1、腐蝕生物膜垢中硫酸鹽還原菌的系統進化分析陳 悟1,2 汪文俊2 向 福2 余龍江2* 曾慶福1(1. 武漢科技學院環科所 武漢 430073) (2. 華中科技大學生命與科學技術學院 武漢 430074)摘 要: 從油田回注水系統加壓泵后的管道管壁生物膜垢里分離得到的一株嗜熱、嗜酸、異養型硫酸鹽還原菌, 編號為CW-04。該菌株兼性厭氧、革蘭氏陽性、有極生鞭毛、直或彎曲的短桿狀,能產孢子, 最佳生長溫度47, 在2063下培養基中均能使測試瓶有黑色沉淀產生。從腐蝕防治的角度研究該菌株的生長曲線。主要生理生化特性包括: 生長pH范圍為3.710, 最佳生長pH為66.5, 最佳生長鹽度為0.7%

2、。能夠在H2+醋酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、乳酸鹽、丙酮酸鹽和乙醇等電子供體中生長, 也能夠利用葡萄糖、果糖和簡單的氨基酸作為唯一碳源生長; 能夠在硫酸鈉、硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉等電子受體中生長, 但是不能利用硝酸鹽和硫磺。通過16S rDNA測序以及系列比對分析: 該菌屬于細菌界(Bacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭菌綱(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、蛋白胨鏈球菌科(Peptococcaceae)、脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum), 與該屬中的種Desulfotomaculum aeronauticumd 相似性達到99%。

3、關鍵詞: 硫酸鹽還原菌, 脫硫腸狀菌屬, 系統進化, 16S rDNA, PCRLineages Evolution Analysis of Sulfate-reducing Bacteria in the Corrosion BiofilmCHEN Wu1,2 WANG Wen-Jun2 XIANG Fu2 YU Long-Jiang2* ZENG Qing-Fu1(1. The Research Centre of Environmental Science, Wuhan University of Science & Engineering, Wuhan 430073)(2. S

4、chool of Life Science & Technology, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430074)Abstract: A new thermophilic, acidityphilic, sulfate-reducing heterotrophic bacteria, strain CW-04, was isolated from biofilm dirtiness in pipeline wall after press pump of affusion system in oilfie

5、ld. The bacterium is an concurrently anaerobic, non-motile, Gram-positive, pole flagellum, spore-forming curved rod growing within a pH range of 3.710(optimal growth at pH 66.5) and temperature range of 2063(optimal growth at 47), then, growth curve was studied to efficiently prevent corrosion. The

6、optimum NaCl concentration for growth is 0.7%. A limited number of compounds are utilized as electron donors, including H2+acetate, formate, acetate, lactate, propionate, pyruvate and ethanol. Sulfate, sulfite and thiosulfate, but not sulfer or nitrate, can be used as electron acceptors. Strain CW-0

7、4 is able to utilize glucose, fructose and simple aminophenol as sources of carbon. Analysis of the 16S rDNA sequence allowed strain CW-04(accession numbers: AY703033) to be classified as a representative of a new strain of the genus Desulfotomaculum, Desulfotomaculum aeronauticumd (Bacteria, Firmic

8、utes, Clostridia, Clostridiales, Peptococcaceae) whose similarity is 99%.Keywords: Sulfate-reducing bacteria, Desulfotomaculum, Lineages evolution, 16S rDNA, PCR原油在長時間的開采過程中, 地層需要注水來維持油氣輸出壓力, 而輸水所用的長金屬管道管壁在水的生境中, 極易形成由水體沉積物和微生物組成的生物膜垢1,2。人們通過對生物膜垢的形成3、結構4和微生物群落分析5,6得出: 生物膜的形成是微生物腐蝕(Microbiologically

9、 Influenced Corrosion MIC)發生的必要條件, 也是微生物的金屬腐蝕難以防治的主要原因。本論文首次采用純培養的方法直接從回注水系統的管壁膜垢中分離純化得到一株耐溫、嗜酸產孢子的脫硫腸狀菌。從腐蝕防治的角度來研究它的生長代謝規律、生理生化特性, 并通過對基因16S rDNA序列的測定進一步確定了該菌株的分類學和系統發育地位。1 材料和方法1.1 分離源和分離純化方法菌株來自中石化中原油氣高新股份有限公司文南油田聯合污水處理站, 菌株CW-04取自回注水系統加壓泵后的碳鋼管道管壁生物膜垢經富集、分離、純化后得到。1.2 菌株的形態學觀察和芽孢觀察菌體形態觀察先用Nikon A

