1、人乳頭狀瘤病毒（HPV）疫苗的 最新研究進展 王小兵      張偉 中國協和醫科大學 中國醫學科學院 腫瘤研究所生物檢測中心摘要：人乳頭狀瘤病毒（HPV，human papillomavirus）感染是宮頸癌的主要病因。清除HPV感染和阻斷由HPV感染所引發的宮頸癌前病變的進展尚缺乏理想的方法。目前，國際上已有20多種HPV相關疫苗已進入動物和臨床試驗階段，主要分為預防性疫苗和治療性疫苗，主要制劑形式是蛋白質、核酸。動物實驗和臨床試驗結果顯示HPV疫苗將在預防HPV感染及治療由感染所引起的相關疾病方面將有重要作用。關鍵詞： 人乳頭狀病毒 疫苗 進展中圖

2、分類號：R730.7             文獻標識碼 A         人乳頭狀病毒是一種無包膜的DNA病毒，目前已發現100多型別，主要感染生殖道粘膜和口腔、咽部上皮粘膜細胞等，是宮頸癌的主要病因，在我國婦女宮頸癌組織中HPV感染率大于95%，其中高危型HPV如16、18型占90%以上，世界范圍內每年有40萬新發宮頸癌病例，20萬人死于該病1。HPV感染與宮頸上皮不典型增生及粘膜生殖道尖銳濕疣發病關系密切。因此，研制HPV疫苗來預防HPV

3、感染和治療HPV感染引起的相關疾病對于保護廣大婦女身體健康具有重要價值。一. HPV疫苗的分型1 HPV疫苗可分為預防性和治療性兩種類型   1.1 HPV預防性疫苗:可阻斷HPV感染皮膚和粘膜，一般由病毒衣殼蛋白L1或L1+L2組成，在細胞內可自我組裝成空心病毒樣顆粒（VLPs）2，它具有與完整病毒相同的抗原空間表位，可激發機體的CD4+淋巴細胞介導的體液免疫反應，刺激機體產生保護性中和抗體。預防型疫苗種類較少，主要以HPV病毒的結構蛋白質形式存在。  1.2 HPV治療性疫苗：可清除由HPV感染所引起的腫瘤殘存病灶、宮頸不典型增生（CIN）及生殖器尖銳濕疣，阻

4、斷低危型病變向高危型及癌癥的轉變過程。主要分為蛋白質疫苗和基因疫苗。HPV引發上皮細胞的轉化并最終導致癌變主要由于HPV轉化基因E6、E7造成，E6可誘發P53的降解，E7可抑制Rb的抑癌功能。實驗證實在宮頸上皮細胞發生癌變的整個過程中必須有E6、E7基因的持續表達,故E6、E7已成為HPV治療性疫苗研究焦點。另外，由于HPV基因組已整合于基底層細胞染色體中，病毒復制需要E1、E2的表達，因此國際上有用E1、E2來設計治療性疫苗的研究報道。    1.2.1 HPV治療性蛋白疫苗：該疫苗的抗原部分一般采用E6或（和）E7，E7免疫原性優于E6，E6/E7融合后可提

5、高免疫效果，在使用或不使用佐劑的情況下均可產生細胞免疫反應。由于E6、E7蛋白本身的免疫原性較弱以及具有潛在的致癌性，而且野生型的E6、E7不易被降解，不利于抗原的遞呈，因此HPVE6、E7疫苗多經修改或融合其它蛋白以提高其免疫效果。蛋白質疫苗又分為多肽疫苗，融合蛋白疫苗，嵌合疫苗等。    多肽疫苗：E6、E7與人HLA型相配的多肽片段，使用佐劑誘導機體產生CTL反應來治療HPV感染。如E7肽段疫苗。    嵌合蛋白疫苗：HPV晚期蛋白L1和L2的末端與早期蛋白相融合，以激發對早期蛋白的免疫。如L1-E7、L2E7 (TA-GW)、

6、L2E7E6 (TA-CIN)等。    融合蛋白疫苗：由HPV早期蛋白相互融合或早期蛋白融合有其它蛋白，能更好的激發對機體免疫系統的免疫功能。如E6/E7、HSP/E7融合蛋白等。    1.2.2 HPV治療性基因疫苗：基因疫苗可分為DNA和RNA兩種。采用基因載體攜帶E6或E7基因進入抗原呈遞細胞，并持續表達抗原蛋白分子，免疫系統識別抗原后被激活清除感染HPV的細胞。    基因疫苗可持續表達抗原，并易于構建和改造，易于制成多價疫苗，不需要佐劑，熱穩定性好，成本低廉等，但同時存在免疫效果弱和重組復活

