試驗發酵試驗1.5 1.5 發酵高產菌種的選育發酵高產菌種的選育注意形態的觀察注意形態的觀察選擇性培養法選擇性培養法隨機分離法隨機分離法平板劃線法平板劃線法平板稀釋法平板稀釋法二、誘變育種二、誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發基因突變進行的篩選，用各種物理、化學的因素人工誘發基因突變進行的篩選，稱為稱為誘變育種。誘變育種。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑誘變劑（P103）誘變劑誘變劑物理：紫外，快中子，射線，激光物理：紫外，快中子，射線，激光化學：硫酸二乙酯（化學：硫酸二乙酯（DES），亞硝基胍（），亞硝基胍（NTG

26、）生物：噬菌體，轉座子生物：噬菌體，轉座子1.5 1.5 發酵高產菌種的選育發酵高產菌種的選育（二）、誘變劑處理過程中幾個有關的問題（二）、誘變劑處理過程中幾個有關的問題 化學誘變劑使用過程的安全性化學誘變劑使用過程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑量的選擇誘變劑的選擇誘變劑的選擇出發菌株的選擇出發菌株的選擇（一）、誘變育種的原理（一）、誘變育種的原理 誘變育種的理論基礎是基因突變，突變主要包括染誘變育種的理論基礎是基因突變，突變主要包括染色體畸變和基因突變兩大類。色體畸變和基因突變兩大類。壓硝酸：壓硝酸：0.07MNa0.07MNa2 2HPOHPO4 4亞硝基胍亞硝基胍：1MNaOH1MNaOH

27、二、誘變育種二、誘變育種（三）、誘變育種的一般步驟（三）、誘變育種的一般步驟 （P103）二、誘變育種二、誘變育種誘變育種一般包括誘變育種一般包括誘變和篩選誘變和篩選兩個部分。兩個部分。誘變誘變部分成功的關鍵包括出發菌株的選擇、誘部分成功的關鍵包括出發菌株的選擇、誘變劑種類和劑量的選擇，以及合理的使用方法。變劑種類和劑量的選擇，以及合理的使用方法。篩選篩選部分包括初篩和復篩來測定菌種的生產能部分包括初篩和復篩來測定菌種的生產能力。力。誘變育種是誘變和篩選過程的不斷重復，直到誘變育種是誘變和篩選過程的不斷重復，直到達到達到高產菌株高產菌株。（三）、誘變育種的一般步驟（三）、誘變育種的一般步驟二、

28、誘變育種二、誘變育種出發菌株的選擇出發菌株的選擇制備菌懸液制備菌懸液誘變處理誘變處理突變菌株的篩選突變菌株的篩選營養缺陷型突變菌株的篩選營養缺陷型突變菌株的篩選抗反饋阻礙和抗反饋抑制突變菌株抗反饋阻礙和抗反饋抑制突變菌株的篩選的篩選組成型突變株的篩選組成型突變株的篩選抗性突變株的篩選抗性突變株的篩選自然界直接分離到的野生型菌株自然界直接分離到的野生型菌株經歷過生產條件考驗的菌株經歷過生產條件考驗的菌株已經歷多次育種處理的菌株已經歷多次育種處理的菌株隨隨機機篩篩選選形形態態理理化化性性質質 HD:高絲氨酸脫氫酶高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節機制的合成調節機制 HT:

29、高絲氨酸轉乙酰酶高絲氨酸轉乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶結構類似物抗性結構類似物抗性：Lys的類似物的類似物AEC, Thr的類似物的類似物AHV營養缺陷型營養缺陷型：如如Thr缺陷型缺陷型黃色短桿菌黃色短桿菌F9-50的誘變譜系的誘變譜系 Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g/lF6-16 (leu -, Thr -) 20.8 g/lF9-50 (leu -, Thr -, AEC r) 33.5 g/l三、基因的直接進化三、基因的直接進化(directed evolution)q 突變 基因突變庫的建立基因突變庫的建

