1、實驗一 天然產物化學成分系統(tǒng)預試驗 天然產物中所含的化學成分種類很多，在深入研究之前應首先了解其中含有哪些類型的化學成分，如生物堿、皂苷、黃酮類等等。這就需要進行各類化學成分的系統(tǒng)定性預試驗。或根據研究的需要進行單項預試法來初步判斷。一、實驗目的與要求 掌握未知成分的天然產物是怎樣初步提取分離的，熟悉各主要成分的試管試驗、沉淀反應和紙層析、薄層層析的方法并根據試驗結果判斷含有什么類型的化學成分。二、基本原理利用各類成分的顏色反應和沉淀反應，對天然產物的提取液進行檢查可以初步判斷其中的化學成分。由于提取液大多數顏色較深，影響對顏色變化的觀察，可以使用薄層層析（TLC）或紙層析（PC）等方法對天然

2、產物的提取液進行初步分離，再進一步檢查。三、實驗內容：利用不同成分在各種溶劑中的溶解度的不同，一般可采用以下3種溶劑分別提取，試驗。1水浸液：取中草藥粗粉5 g加水60 ml，在5060的水浴上加熱1小時，過濾，濾液進行下列試驗。檢查項目試 劑 名 稱 糖*1、酚醛縮合反應*2、菲林試劑酚類 1% FeCl8試劑鞣質1、1% FeCl8試劑苷類或多糖*1、酚醛縮合反應*2、加6NHCl酸化，加熱煮沸數分鐘，冷后仔細觀察有無絮狀沉淀*3、菲林試劑，觀察水解前后Cu2O沉淀量有無增加。皂苷* 泡沫試驗生物堿*1、碘化鉍鉀試劑*2、硅鎢酸試劑 *在試管進行，在濾紙或硅膠CMC-Na薄層板上進行，下同

3、。糖鑒定（1）-萘酚一硫酸試劑 檢查還原糖。溶液I：10-萘酚乙醇溶液。溶液II：硫酸。取1ml樣品的稀乙醇溶液或水溶液，加入溶液I 2滴3滴，混勻，沿試管壁緩緩加入少量溶液II，二液面交界處產生紫紅色環(huán)為陽性反應。（2）斐林試劑檢查還原糖。 溶液I：693g結晶硫酸銅溶于100ml水中。溶液II：346g酒石酸鉀鈉、10g氫氧化鈉溶于100ml水中。取1ml樣品熱水提取液，加入4滴5滴用時配制的溶液I、II等量混合液，在沸水浴中加熱數分鐘，產生磚紅色沉淀為陽性反應。如檢查多糖和苷，取1ml樣品水提液，加入1m110% 鹽酸溶液，在沸水浴上加熱10min，過濾，（成鹽去除雜質）再用10氫氧化鈉

4、溶液調至中性，按上述方法檢查還原糖。或者直接用高效液相色譜看色譜圖。酚類鑒定試劑（1）三氯化鐵試劑 檢查酚類化合物、鞣質15三氯化鐵水溶液或乙醇溶液，加鹽酸酸化。取1ml樣品的乙醇溶液，加入試劑1滴2滴，顯綠、藍綠或暗紫色為陽性反應。作色譜顯色劑用，噴灑后，顯綠或蘭色斑點為陽性。2乙醇提取液 取中草藥粗粉5 g，加512倍量95%乙醇，在水浴上加熱回流提取1小時，過濾，濾液留2 ml作（1）項試驗，其余回收乙醇至無醇味，并濃縮成浸膏狀，浸膏分為二部分，一部分加少量2% HCL振搖溶過濾。分出酸液，作（2）項式驗，附于濾紙上的一部分再以少量乙醇溶解，溶液作（3）項試驗；另一部分浸膏以少量乙酸乙酯

5、溶解，溶液置分液漏斗中加適量5% NaOH振搖，使酚性物質及有機酸等轉入下層氫氧化鈉水溶液中，剩下的乙酸乙酯為中性部分，用蒸餾水洗去堿性即可備用，將乙酸乙酯液23 ml，在水浴上蒸干，以12 ml乙醇溶解作（4）項試驗。（1）項試驗檢 查 項 目酚 類鞣 質試 劑 名 稱1% FeCl31% FeCl3結 果（2）項試驗檢 查 項 目生 物 堿試 劑 名 稱*1、碘化鉍鉀試劑*2、硅鎢酸試劑 *3、苦味酸試劑結 果（3）項試驗檢 查 項 目黃 酮蒽 醌試 劑 名 稱1、1% AlCl3試劑* 2、鹽酸鎂粉反應1、10% KOH液2、0.5% Mg(Ac)2試劑結 果（4）項試驗檢 查 項 目香