7、等安全性問題。      DNA疫苗：采用病毒載體或其他載體攜帶HPV早期基因，如重組有E7的牛痘病毒疫苗、腺病毒疫苗、腺相關病毒疫苗，一些疫苗還混合有APC的表面受體的相應配體、化學激活劑等，還有學者將DNA疫苗中融合有可引導抗原至細胞內降解的序列、致細胞死亡的序列等。DNA疫苗的主要問題為HPV基因整合后具有潛在危險，而且不具有內在的擴增能力，以及不能在體內擴散而影響其效用的發揮。     RNA疫苗：具有RNA復制子可自我復制3。采用病毒SINrep5作為復制子，融合有早期基因

8、片段和其他基因片段，如單純皰疹病毒外殼蛋白基因（VP22）、結核桿菌熱休克蛋白基因（HSP70）和定位到內體、溶酶體的信號蛋白基因（LAMP-1）。RNA疫苗常采用肌肉注射，疫苗RNA可在肌肉細胞中大量復制導致細胞裂解，大量的RNA被APC獲得，或在肌肉細胞中翻譯成蛋白后分泌到細胞外被APC獲得，通過MHC途徑激發抗HPV早期蛋白的細胞免疫。另外，RNA疫苗還能激活NK細胞，增強免疫激活功能。RNA疫苗不整合入基因組，并且不含有病毒結構基因，不能形成有活性的病毒，且被感染的細胞將發生調亡，故無致癌潛能，有利于人體的應用。其缺限為在注射部位有逐漸增強的壞死和炎癥反應，并且活化的NK細胞和抗原特異

9、性的T淋巴細胞可能會產生的自體免疫，最終損傷組織和器官。二. HPV疫苗的臨床試驗結果    目前，已有二十多種疫苗處于動物實驗和臨床研究中。HPV疫苗的臨床試驗報道為數不多，此類研究主要集中在發達國家。    1.預防性疫苗 有報道英國使用昆蟲表達體系表達重組的HPV16 L1 VLPs，分別在兩種劑量下，使用或不用佐劑，多次肌肉注射，經人體試驗證實可激發機體產生抗原特異性的IgG抗體，最常見的副作用是注射區的疼痛感，但大多數受試者的疼痛溫和而短暫，說明VLPs疫苗在安全性和有效性方面取得了進展。VLPs作為預防性疫苗在美國和拉丁美洲已開展臨

10、床期實驗，但是由于HPV感染到患病的周期較長，實驗獲得的數據有限，計劃在亞洲進行相應的期實驗4。專家預測5年內該產品可上市，可能為VLPs四價疫苗。    另外，HPV6型預防型疫苗VLPs在一項針對尖銳濕疣的臨床試驗中證實能起到一定的治療作用5。    此外，也有部分預防型疫苗采用DNA疫苗，如Merck公司的痘病毒載體融合L1基因片段6。   2.治療性疫苗 治療性疫苗較預防性疫苗種類要多，蛋白質型和基因型在臨床試驗中都獲得了一定的治療效果。    2.1肽段疫苗 肽段疫苗最主要的

11、代表為E7肽段疫苗，采用HLA-A0201結合肽，主要是E7蛋白第11-20和86-93個氨基酸兩段分子肽段，動物實驗證明其能引發細胞毒性T淋巴細胞免疫反應（CTL），在一項針對宮頸和外陰重度不典型增生的期臨床實驗中7，18名受試者中有3名不典型增生消失，在可評價的16人中有10人檢測到針對抗原的CTL發應，宮頸刮片有12人沒有檢測到HPV DNA。另外，在芬蘭曾進行、期臨床試驗治療一些用常規方法無效的晚期宮頸癌患者，結果在19名治療對象中沒有發現嚴重的副作用，其中一名患者病情得以穩定，2名患者腫瘤得以抑制8。    臨床試驗證實多肽疫苗對癌前病變及宮頸癌有一定的

12、治療效果。多肽疫苗具有易于生產、價廉等優點，但多肽疫苗抗原性弱，一般采用結合佐劑的方法，但佐劑是臨床副作用的一個重要原因，且目前被FDA批準的唯一佐劑是Al(OH)3，該佐劑能促進體液免疫，但對治療起重要作用的細胞免疫無促進作用。多肽疫苗的另一個問題是需要符合特定的HLA型，給應用帶來一定局限性。    2.2 嵌合蛋白 嵌合蛋白的研究是目前治療型疫苗的另一重要方面，文獻報道主要有L1-E7、L2E7 (TA-GW)、L2E7E6 (TA-CIN)三種。其中L1-E7疫苗有多家公司研制，有多種存在形式，如MediGene的L1-E7采用L1融合了E7 N端60個氨