30、立q 篩選 基因突變庫的篩選基因突變庫的篩選q 基因復制與遺傳步驟：步驟： 在分子水平上，對目標基因直接處理，然后通過在分子水平上，對目標基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標蛋白的性能。高通量的篩選方法，提高目標蛋白的性能。1.5 1.5 發酵高產菌種的選育發酵高產菌種的選育主要應用：主要應用：酶活性能的提高酶活性能的提高: 生理環境生理環境工業催化環境工業催化環境l pHl 溫度溫度l 有機溶劑有機溶劑l 底物專一性底物專一性脂酶拆分脂酶拆分2-2-甲基癸酸硝基苯酯甲基癸酸硝基苯酯例：例：PLAPLAPLA光學拆分選擇性光學拆分選擇性(%)(%)2 31 57 75 81 905

31、 5次錯位次錯位PCR 2PCR 2次定點突變次定點突變ReetzReetz (1997) Liebeton(2000) (1997) Liebeton(2000) 定點突變定點突變錯位錯位PCRDNA改組改組(DNA Shuffling): 指指DNA分子的體外重排，是基分子的體外重排，是基因在分子水平上進行有性重組因在分子水平上進行有性重組(Sexual Recombination)。DNA改組技術改組技術(1994)的發明人的發明人Stemmer博士，他以博士，他以5項美國專利為項美國專利為技術支撐點，于技術支撐點，于1997年創立了專門從事年創立了專門從事DNA改組研究的公司改組研究的

32、公司Maxygen。公司剛剛建立，世界上幾家最大的公司紛紛與之洽談。公司剛剛建立，世界上幾家最大的公司紛紛與之洽談并建立了合作關系。這些公司包括最大的農業公司并建立了合作關系。這些公司包括最大的農業公司 duPont公司、公司、生產抗生素的世界巨頭生產抗生素的世界巨頭 DSM公司和工業酶研究生產之最的公司和工業酶研究生產之最的Novo nordisk公司。此外，迄今為止，公司。此外，迄今為止，Maxygen公司還得到了來自美國公司還得到了來自美國國防高級研究計劃局國防高級研究計劃局(DARPA)和國家科學技術協會和國家科學技術協會(NIST)的的5項項資助，共計資助，共計2100萬美元。從另一

33、角度反映了萬美元。從另一角度反映了DNA改組的重要性及改組的重要性及美國政府及商家對美國政府及商家對DNA改組技術的重視程度。改組技術的重視程度。 圖圖1有性有性PCR法改組法改組DNA的基本程序的基本程序DNA shuffling 圖圖2交錯延伸法改組交錯延伸法改組DNA的基本程序的基本程序 DNA shufflingX XXX X XX X XX X XXX X XX XX XXX XX X X XX X XXX XX XXX XX X X XX X XXX X XX X XX XXX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select bestwi

34、th DNAseI fragments recombinantsRepeat for multiple cyclesDNA shuffling項目進化速度進化對象進化周期影響對象突變效率常規定向進化緩慢進化整個基因組多年完整基因組低DNAShuffling快速進化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組高DNA ShufflingDNA Shuffling與常規定向進化的比較與常規定向進化的比較類 型示 例特 性活性增加倍數 潛在應用領域抗 體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉氨酶催化特異性10，000生物制藥 -內酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65耐熱時間1720

35、0工業酶細胞因子人類干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因子P5337半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒40生物制藥汞代謝途徑汞解毒12生物制藥部分DNA Shuffling技術的研究成果DNA改組改組(DNA Shuffling)技術的應用領域技術的應用領域分類分類用途用途進化進化DNA轉基因；疫苗載體；轉基因；疫苗載體；DNA疫苗；表達載疫苗；表達載體；基因轉移載體體；基因轉移載體進化蛋白進化蛋白基因治療用酶；細胞因子；生長因子；基因治療用酶；細胞因子；生長因子；抗體；工業酶抗體；工業酶進化生物體進化生物體 植物；科研用生物體；化學及藥物加工；植物；科研用生物體；化學

36、及藥物加工；疫苗有機體；石油加工；除污生物疫苗有機體；石油加工；除污生物1）菌種的退化及原因）菌種的退化及原因菌種退化：菌種退化：指在較長時期傳代保指在較長時期傳代保藏后，菌株的一個或多個藏后，菌株的一個或多個生理性狀和形態特征逐漸減退或消失的現象。生理性狀和形態特征逐漸減退或消失的現象。 常見的菌種衷退在形態上表現為常見的菌種衷退在形態上表現為分生孢子的減少或菌分生孢子的減少或菌落顏色的改變落顏色的改變，與由于環境條件變化而引起菌落形態和生，與由于環境條件變化而引起菌落形態和生理上的變異是不同的理上的變異是不同的 。1.6 1.6 菌種的退化與保藏菌種的退化與保藏菌種菌種退化的原因：退化的原