6、豆素與萜類內酯試 劑 名 稱*1、氨基安替比林鐵氰化鉀呈色反應結 果3、石油醚提取液取中草藥粗粉1 g，加10 ml石油醚（沸程6090），放置23小時，過濾，濾液置表面皿上任其揮發(fā)，殘留物進行下列試驗：檢 查 項 目甾體或三萜類揮發(fā)油和油酯試 劑 名 稱*1、醋酐濃硫酸試驗石油醚提取液滴于濾紙片上，觀察有無油斑并在加熱后能否發(fā)揮結 果黃酮類鑒定試劑（1）鹽酸-鎂粉試劑 檢查黃酮（醇）、二氫黃酮（醇）類化合物。取1ml樣品的乙醇溶液，加入數毫克鎂粉，滴加數滴鹽酸，必要時水浴上微熱，顯紅-紫色為陽性反應。（3）三氯化鋁試劑 檢查具有鄰二酚羥基或3-羥基、4-酮基或5-羥基、4-酮基的黃酮類化合物

7、。1三氯化鋁乙醇溶液或5三氯化鋁乙醇溶液。噴灑前、后將薄層板置日光下和紫外光燈下觀察，呈黃色或黃綠色熒光為陽性反應也可在濾紙上或試管中進行。（3）醋酸鎂試劑 檢查黃酮類，二氫黃酮類化合物，及羥基蒽醌類衍生物。 1醋酸鎂甲醇溶液。在濾紙或薄層板上，點1滴樣品醇溶液，揮去醇后，點1滴試劑于樣品斑點邊緣，加熱干燥，于紫外燈下觀察，黃酮類顯黃色熒光，二氫黃酮類呈天藍色熒光。顯橙紅色為大黃素型蒽醌，顯紫色為茜草型蒽醌。生物堿鑒定試劑（1） 改良碘化鉍鉀試劑 為生物堿通用顯色劑。 溶液I：0.85g次硝酸鉍溶于10ml冰醋酸，加水40ml。溶液II：8g碘化鉀溶于20ml水中。溶液I和II等量混合，于棕色

8、瓶中可以保存較長時間。目前市場上有碘化鉍鉀試劑可供直接配制：7.3g碘化鉍鉀、冰醋酸10ml加水60ml。取1m1樣品的稀酸溶液加1滴2滴試劑，產生桔紅色渾濁或沉淀為陽性反應。如作薄層色譜顯色劑，取混合液1m1、醋酸2ml、水10ml混合即得。噴灑后呈桔紅色斑點為陽性反應 （2）苦味酸試劑 為生物堿通用沉淀試劑。 苦味酸1g溶于100ml水中。取1ml樣品中性溶液，加入試劑1滴2滴，產生黃色晶形沉淀。（3）硅鎢酸試劑 為生物堿通用沉淀試劑。 1g硅鎢酸溶于20ml水中，加10鹽酸使成pH2左右。取1ml樣品的稀酸溶液，加入1滴2滴試劑，產生白色至褐色沉淀為陽性反應。四、藥品試劑：中藥飲片每組每

9、種8克生物堿試劑（1）碘化鉍鉀(Dragendorff)試劑：出現桔紅色或黃色沉淀。（2）苦味酸(Hager)試劑，樣品液需調至中性后加試劑，出現黃色晶形沉淀。（3）硅鎢酸(Bertrand)試劑：出現淡黃色或灰白色沉淀，在薄層板上應時，加熱后出現黑色斑點。酚類、鞣質試劑1%三氯化鐵水或乙醇試劑氨基酸、蛋白質試劑茚三酮(Ninnydrin)試劑糖、多糖和苷試劑（1）-萘酚試劑、Molish試劑（2）菲林氏反應(Fehling試劑)：溶液：69.3克結晶硫酸銅溶于1000毫升水中。溶液：349克灑石酸鉀鈉及氫氧化鈉100克，溶于1000毫升水中。皂苷試劑濃硫酸試劑黃酮類試劑鹽酸鎂粉反應醋酸鎂反應

