1、學習 好資料 第二章 抗體的結構與功能 * 重點章節。 （一個名詞解釋）1、（Ab）:抗原剌激機體后，由漿細胞產生的并能與抗原發生特異性結合的球蛋白。免疫球蛋白（lg）:具有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白3功能區：lg分子的H鏈和L鏈可通過鏈內二硫鍵折疊成若干個球形結構，每一個球形結構由110個氨基酸組成,具有一定的生理功能，稱為功能區。又叫結構域。lg 分子超家族的4變異度（variability）:某一位置的變異度為該位置出現的不同氨基酸數與該位置最常出現的氨基酸殘基的出現頻率之 間的比值 。5、免疫球蛋白超家族immunogloblin superfamily lGSF ：含有免疫

2、球蛋白折疊結構樣功能區的分子。成員多數為細胞膜表面分子6、按免疫球蛋白抗原特性分類：1）同種型： 指同一物種內所有個體的抗體共同具有的抗原特異性，存在于恒定區。 同種型抗原特異性因種屬而異，主要包括 lg 的類、亞類，型和亞型。2）同種異型：是指同一種屬不同個體間lg分子所具有的不同抗原特異性。可作為遺傳標記，存在lg的恒定區。VH 或 VL 可變區氨基酸序列的Fv段，6個CDR襻位于Pv段的N端,3）獨特型：每一個抗體形成細胞克隆所產生的抗體分子上所特有的抗原特異性。由不同所決定。 與抗體結合抗原的特異性密切相關。7、CDR表位：VH和VL緊密地結合在一起，形成一個致密的球狀結構，成為 叫做

3、CDR表面（CDR surface，即抗原結合部位。8結合力：抗原抗體的結合依靠靜電引力、氫鍵、范德華力等，需要合適的溫度、pH、離子強度及完整的抗體,這種結合是可逆的。9、抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity ， ADCC） ：抗體分子與靶細胞表面抗原結合后，可通過其Fc段與殺傷細胞表面的 Fc受體相結合，促進對靶細胞的殺傷作用，稱為 ADCC單核巨噬細胞、中性粒細胞、 NK 細胞第三章 多克隆抗體（一個簡答）1、多克隆抗體的概念傳統的抗體制備方法是將一種天然抗原經不同免疫途徑免疫動物，由于抗原性物質具有多

4、個抗原決定簇，可以刺激機體產生多種抗體形成細胞克隆， 合成和分泌抗各種決定簇的抗體， 故在其血清中實際上是含多種抗體的混合物 所以稱這種免疫法所獲得的免疫血清為多克隆抗體。2、抗體應答反應中初次應答和記憶應答的各自的特點。初次應答：潛伏期長。抗體類型最早產生IgM，接著才產生IgG, 2w2m才產生IgA。抗體總量低。維持時間短。親和力弱。記憶應答：潛伏期短。抗體類型IgG為主，IgM很少。抗體總量高。維持時間長。親和力強。3、免疫佐劑： （概念、作用、主要類型）學習 好資料 概念：先于抗原或與抗原混合同時注入動物體內，能非特異性地改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應答，發揮 輔助作用的物質，

5、被稱為佐劑或免疫佐劑。生物學作用： 1、增加抗原的免疫原性2、提高抗體的滴度（抗體的滴度其實也就是抗體的濃度）3、改變抗體的類型 IgM IgG 4、引起或增強遲發型超敏反應佐劑的作用方式：在接種部位形成抗原貯存庫增加抗原的表面積促進局部的炎癥反應主要的免疫佐劑的類型：無機佐劑；乳化油劑；微生物極其代謝產物；人工合成佐劑；生物分子類。4、蛋黃抗體 IgY：概念：是指蛋黃中存在的抗體，也稱蛋黃免疫球蛋白特點： IgY 化學性質穩定。抗體產量大。成功率高。應用：作為抗生素的替代品，用于畜禽疾病的預防和治療。酶和激素的IgY：尿酶的IgY、膽囊收縮素抗體。新的飼料添加劑。第四章 單克隆抗體（ * 重