37、因：基因突變、變異菌株性狀分離、其他因基因突變、變異菌株性狀分離、其他因素（溫度、濕度、培養基成分及各種培養條件）素（溫度、濕度、培養基成分及各種培養條件）1.6 1.6 菌種的退化與保藏菌種的退化與保藏狹義的菌種復壯狹義的菌種復壯指在菌種已發生衰退的情況下，指在菌種已發生衰退的情況下，通過純種分離和測定生產性能等方法，從衰退的通過純種分離和測定生產性能等方法，從衰退的群體中找出少數尚未衰退的個體，從而達到恢復群體中找出少數尚未衰退的個體，從而達到恢復該菌原有典型性狀的目的。該菌原有典型性狀的目的。廣義的菌種復壯廣義的菌種復壯指在菌種的生產性能尚未衰退指在菌種的生產性能尚未衰退前，就經常有意識

38、地進行純種分離和生產性能測前，就經常有意識地進行純種分離和生產性能測定工作，從而逐步提高菌種的生產特性。定工作，從而逐步提高菌種的生產特性。2）菌種的復壯）菌種的復壯一、退化菌種的復壯一、退化菌種的復壯1.6 1.6 菌種的退化與保藏菌種的退化與保藏 常用的方法是對已退化菌株用一定培養條件進常用的方法是對已退化菌株用一定培養條件進行單細胞行單細胞分離純化分離純化，從而限制退化菌株在數量上占，從而限制退化菌株在數量上占優勢，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得以復壯。優勢，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得以復壯。 純種分離的方法常用的有三種：稀釋分離法、純種分離的方法常用的有三種：稀釋分離法、平板劃線法

39、和組織分離法（用于高等真菌）。平板劃線法和組織分離法（用于高等真菌）。2）菌種的復壯）菌種的復壯1.6 1.6 菌種的退化與保藏菌種的退化與保藏二、通過寄生進行復壯二、通過寄生進行復壯 寄生型微生物的退化可接種到相應寄生體內寄生型微生物的退化可接種到相應寄生體內以提高菌株的活力。以提高菌株的活力。三、聯合復壯三、聯合復壯 對退化菌株還可用劑量的紫外線輻射和低劑對退化菌株還可用劑量的紫外線輻射和低劑量的亞硝基胍（量的亞硝基胍（NTC）聯合處理進行復壯。）聯合處理進行復壯。2）菌種的復壯）菌種的復壯3）防止菌種退化的措施）防止菌種退化的措施合理的育種合理的育種選用合適的培養基選用合適的培養基創造良

40、好的培養條件創造良好的培養條件控制傳代次數控制傳代次數利用不同類型的細胞進行移種傳代利用不同類型的細胞進行移種傳代選擇有效的保選擇有效的保藏方法藏方法1.6 1.6 菌種的退化與保藏菌種的退化與保藏4）菌種）菌種保藏保藏 菌種菌種保藏的意義保藏的意義：是進行微生物學研究和微生物育種工作是進行微生物學研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務首先是菌種不死亡，同時還要盡可的重要組成部分。其任務首先是菌種不死亡，同時還要盡可能設法把菌種的優良特性保持下來而不致向壞的方面轉化。能設法把菌種的優良特性保持下來而不致向壞的方面轉化。1.6 1.6 菌種的退化與保藏菌種的退化與保藏 菌種保藏菌種保藏的原理

41、：的原理：根據菌種的生理生化特點，采用低溫、根據菌種的生理生化特點，采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養、添加保護劑或酸中中和劑等方法，干燥、缺氧、缺乏營養、添加保護劑或酸中中和劑等方法，使使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。使使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。4）菌種）菌種保藏保藏1.6 1.6 菌種的退化與保藏菌種的退化與保藏 蒸餾水懸浮法蒸餾水懸浮法 斜面低溫保斜面低溫保藏藏 石蠟油封保藏石蠟油封保藏 菌種菌種保藏的方法保藏的方法 砂土管保藏砂土管保藏 冷凍保藏冷凍保藏 真空凍干保藏真空凍干保藏 寄主保藏寄主保藏（病毒、立克次氏體、螺旋體等不能人工培養）（病毒、立