10、1%三氯化鋁乙醇液香豆素試劑1%三氯化鐵水溶液Gibb氏反應：4-氨基安替比林-鐵氰化鉀(Emerson)4、玻璃儀器：（每2人或3人一組，每組一套）(1) 試管10個，滴管2個，玻棒1支（2）100ml圓底燒瓶一個，250ml圓底燒瓶一個，25cm球型或蛇型冷凝管一個，有機溶劑蒸餾回收裝置1套，50ml燒杯3個，25ml具塞錐形瓶，（3）有孔白瓷板1個（4）濾紙，乳膠管、藥勺儀器： （1） 普通天平，（2）分析天平，（4）電水浴鍋5、 思考題實驗學時：9學時實驗二 蘆丁的提取、分離及鑒定一、目的要求 1以蘆丁為實例學習黃酮類成分的提取分離方法。 2掌握用黃酮苷水解制取黃酮苷元的方法。 3了解

11、黃酮類化合物的一般性質。二、基本原理槐米系豆科屬植物槐樹SopHora japonica. L.的花蕾，歷來作為止血藥，治療痔瘡、子宮出血、吐血、鼻出血，并有清肝瀉火，治療肝熱目赤，頭痛眩暈的功能。其主要化學成分為蕓香苷（蘆丁），含量高達1220，蕓香苷廣泛存在于植物中，現已發(fā)現含有蕓香苷的植物高達70種以上，尤以槐米和喬麥中含量最高。藥理實驗證明蕓香苷有調節(jié)毛細血管滲透作用，臨床上用作毛細血管性止血藥，常作為高血壓癥的輔助用藥。槐米中主要成分的物理性質1 蕓香苷（蘆丁， rutin）：，淡黃色針狀結晶，mpl74178，無水物為188190。溶解度：冷水中1：8000，熱水中l(wèi)：200，冷乙

12、醇中1：300，熱乙醇中1：30，冷吡啶中1：12，微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、氯仿、石油醚等溶劑。易溶于堿液，呈黃色，酸化后又析出，可溶于硫酸和鹽酸，呈棕黃色，加水稀釋又析出。UV：259，299sh，359。2槲皮素（quercetin）：，黃色結晶，mp313314，無水物為316。溶解度：冷乙醇中1：290，沸乙醇中1：23，可溶于甲醇、乙酸乙酯、吡啶、丙酮等溶劑，不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚。 UV：255，269sh，301sh，370。 蕓香苷（蘆丁， rutin） 1蕓香苷分子中具有酚羥基，顯弱酸性，在堿水中成鹽增大溶解能力，用堿水為溶劑煮沸提取，提取液加酸酸化后又成為

13、游離的蕓香苷而析出。并利用蕓香苷對冷水和熱水的溶解度相差懸殊的特性進行精制。 2黃酮苷可通過酸水解得到苷元和糖，并可通過薄層色譜法和紙色譜法進行檢識。 3利用黃酮類化合物對紫外光有特定吸收的特征進行結構測定；也可制備乙酰化物進行結構鑒定。三、實驗內容1自槐花米中提取蘆丁：(1)提取方法： 稱取槐花米粗粉20g（壓碎），加沸水300m1，加熱煮沸30min，四層紗布趁熱過濾，殘渣同法再操作一次，合并兩次濾液，放置冰箱中析晶，待全部析出后，減壓抽濾，用蒸餾水洗滌蕓香苷結晶，抽干，得粗制蕓香苷，置空氣中干燥后，稱重。(2)重結晶方法：取粗蘆丁2 g，加去離子水或蒸餾水400 ml，加熱煮沸，趁熱抽濾