6、點章節。考一個論述）1、原理：一個淋巴細胞只接受一個抗原決定簇刺激及經刺激后擴增的淋巴細胞產生均一的同質抗體，此即單克隆 抗體技術的理論基礎。2定義：由一個識別單一抗原決定簇（表位）的B細胞克隆所產生的結構與功能完全相同的同源抗體。3、單克隆抗體的應用。A 生命科學研究：蛋白質組學研究領域（人類蛋白質組計劃） ；細胞抗原研究及鑒定分類（人類白細胞分化抗原、淋 巴細胞亞群分類、淋巴細胞亞群分離純化） ；細胞受體研究（受體的分離純化、細胞定位、結構研究、功能分析）；B 疾病診斷與治療：感染性疾病診斷（檢測病原體微生物的抗原、對各類病原體的分型及鑒定）；腫瘤診斷及預后判斷（檢測血液中的腫瘤標志物）

7、；其它診斷及研究疾病治療（生物導彈 治療性抗體）4、單抗制備的實驗方案。A 融合前的準備工作： 組織培養材料的準備 （設備 組織培養用水 培養基 血清 抗生素 ）；小鼠免疫（抗原 動物選擇 免 疫途徑 載體）B細胞融合：骨髓瘤細胞的選擇（生化缺陷型骨髓瘤細胞系NS1細胞株，SP2/0細胞株。）骨髓瘤細胞的培養（細胞處于對數生長期；形態和活性佳（活性大于95 %）;約需1X 108個骨髓瘤細胞；融合前用含 8-氮鳥嘌呤的培養基作適應培養。 ）骨髓瘤細胞懸液的制備學習 好資料脾細胞懸液的制備飼養細胞的制備細胞融合與選擇性培養C雜交瘤細胞的篩選：顯微鏡觀察確定待篩選孔。換液后，細胞在 37C、5%C

8、02培養箱中培養2天以上。從要檢測的孔中取100卩I上清用于檢測，如 ELISA間接免疫熒光等。D 雜交瘤細胞的擴增、凍存和克隆化：a 克隆化：使單個細胞無性繁殖而獲得該細胞團體的整個培養過程。（將抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、特異性抗體分泌細胞和無關抗體分泌細胞分開。有限稀釋法）b凍存：細胞在加血清和二甲基亞砜的培養基中以一定的緩慢速度下降溫度，可在-196 C液氮或液氮蒸氣中長期保存。凍存的雜交瘤細胞應處于對數生長中期、健康而活力好。c 細胞的復蘇E 單克隆抗體的大量制備：制備雜交瘤培養上清；大規模制備雜交瘤培養上清；制備單克隆抗體腹水；單克隆抗體的純化（粗提 純化）。第五章 基因工程抗體

9、（一個名詞解釋，一個簡答）1、 基因工程抗體：是指根據不同的目的和需要，利用DNA重組技術或蛋白質工程技術，在基因水平上對抗體分子 進行加工、改造和重組裝配，然后導入受體細胞進行表達產生的抗體分子。也稱第三代抗體。2、基因工程抗體的優點：（1）通過基因工程技術的改造，可以最大程度降低抗體的鼠源性，降低甚至消除人體對抗體的排斥反應。（ 2）基因工程抗體的分子較小，穿透力強，更易到達病灶的核心部位。（3）可以根據治療的需要，制備多種用途的新型抗體。（4）可以采用原核細胞、真核細胞或植物等多種表達系統大量生產抗體分子，成本大大降低。3、各種類型基因工程抗體的特點，應用、優缺點。 （分為以下 7個問題