13、基酸的形式，動物實驗表明能很好的激發針對L1的體液免疫和E7的細胞免疫，2000年進入/臨床試驗階段，受試者為HPV16陽性的CIN患者，臨床結果尚未公布；L2E79為HPV6型L2羧基端缺失部分片段并結合完整E7片段，是Cantab公司產品，主要用于治療尖銳濕疣，1996年已完成a期臨床，實驗對象為由16名復發和11新發的尖銳濕疣病例組成，結果6名完全清除，另15患者繼續接受治療，有13名完全清除，并且都沒有復發，臨床實驗后研究方向主要集中在佐劑的選擇之中，但至今沒有文獻報導；L2E7E610是由HPV16型早期蛋白和晚期蛋白組成，用于治療宮頸癌，動物實驗顯示其能有效的抑制腫瘤的形成，且接種

14、L2E7E6后結合TA-HPV疫苗能取得更好的效果。在一項針對40例健康個體的臨床期試驗中顯示其具有激發細胞免疫的功能，目前一項針對女性外陰高度不典型增生的臨床期試驗正在驗證此疫苗與DNA疫苗TA-HPV的聯合免疫效果。嵌合蛋白既可刺激機體產生體液免疫，起到預防作用，也能激發細胞免疫，起治療作用，但是對于感染者來說，血清中經常存在抗晚期蛋白的抗體，這些抗體對嵌合蛋白的治療可能具有抑制作用。    2.3 融合蛋白 融合蛋白E6/E7的研究國內外進行較早，但治療效果不理想并且表達水平較低，隨著新的免疫佐劑或增強劑的出現，目前國內已有人研究E6/E7融合蛋白，且對其進

15、行改造，消除早期蛋白的潛在致癌潛能，并實現高表達。動物實驗結果理想，尚未進入臨床階段。HSP65-E711是HPV16 型E7蛋白與牛的分枝桿菌熱休克蛋白65（HSP65）融合而成，利用熱休克蛋白可將抗原導入樹突狀細胞的特性，從而激活抗早期蛋白E7的細胞免疫。該疫苗由加拿大STRESSGEN公司研制，現已進行了大量的臨床實驗，針對不同的適應癥，臨床實驗進度不同，肛門不典型增生已完成臨床期，尖銳濕疣已完成臨床期試驗，復發性呼吸道乳頭狀瘤病(RRP) 已完成臨床期試驗，宮頸不典型增生已完成臨床期試驗，宮頸癌已完成臨床期試驗。臨床結果表明該疫苗對由HPV引起的相關疾病確有明顯的治療作用，但具體數據不

16、祥。此疫苗具有無HLA限制、CTL反應無需CD4+T細胞誘導的特點，這對已擴散或HIV感染等免疫抑制患者具有優勢。這種疫苗有望成為治療HPV感染的疫苗。    2.4 基因疫苗 DNA疫苗的臨床研究較RNA疫苗成熟，大多進行到臨床試驗階段。DNA疫苗多使用病毒作為載體，如牛痘病毒、腺病毒和腺相關病毒，他們在對免疫系統的刺激上比單純的E7基因疫苗有明顯的優勢。腺病毒作為載體并混合抗CD40雙特異性抗體，可增強DCs對抗原基因的獲得，用這種疫苗在小鼠實驗中能獲得抗原特異性和CD8+T細胞依賴的免疫反應12。    一種重組牛痘病毒疫苗TA

17、-HPV13，融合有HPV16、18 型E6和E7基因，在歐洲已開展了臨床期實驗，臨床實驗結果表明TA-HPV是安全有效的，在患有宮頸癌的29名受試者中，接種一次就有4名患者產生了特異性的細胞毒性T淋巴細胞反應，8名患者有特異性的血清反應。基因疫苗在誘導免疫效應上還不如人意。為進一步提高其免疫及保護效率，眾多研究者們付出大量努力：改善免疫途徑和方式；選擇優化免疫刺激序列及載體；表達嵌合抗原或多重抗原；共表達抗原與細胞因子或協同刺激分子，如LAMP-114,HSP7015等。Chen15等研究發現，利用結核分枝桿菌HSP70融合腫瘤抗原基因HPV E7構建基因疫苗，可顯著增強抗原特異性的CTL反

18、應和提高抗腫瘤效力。另外，在劑型方面的改變也有報道，如美國研發的一種基因疫苗藥物ZYC10116，由可降解的生物大分子多聚體包裹質粒DNA形成，質粒DNA中表達抗原部分為編碼HLA-A2限制性表位的E7片段，它主要用于治療HPV16型引起的肛門的不典型增生，治療對象的HLA是A2型，在進行的臨床期試驗中，12名患者在所有劑量組的實驗中均有很好的耐受，其中3名在接種后的12-24周后出現部分的病變部位組織學上的變化，有10名患者顯示免疫能力有所提高。    另有報道使用E5作為抗原的DNA疫苗rAd-E517，在動物實驗中，一次肌肉注射rAd-E5即可產生CD8+介