10、lphaphot-2 YS2光學顯微鏡, 后用JEM-100cxII透射電鏡觀察菌體形態、芽孢以及鞭毛情況, 用掃描電子顯微鏡(SEM型號: HITACHI, X-650)觀察菌體表面情況。并用革蘭氏染色方法確定菌株是陽性還是陰性, 培養芽孢用生孢培養基，鞭毛用磷鎢酸負染的方法觀察。1.3 細菌生長量測定采用測定培養基中硫酸鹽的消耗量來間接得到硫酸鹽還原菌的生物量的變化的方法: 420 nm下進行比色測定, 以硫酸鹽為橫坐標, OD值為縱坐標作出硫酸鹽標準曲線, 在曲線上得出培養液中的SO42-濃度值。1.4 生理生化實驗實驗利用已經使用過的北京華興化學試劑廠生產的SRB-HX型硫酸鹽還原菌測

11、試瓶, 將原菌體培養基抽空, 加酸、洗凈后, 注入相應的不同碳源、硫的氧化酸鹽、硝酸鹽等硫酸鹽還原菌培養基18 mL,經濕法滅菌, 接種2 mL。在47培養箱中培養4 d左右觀察測試瓶溶液是否有黑色沉淀產生而最終確定菌株能否在這種特異培養基中生長。1.5 16S rDNA的PCR擴增和系列分析總DNA的提取按照文獻7進行, PCR反應的引物參考文獻8, 5'-端引物GM3: AGAGTTTGATC (A/C)TGGCTCAG(對應于大腸桿菌的824), 3'-端引物U1492r: GGTTACCTTGTTACGACTT(對應大腸桿菌的14921510)。將所測系列通過Blast

12、程序與GenBank中核酸數據進行系列比對分析, 并利用T-COFFE進行多重序列比對、比對結果用MEGA3進行系統發育分析,構建系統進化樹。2 結果和分析2.1 分離菌株形態學用接種針從油田新鮮廢棄的腐蝕穿孔的金屬碳鋼鋼管內壁刮去一層生物膜垢, 直接接種到已滅菌的硫酸鹽還原菌液態培養基中富集培養。用滾管法分離, 得到一株兼性厭氧、直或彎的短桿狀菌, 用透射電鏡和掃描電鏡觀察: 直徑為0.8 mm左右, 長度 3 mm 6 mm, 有13根較長的端生鞭毛(圖1-B是菌體噴金后的掃描電鏡照片), 可以觀察到有明顯的孢子生成(見圖1-C), 革蘭氏染色陽性。在厭氧條件下如果接種到硫酸鹽還原菌的瓊脂

13、培養皿中, 可以觀察到該菌落為氣泡形, 周圍是黑色的硫化亞鐵顆粒, 頂端是鼓起的無色硫化氫氣泡, 直徑0.5 mm2 mm(見圖1-A)。2.2 菌株的生長曲線的確定硫酸鹽還原菌培養基中含有大量的硫酸根離子, SRB也是從硫酸根離子還原成負二價硫離子的過程中獲得能量的; 硫酸根離子消耗量的變化一定程度上反映了SRB數量的變化、代謝的快慢。采用在乙醇介質中, 以釷試劑作指示劑, 亞甲基藍溶液作襯色劑, 用鉻酸鋇標準溶液作滴定劑, 可以合理測定硫酸根離子變化。而生長曲線的測定一方面可以提供不同菌株具有不同生長規律的信息, 更重要的是可以指導我們合理的加藥時間間隔、合理的加藥方式以及合理的加藥量(圖

14、2)。為我們最終解決油田回注水的微生物腐蝕問題提供了強而有力的理論依據。圖1 菌株CW-04的形態學(A: 菌落形態照片; B: 掃描電鏡照片; C: 孢子的透射電鏡照片)Fig. 1 Morphology of strain CW-04 (A: Photo of cells colony; B: SEM of strain; C: JEM of spore-form)表1 菌株CW-04在不同電子供體下的生理特性(硫酸鹽作為電子受體)Table 1 Physiological characteristics of CW-04 species electron donors (with sul

15、fate as electron acceptor)不同碳源Different carbonsourcesDesulfoto-mauclumstrain CW-04不同碳源Different carbonsourcesDesulfoto-Maculumstrain CW-04H2 + CO2-IsopropanolH2+ acetate+Isoamyl alcohol-Sodium Formate+Mannitol+Sodium Acetate+Propoctyl alcohol-Sodium Lactate+propyl threealcohol-Sodium Propionate+Aeth

16、er-Sodium Butyrate-Acetone-Sodium Pyruvate+Glucose+Sodium Citrate-Fructose-Sodium Succinate-Saccharose-Sodium Fumarate-Maltose-Sodium Malate-L- cystine+Sodium Oxalate-L-lysine-Methanol-D,L-a-amin- opropIonic+Ethanol+acidPropanol-D,L- methionine-Butanol-Sodium Glycolate-Electron acceptors (with lacta