10、）（1）嵌合抗體： 可變區基因克隆的方法：用探針從該雜交瘤細胞系的基因組文庫中釣取； 用RT-PCF方法從該細胞的 mRNA中擴增VH及VL基因。嵌合抗體的表達（提高表達量的方法） ：二氫葉酸還原酶（dhrf）擴增系統：CHO的顯性選擇標記基因宀轉染陽性細胞篩選甲氨喋呤t dhfr基因擴增t抗體基因擴增t抗體表達量提高（ 2）改形抗體：改形抗體構建的原則？學習 好資料A 在選擇骨架區時，從已知的人可變區數據中選擇與親本抗體同源性最高的序列，這樣就最大可能的維持原抗體的 天然構象。B 將骨架區內可能影響抗原結合部位的氨基酸殘基替換為親本鼠單抗的殘基C合適的保留CDR兩側的骨架區序列D抗體可變區的

11、N末端特別是輕鏈的 N末端與CDR表面相距很近，這一區域很有可能參與抗原的結合，所以構建改形抗體時，有必要選擇性地將 N 末端的數個氨基酸殘基一起移植。（ 3）抗體庫技術人源化：抗體表位定向選擇，概念和基本過程。 概念：以鼠單抗可變區為模板，利用噬菌體展示技術，通過抗原導向，篩選能夠模擬鼠單抗可變區，結合相同抗原 決定簇的人抗體，稱為抗原表位定向選擇（EGS）。過程如下：優點：可以獲得完全的人源抗體缺點：成功率不高，所或抗體性能也難以保證（4）小分子抗體：各種小分子抗體的概念和構成。 定義：具有抗原結合功能的小分子片段，稱為小分子抗體。包括：抗原結合片段（Fab卜可變區片段（Fv）、單鏈抗體（

12、ScFv）和單區抗體等。1、 抗原結合片段（Fab）:完整的輕鏈和Fd組成；分子結構穩定；主要發揮抗體的抗原結合功能；僅有一個抗原結合位點；分子量50kDa；無Fc段，適合免疫導向診斷和治療2、 變區片段（Fv）:由重鏈可變區 VH和輕鏈可變區 VL組成。3、 單鏈抗體（ScF）:在DNA水平用一段長度合適的寡聚核苷酸序列將重鏈可變區和輕鏈可變區連接起來，形成單一 鏈的分子。相對分子量較小，僅為完整抗體的 1/6。4、 單域抗體:約為完整分子的1/12 。只由一個結構域構成，故稱單域抗體。 單域抗體親和力降低，但保持原單抗的特異性。分子小，抗原性弱；易于穿透組織。（ 5）單鏈抗體的基本原理和構

13、建流程。基本原理：在DNA水平用一段長度合適的寡聚核苷酸序列將重鏈可變區和輕鏈可變區連接起來，形成單一鏈的分子。構建流程：鼠雜交瘤細胞t提取細胞總RNAt反轉錄為cDNA第一鏈t擴增抗體 VH、VL基因用（Gly4Ser） 3連接肽基因將VH、VL連成ScFv基因t PCR擴增ScFv基因并與質粒載體連接t連接產物轉化大腸桿菌宿主，篩選陽性克 隆t ScFv全序列的測定（ 6）小分子抗體的優缺點優點：A免疫原性弱，不易引起 HAMA ；B 穿過血管壁或組織屏障進入病灶部位；C腫瘤內定位成像時本底低，圖像清晰；學習 好資料D 半衰期較短 , 造影時對周圍的組織損傷小；E 制備流程簡單，可原核表達

14、，制備成本低,容易大量制備；F易于進一步進行基因工程改造。 缺點：多為單價，抗原結合能力較弱；半衰期較短，很快從血液中清除，影響治療的有效濃度。（7）雙特異性抗體和抗體融合蛋白：定義、應用A 抗體融合蛋白：抗體分子片段與其他蛋白融合，得到具有多樣性生物功能的融合蛋白。 構建方式：含 Fv 段的抗體融合蛋白應用：免疫靶向 免疫橋連 嵌合受體含Fc段的抗體融合蛋白應用：檢測、純化延長血清中半壽期生物學效應功能B 雙特異性抗體：是含有兩種特異性抗原結合位點的人工抗體。特點是：結構雙價；功能單價 應用：免疫診斷學上的應用；腫瘤放射免疫顯像中的應用；雙特異抗體介導的藥物殺傷效應；雙特異抗體介導的細 胞殺

