1、細胞培養基本技術介紹水水的制備：水的制備： 細胞培養用水必須非常純凈，不含有離細胞培養用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質。子和其他的雜質。 需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水 細胞培養基應用選擇細胞培養基應用選擇 選擇培養基沒有一定的標準，有幾點建議可供參考：選擇培養基沒有一定的標準，有幾點建議可供參考： (1 (1 ）建立某種細胞株所用的培養基應該是培養這種細胞）建立某種細胞株所用的培養基應該是培養這種細胞首選的培養基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細胞株時首選的培養基。可以查閱參考文獻，或在購買細胞株時咨詢。咨詢。 (2) (2) 其它實驗室慣用的培養基

2、不妨一試，許多培養基可其它實驗室慣用的培養基不妨一試，許多培養基可以適合多種細胞。以適合多種細胞。 (3) (3) 根據細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養基。如根據細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養基。如小鼠細胞株多選小鼠細胞株多選 RPMI1640 RPMI1640 。 (4) (4) 用多種培養基培養目的細胞，觀察其生長狀態，可用多種培養基培養目的細胞，觀察其生長狀態，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據實驗結果以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據實驗結果選擇最佳培養基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。選擇最佳培養基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。 制備1000mlRPMI1640

3、培養基RPMI1640干粉培養基（1包）蒸餾水400ml磁力攪拌至完全溶解加三蒸餾水定容至1000ml在超凈臺內無菌條件下，用滅菌后的并置有孔徑濾膜的過濾器除菌，并分裝成200ml/瓶，-20保存備用。用前取一瓶溶解，每200ml培養液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。-細胞培養液 一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性無毒性 主要作用主要作用: :防止培養基防止培養基pHpH迅速變動。在開放式培養條件迅速變動。在開放式培養條件下，觀察細胞時培養基脫離了下，觀察細胞時培養基脫

4、離了5%CO25%CO2的環境，的環境，CO2CO2氣體氣體迅速逸出，迅速逸出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若加了HEPESHEPES，此時可以維持，此時可以維持左右。一般在進行克隆化培養時要添加左右。一般在進行克隆化培養時要添加HEPESHEPESmmol/Lmmol/L使用時可向使用時可向100ml100ml培養液中加入培養液中加入2ml 2ml 濃縮液，終濃度為濃縮液，終濃度為20mmol/L 20mmol/L 谷氨酰胺補充液谷氨酰胺補充液 谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定容基中都要添

5、加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定容易降解，易降解，44下放置下放置7 7天即可分解約天即可分解約50%50%，所以都是，所以都是在使用前添加在使用前添加 配制好的培養液（含谷氨酰胺）在配制好的培養液（含谷氨酰胺）在44放置放置2 2周以上周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養液內谷氨酰胺，以便臨時加入培養液內 使用終濃度為使用終濃度為1-4mmol/L1-4mmol/L 一般配制為一般配制為100100倍濃縮液，即濃度為倍濃縮液，即濃度為200mmol/L200mmol/L（），（），配制方法為配制方法為 ： 谷

6、氨酰胺溶于三蒸水加至谷氨酰胺溶于三蒸水加至100ml100ml即配成即配成200mmol/L200mmol/L的的溶液，充分攪拌溶解后（應加溫溶液，充分攪拌溶解后（應加溫3030），過濾除菌，），過濾除菌，分裝小瓶，分裝小瓶，-20-20保存，使用時可向保存，使用時可向100ml100ml培養液中培養液中加入谷氨酰胺濃縮液，終濃度為加入谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mmol/L 1-4mmol/L 細胞計數及活力測定實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。 具體操作： 1.蓋好蓋玻片：取血球計數板，將特制的蓋玻片蓋

7、在血球計數槽上。 2.制備計數用的細胞懸液：細胞懸液到一離心管中，加入臺盼藍染液（）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。 3.將細胞懸液滴入計數板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 4.統計四個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，分別數出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中死細胞和活細胞數。 5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度： （細胞懸液的細胞數）/ml （ 四個大格子細胞數/4)

8、 2104 說明：公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數。 公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1：1稀釋。 公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為： （長）（寬）（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3 欲將一般動物細胞離心下來，其欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？離心速率應為多少轉速？ 欲回收動物細胞，其離心速率一般為欲回收動物細胞，其離心速率一般為300 xg (300 xg (約約1,000rpm)1,000rpm)，5 - 10 5 - 10 分鐘，分鐘， 過高之轉速，過高之轉速， 將造成細胞死亡將造成細胞死亡 細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管細胞欲冷凍保存時，細

9、胞冷凍管內應有多少細胞濃度？內應有多少細胞濃度？ 冷凍管內細胞數目一般為冷凍管內細胞數目一般為1x101x106 6 cells/ml vialcells/ml vial，融合瘤細胞則以，融合瘤細胞則以5x105x106 6 cells/ml vial cells/ml vial 為宜為宜 冷凍管應如何解凍？冷凍管應如何解凍？ 取出冷凍管后，須立即放入取出冷凍管后，須立即放入37 37 C C 水槽水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 1 分鐘分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管蓋沿，否則易發生污

10、染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂全，預防冷凍管之爆裂 細胞冷凍管解凍培養時，細胞冷凍管解凍培養時， 是否是否應馬上去除應馬上去除DMSODMSO？ 除少數特別注明對除少數特別注明對DMSO DMSO 敏感之細胞外，敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應直接放入含有在解凍之后，應直接放入含有10-15ml10-15ml新新鮮培養基之培養角瓶中，待隔天再置換鮮培養基之培養角瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除新鮮培養基以去除DMSO DMSO 即可，如此可避即可，如此可避

11、免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題問題培養細胞時應使用培養細胞時應使用5 % 5 % 或或10% CO210% CO2？或根本沒有影響？或根本沒有影響？ 一般培養基中大都使用一般培養基中大都使用HCOHCO3 3- -/CO/CO3 32-2-/H/H+ + 作作為為pH pH 的緩沖系統，的緩沖系統， 而培養基中而培養基中NaHCONaHCO3 3 的含量將決定細胞培養時應使用的的含量將決定細胞培養時應使用的COCO2 2 濃度濃度 當培養基中當培養基中NaHCONaHCO3 3 含量為每公升含量為每公升3.7 g 3.7 g 時，細胞培養時應使用時，細

12、胞培養時應使用10 % CO10 % CO2 2；當培；當培養基中養基中NaHCONaHCO3 3 為每公升為每公升1.5 g 1.5 g 時，時， 則則應使用應使用5 % CO5 % CO2 2 培養細胞培養細胞 懸浮性細胞應如何繼代處理？懸浮性細胞應如何繼代處理？ 一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多時，可將培養角瓶口端稍微抬高，太多時，可將培養角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶，含細胞之培養液至另一新的培養角瓶， 加入新鮮