42、克次氏體、螺旋體等不能人工培養） 基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏普通冷凍冷凍保藏技術普通冷凍冷凍保藏技術超低溫冷凍保藏技術超低溫冷凍保藏技術液氮冷凍保藏技術液氮冷凍保藏技術小小 結結 涉及到工業化生產對于某一種特定的產品，只有涉及到工業化生產對于某一種特定的產品，只有 特定的微生物特定的微生物( (動、植物動、植物) )才具有大量表達的潛力；才具有大量表達的潛力； 傳統的誘變方法仍然是一種采用的方法，特別是傳統的誘變方法仍然是一種采用的方法，特別是 自然選育是工業發酵穩產高產的重要保證；自然選育是工業發酵穩產高產的重要保證； 目前土壤中已分離的微生物不到總數的目前土壤中已分離的微生物不到總數

43、的1%1%，微生，微生 物的多樣性仍然是以后若干年的研究重點物的多樣性仍然是以后若干年的研究重點； 基因重組、直接進化技術的應用，大大加快了生基因重組、直接進化技術的應用，大大加快了生 物產品開發的進程物產品開發的進程。1 發酵工業微生物菌種的選育發酵工業微生物菌種的選育3.1 菌體組成和細胞外代謝產物菌體組成和細胞外代謝產物3.2 種子培養的培養基選擇和配制原則種子培養的培養基選擇和配制原則3 種子培養基及其制備種子培養基及其制備第二章第二章 菌種的制備菌種的制備2/jing/C76/zcr-1.htm3.1 菌體組成和細胞外代謝產物菌體組成和細胞外代謝產

44、物3 種子培養基及其制備種子培養基及其制備1）菌體組成：）菌體組成： ?2）胞外代謝產物）胞外代謝產物 胞外產物多達胞外產物多達37大類，根據微生物代謝產物和生長繁殖的關大類，根據微生物代謝產物和生長繁殖的關系不同，分為兩大類：系不同，分為兩大類：一類是微生物自身生長繁殖所必需的代謝產物，稱為一類是微生物自身生長繁殖所必需的代謝產物，稱為初級代謝產初級代謝產物物，此類產物的生產菌種主要是，此類產物的生產菌種主要是細菌、酵母、霉菌細菌、酵母、霉菌等。等。另一類代謝產物與微生物生長繁殖無明確關系，稱為另一類代謝產物與微生物生長繁殖無明確關系，稱為次級代謝產次級代謝產物物，如抗生素、生物堿、色素等。

45、發酵工業用來生產次級代謝產，如抗生素、生物堿、色素等。發酵工業用來生產次級代謝產物的微生物僅有少數幾個類群，主要是物的微生物僅有少數幾個類群，主要是絲狀放線菌、絲狀真菌絲狀放線菌、絲狀真菌等。等。 3.1 菌體組成和細胞外代謝產物菌體組成和細胞外代謝產物3 種子培養基及其制備種子培養基及其制備3）微生物的營養類型（）微生物的營養類型（nutritional types)碳源利用碳源利用自養型自養型（autotrophs） 異養型異養型（heterotrophs） 能量來源能量來源光能營養型光能營養型（Phototrophs） 化能營養型化能營養型（chemotrophs） 光能無機自養型光能無

46、機自養型（Photo-Lithoautotrophy） 化能有機異養型化能有機異養型（Photoorganoheterotrophy） 化能無機自養型化能無機自養型（chemoLithoautotro-phy） 化能有機異養型化能有機異養型（chemoorganoheterotrophy） 3.2 種子培養的培養基選擇和配制原則種子培養的培養基選擇和配制原則3 種子培養基及其制備種子培養基及其制備1）培養基的營養成分及來源）培養基的營養成分及來源 培養基培養基（medium)是人們提供微生物生長繁殖和生物合成各是人們提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產物所需要的按一定比例配制的多種營養物質的

47、混合物。種代謝產物所需要的按一定比例配制的多種營養物質的混合物。包括：包括：碳源碳源(source of carbon) 氮源氮源(source of nitrogen)無機鹽無機鹽(inorganic salt)生長因子生長因子(growth factor) 水水(water)3.2 種子培養的培養基選擇和配制原則種子培養的培養基選擇和配制原則3 種子培養基及其制備種子培養基及其制備2）培養基的類型和用途）培養基的類型和用途來源：來源：天然天然培養基（培養基（complex medium；undefined medium） 合成合成培養基（培養基（synthetic medium； defi