17、te as energy and carbon source):Sulfate+Nitrate-Sulfite+Sulfur-Thiosulfate+2.3 菌株的生理、生化特性研究不同電子受體和電子供體對硫酸鹽還原菌生長的影響: 根據油田回注水系統中可能存在的有機碳源, 結合實驗室里的條件, 我們研究了33種電子受體對硫酸鹽還原菌生長的影響。同時, 還研究了硫磺、硫酸鈉、硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉以及硝酸鹽5種電子供體對SRB生長的影響, 具體見表1。從表中我們可以看出: 該菌株能利用一些初級醇類、短鏈脂肪酸、葡萄糖、一些氨基酸以及乙醚、丙酮等為碳源, 較難利用分子量較大的脂肪酸和醇類。這些性質

18、與文獻15報道脫硫弧菌屬的生理生化特性相似。圖2 菌株CW-04的生長曲線Fig. 2 The growth curve of strain CW-04不同pH條件、溫度條件對硫酸鹽還原菌菌株生長的影響: 從圖3中我們可以看出: 不同pH條件對菌株的生長速度有較大的影響, pH在低于3和高于10 的培養基中不能生長, 最佳生長pH值為6.7左右。最佳生長溫度47, 在63下特殊培養基中能使測試瓶產生黑色沉淀, 78不能生長, 但是在該溫度下培養3d后, 再放置47下, 能夠觀察到菌體的繼續生長。圖3 菌株CW-04在不同pH和不同溫度下的生長狀態Fig. 3 The number of str

19、ain CW-04 in different pH, different temperature圖4 菌株的16S rDNA凝膠電泳照片Fig. 4 Analysis of the 16S rDNA gene by gel electrophoresis1: DL2000 DNA marker; 2: PCR product of strain CW-04 圖5 菌株CW-04(AY703033)與44種典型脫硫腸狀菌16S rDNA構建的系統進化樹Fig. 5 Phylogenetic relationship among typical 44 genus in all Desulfotom

20、aculum 16S rDNA gene and CW-04(AY703033)2.4 菌株CW-04的系列數據處理和系統發育樹構建將菌株的序列測序結果輸入GenBank以Blast軟件進行序列同源性比較, 結果顯示菌株CW-04的16S rDNA全系列與脫硫腸狀菌屬的菌株Desulfotomaculum aeronauticumd具有較高同源性(接近99%), 菌株CW-04在GenBank中的序列登錄號為: AY703033。用文獻9報道的軟件和方法遠程獲取GenBank上所有的硫酸鹽還原菌16S rDNA系列, 選取其中比較有代表性的菌株28株, 與本實驗所測的菌株進行多重系列比對, 比

21、對結果用MEGA3軟件構建最大節約一致樹如圖5, 其中圖4是該菌株通過PCR擴增的16S rDNA的瓊脂糖凝膠電泳照片, 最亮的條帶對應的長度正是標記物1500 bp左右的地方。3 結論油田回注水體系的水源復雜, 一般包括原油分離水、礦井作業廢水、煉油廢水、地面污水、生活污水以及一些補充水(如: 淺層井水、海水、河流水等等), 這些水源礦化度高, 富含各種有機物, 有利于各種微生物的過度生長。如果不加以處理, 很快造成輸水管線腐蝕穿孔、底下油井堵塞等等, 給原油的開采和輸送帶來嚴重的影響。為了更好治理硫酸鹽還原菌對金屬管道的腐蝕,從油田回注水系統金屬管道管壁生物膜垢中分離得到的一株脫硫腸狀菌,

22、 兼性厭氧, 產孢子, 能夠利用較多的短鏈碳源生長, 所能利用硫的氧化酸鹽也較多, 所能適應生長溫度、pH范圍也較寬, 通過測定該菌株16S rDNA基因序列在GenBank上Blast比較和系統發育分析, 該菌株屬于脫硫腸狀菌屬中的Desulfotomaculum aeronauticumd種的一株。由于該菌株隱藏在生物膜垢中, 又能通過孢子的方式繁殖, 所能適應的生長環境也較寬, 如果單純采用化學藥劑來抑制或殺死SRB很難達到目的。這對于我們開發生物的、物理的包括化學的金屬微生物腐蝕綜合防治方法提供一定的理論支持。參 考 文 獻1 Cecilia MS, Timothy GF. Struc

23、tural and functional dynamics of sulfate-reducing populations in bacterial biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64: 3731-3739.2 Philip SS. Diffusion in biofilms. Journal of Bacteriology, 2003, 185: 1485-1491.3 Almeida MAN, Franc FP. A biofilm formation on brass coupons exposed to a cooling system of an oil refinery. Journal of Industrial Microbiolog