19、導的細胞免疫反應，抑制腫瘤的發生。    RNA疫苗的臨床研究目前還未見報道，但在理論上分析其可能具有較大的應用價值，并且動物實驗也證實了其具有激發CD8+T介導的免疫反應能力和明顯的抗腫瘤作用，是基因疫苗發展的一個重要方向。展望     HPV疫苗的研究在近10年中取得了長足進展，許多疫苗已完成/期臨床試驗，準備進行更深入的研究。但距臨床應用尚有距離，如臨床副作用和對環境的安全性，HPV病毒的嚴格種屬特異性,無法建立動物模型評價疫苗的免疫效果以及疫苗自身的安全性問題等，另外，如何選擇最佳的疫苗策略,如載體的優化,臨床應用疫苗條件的合

20、理選擇等，這些都應該是研發HPV疫苗和治療時應考慮的內容。由于以上種種原因,現已開發的疫苗還沒有一種是十分有效,安全性好，能被普遍接受的。因此，要研制出一種理想的HPV治療疫苗并在人群大規模推廣尚需時日。開發對尖銳濕疣和不典型增生以及宮頸癌都有效的疫苗將有重要應用價值和前途。參考文獻：1 Pisani P,Parkin DM,Bray F ,et al.Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990.Int J Cancer J.1999,83:18-29 2 Kirnbauer R,Taub J,Greenstone

21、H,et al.Efficient self-assembly of human papillomavirus type 16 L1 and L1-L2 into virus like particles.J Virol J.1993,67:6929-363 Ying H, Zaks TZ, Wang RF, et al. Cancer therapy using a self-replicating RNA vaccine. Nat Med J.1999;5:82374 Franceshi.S.Human papillomavirus:a vaccine against cervical c

22、arcinoma uterine.Epidemiol Prev J,2002,26(3)140-45 Zhang LF,Zhou J,Chen S,et al.HPV6b virus like particles are potent immunogens without adjuvant in man.VaccineJ .2000,18:1015-86 Zhou J,Sun XY,Stenzel DJ,et al.Expression of vaccinia recombvinant HPV16 L1 and L2 ORF proteins in epithelial cells is su

23、fficient for assembly of HPV viron-like particles.Virology J.185:251-2577 Laila Muderspach, Sharon Wilczynski, Linda Roman,et al. A Phase I Trial of a Human Papillomavirus (HPV) Peptide Vaccine for Women with High-Grade Cervical and Vulvar Intraepithelial Neoplasia Who Are HPV 16 Positive.Clinical C

24、ancer ResearchJ.2000; 6:3406-34168 Steller MA,Gurski KJ,Murakami M, et al.Cell-mediated immunoligical responses in cervical and vaginal cancer patients immunized with a lapidated epitope of human papillomavirus type 16 E7.Clin Cancer ResJ. 1998,4:2103-21099 Lacey CJ,Thompson HS,Montriro EF,et al.Pha

25、se 2a safety and immunigenicity of a therapeutic vaccine,TA-GW,in persons with genital warts.J Infect Dis J.1999,179:612-61810 A.de Jong,T.ONeill,A.Y.Khan,et al.Enhancement of human papillomavirus type 16 E6 and E7-specific T-cell immunity in healthy volunteers through vaccination with TA-CIN,an HPV

26、 16 L2E7E6 fusion protein vaccine.VaccineJ.2002,20:3256-346411 N.R.CHU,H.B.WU,T.-C.WU,et al.Immunotherapy of a human papillomavirus(HPV)type 16 E7-expressing tumour by administration of fusion protein comprising Mycobacterium bovis bacilli Calmette-Guerin(BCG) hsp65 and HPV 16 E7.Clin Exp ImmunolJ.2

27、000,121:216-22512 Bryan W. Tillman, Traci L. Hayes, Tanja D. deGruijl,et al.Adenoviral Vectors Targeted to CD40 Enhance the Efficacy of Dendritic Cell-based Vaccination against Human Papillomavirus 16-induced Tumor Cells in a Murine Model. Cancer ResearchJ. 2000,60:5456-546313 Andreas M.Kaufmann,Peter L.Stern,Elaine M.Rankin,et al.Safety and Immunogenicity of TA-HPV,a Recombinant Vaccinia Virus Expressing Modified Human Papilloma