48、ned medium） 半合成培養基半合成培養基（semidefined medium） 外觀：外觀：固體固體培養基（培養基（solid medium） 液體液體培養基（培養基（liquid medium） 半固體培養基半固體培養基（semisolid medium） 功能：功能：孢子孢子培養基（培養基（sporemedium）和種子培養基。和種子培養基。3.2 種子培養的培養基選擇和配制原則種子培養的培養基選擇和配制原則3 種子培養基及其制備種子培養基及其制備3）培養基的配制原則）培養基的配制原則 選擇適宜的營養物質、營養物質濃度及配比合適、選選擇適宜的營養物質、營養物質濃度及配比合適、選擇

49、合適的擇合適的pH、氧化還原電勢、營養成分的加入順序、氧化還原電勢、營養成分的加入順序（先加先加緩沖化合物，溶解后加入主要物質，然后加入維生素、氨基酸等生長緩沖化合物，溶解后加入主要物質，然后加入維生素、氨基酸等生長素類的物質素類的物質）。2/jing/C76/zcr-1.htm3.2 種子培養的培養基選擇和配制原則種子培養的培養基選擇和配制原則3 種子培養基及其制備種子培養基及其制備4）培養基成分配比的選擇）培養基成分配比的選擇 種子和孢子培養的目的是獲得大量質量良好的菌體或孢子，種子和孢子培養的目的是獲得大量質量良好的菌體或孢子，因此產量提高是選擇培養基

50、的一個重要標準。因此產量提高是選擇培養基的一個重要標準。 C/N比比 來源豐富、價格便宜、取材方便來源豐富、價格便宜、取材方便 方法：單因子試驗、正交試驗、均勻試驗、影響面法方法：單因子試驗、正交試驗、均勻試驗、影響面法本章思考題本章思考題1 工業用微生物的要求有哪些？試舉例說明微生物在工工業用微生物的要求有哪些？試舉例說明微生物在工業中的應用。業中的應用。2 簡述自然分離微生物的一般操作步驟。簡述自然分離微生物的一般操作步驟。3 簡述種子擴大培養的一般步驟。簡述種子擴大培養的一般步驟。4 如何防止菌種衰退？菌種復壯的措施有哪些？如何防止菌種衰退？菌種復壯的措施有哪些？5 影響種子質量的因素有

51、哪些？如何控制種子質量？影響種子質量的因素有哪些？如何控制種子質量？ 2008中國大學評價研究報告中國大學評價研究報告還發布了還發布了“2008中國最受媒體關注大學排行榜中國最受媒體關注大學排行榜”，排行，排行榜以榜以2007年度高校網絡新聞搜索的數量統計得年度高校網絡新聞搜索的數量統計得出，出，位居前十強位居前十強的高校是北京大學、清華大學、的高校是北京大學、清華大學、中國人民大學、復旦大學、浙江大學、中山大學、中國人民大學、復旦大學、浙江大學、中山大學、北京師范大學、上海交通大學、武漢大學、同濟北京師范大學、上海交通大學、武漢大學、同濟大學。大學。 中國一流大學名單中國一流大學名單l 校名

52、校名 入選根據入選根據l 清華大學清華大學 研究研究1型、工學第型、工學第1名名l 北京大學北京大學 研究研究1型、理學第型、理學第1名名l 浙江大學浙江大學 研究研究1型、工學第型、工學第2名名l 南京大學南京大學 研究研究1型、理學第型、理學第2名名l 北京師范大學北京師范大學 研究研究1型、教育學第型、教育學第1名名上海交通大學上海交通大學 研究研究1型、工學第型、工學第3名名l 中國科術大學中國科術大學 研究研究1型、理學第型、理學第3名名 l 復旦大學復旦大學 研究研究1型、醫學第型、醫學第3名名 l 校名校名 入選根據入選根據l 天津大學天津大學 研究研究1型、工學第型、工學第5名名l 中山大學中山大學 研究研究1型型 l 南開大學南開大學 研究研究1型型 l 中國人民大學中國人民大學 法學第法學第1名、經濟學名、經濟學第第2名名 l 西安交通大學西安交通大學 管理學第管理學第1名名 l 中國農業大學中國農業大學 農學第農學第