14、，放置過夜析晶（或放冷析晶），抽濾，得精制蘆丁。記錄：粗蘆丁得率多少？精制蘆丁得率多少？熔點？2. 蘆丁的水解：取蘆丁1 g，加2% H2SO4 80 ml，小火加熱微沸回流30分鐘至1小時。開始加熱10分鐘為澄清溶液，逐漸析出黃色小針狀結晶，即槲皮素，抽濾取結晶（ 保留濾液20毫升，以檢查其中所含單糖），沉淀物為蕓香苷苷元（槲皮素），用蒸餾水洗至中性，抽干水分，晾干，稱量。得粗制槲皮素，再用乙醇重結晶得精制槲皮素。加50%乙醇（按1克90 ml量）加熱回流使槲皮素粗晶溶解，趁熱抽濾，放置析晶，抽濾得精制品，在減壓下110干燥可得槲皮素無水物。測熔點，進行薄層層析鑒定。 取蕓香苷水解后的濾液2

15、0m1，加飽和氫氧化鋇溶液中和至中性（攪拌下進行），濾去白色的硫酸鋇沉淀，濾液濃縮至2ml3ml或蒸于后，加2ml3 ml乙醇溶解，作為糖的供試液。3. 鑒定呈色反應 取蕓香苷及槲皮素精品約10mg，各用5 ml乙醇溶解，制成樣品溶液，按下列方法進行試驗，比較苷元和苷的反應情況。（1）Molish反應 取樣品溶液1ml，加10O% 一萘酚溶液1ml，振搖后斜置試管，沿管壁滴加0.5 ml硫酸，靜置，觀察并記錄液面交界處顏色變化。（2）鹽酸一鎂粉反應 蕓香苷與槲皮素溶液分別置于兩試管中，加入金屬鎂粉少許，鹽酸2滴3滴，觀察并記錄顏色變化。（3）醋酸鎂紙片反應 取兩張濾紙條，分別滴兩滴蕓香苷、槲皮

16、素的乙醇溶液，然后各加1醋酸鎂甲醇溶液兩滴，于紫外光燈下觀察熒光變化，記錄現象。（4）利三氯化鋁紙片反應 在兩張濾紙條上分別滴加蕓香苷、槲皮素醇溶液后，各加1三氯化鋁乙醇溶液兩滴，于紫外光燈下觀察熒光變化，記錄現象。（5）鋯一檸檬酸反應 取樣品溶液2 ml，加 2% 二氯氧鋯甲醇溶液3滴4滴，觀察顏色，然后加入2檸檬酸甲醇溶液3滴4滴，觀察并記錄顏色變化。色譜鑒定（1）蕓香苷和槲皮素的薄層色譜樣 品 自制蘆丁、槲皮素對照品 蘆丁、槲此素展開劑 （1）正丁醇-醋酸-水（415上層或411）；（2）25%醋酸水溶液；（3）85%醋酸水溶液顯 色 （1）可見光下觀察，再在紫外光下觀察；（2）經氨氣熏

17、后再觀察；（3）噴三氯化鋁試劑后再觀察 點樣：提取的槲皮素及蕓香苷的乙醇溶液和對照品的乙醇溶液。展開劑：正丁醇一醋酸一水（4：l：5）上層溶液。展開方式：預飽和后，上行展開。顯色：噴灑三氯化鋁試劑前后，置日光及紫外光燈（365nm）下檢視色斑的變化。觀察記錄：記錄圖譜及斑點顏色。（2）蕓香苷與槲皮素的聚酰胺色譜層析材料：聚酰胺薄膜。點樣：提取的蕓香苷與槲皮素的乙醇溶液和對照品的乙醇溶液。展開劑：乙醇-水（73），水飽和的正丁醇一醋酸（10：0.2）。展開方式：上行展開。顯色：噴灑三氯化鋁試劑前后，置日光及紫外燈光（365nm）下檢視色斑的變化。 觀察記錄：記錄圖譜及斑色顏色。（3）糖的色譜鑒定層析材料：新華層析濾紙NO.2。點樣：（三）中糖的供試液及葡萄糖、鼠李糖對照品溶液。展開劑：正丁醇一醋酸一水（4：l：5）上層溶液。展開方式：上行展開。顯色：氨性硝酸銀試液，噴灑后先用電吹風冷吹至于，再吹熱風至出現斑點為止。觀察記錄：記錄圖譜及斑點顏色。4、 藥品試劑藥品：每組槐花米20克主要儀器及試劑儀器:（1） 燒杯(100ml ,500ml)；（2） 圓底燒瓶(100ml , 150ml)；（3） 冷凝管；（4） 抽濾瓶； （5）