15、傷效應第六章 抗體庫技術（一個名詞解釋，一個簡答）1、抗體庫技術的概念即用基因克隆技術將全套抗體（Repertoire）重鏈和輕鏈可變區基因克隆出來，重組到表達載體，通過原核或真核直接表達有功能的抗體分子片段，從中篩選特異性的抗體可變區基因和抗體。2、噬菌體抗體庫技術的優勢1）可實現單抗的小型化2）可實現單抗的多功能化3）簡單易行、生產成本低、篩選容量大、可通過發酵生產、大量制備4）可實現抗體的工業化生產3、大容量庫的構建抗體庫容量多次構建累積，目前報道最大庫容在 109-1010 （組合感染法，最大庫容6.5X1010）A增加基因的多樣性（取決于CDR多樣性）B 提高連接和轉化效率方法：電穿

16、孔法 優化：提高單次連接和轉化效率（載體性質、酶切與連接效率、載體與目的基因的比例；感染態細學習 好資料胞的質量、載體與細菌的比例、點擊緩沖液的組成等）策略：增加連接和轉化次數C高效的包裝和呈現效率超噬菌體系統（Hyperphage） PW（分子量小，無空間位阻和干擾效應）輔助噬菌體的選擇（如CT型，減少假噬粒）4、噬菌粒的概念、特點概念：噬菌粒（phagemid）:是含有絲狀噬菌體基因間隔區的質粒載體。特點： A 本身不含有噬菌體編碼蛋白基因，在宿主中不產生子代噬菌體，但在輔助噬菌體超感染下，可包裝成成熟 顆粒，并釋放、感染新的宿主。B 若在 phagemid 中克隆入抗體基因，可得到噬菌體

17、抗體。C Phagemid在DNA重組操作上比較簡單，且所建庫容量大。5、噬菌體抗體庫構建的主要技術流程、主要特點。1） 基因的獲取：（1 ）從基因文庫中獲取可變區基因（2）用PCR法擴增Ig的VH和VL基因2）載體的構建、連接：3）表達、淘選4）擴增、篩選：抗體庫的富集5）鑒定、分析：序列測定（基因測序） ；庫容的測定（菌斑） ；親和性測定（ EL I SA ；特異性測定 （WB）6、抗體庫技術有哪些方面的應用。在寄生蟲學的應用；微生物的研究；在腫瘤診斷和治療方面的應用；藥物設計中的應用；制備各種功能抗體片段第七章轉人Ig基因小鼠1、 基因打靶技術：是指外源 DNA與受體細胞染色體 DNA上

18、的同源序列之間發生重組，并整合在預定位點，改變細胞遺傳特性的方法2、轉基因動物：指用人工方法將外源基因導入或整合到基因組內，并能穩定傳代的一類動物3、轉人 Ig 基因小鼠的優點：1）攜帶抗體生成需要的全部基因信息（所帶的人 DNA 片段具有完備的功能，可以自主有效的進行同種型轉換和親 更多精品文檔學習 好資料和力成熟。）2）建立種系后，通過免疫獲得不同的抗體（任何靶抗原均可被用來免疫該小鼠使其產生高親和力的人抗體）3）精確地重現人抗體的產生過程（能夠提供幾乎完全相同的人免疫球蛋白基因環境并在鼠體內精確的重現了人抗 體的產生過程4、轉基因動物制備主要流程以及關鍵點。DNA 顯微注射J 電轉移ES細胞J受精卵t血細胞胚胎t囊胚t原腸胚t轉基因動物f