1、葉綠素含量的測定一、原理根據葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據朗伯比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質濃度C和液層厚度L成正比，即A=aCL式中：a比例常數。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，a為該物質的吸光系數。各種有色物質溶液在不同波長下的吸光系數可通過測定已知濃度的純物質在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數種吸光物質，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應波長下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取

2、液在三個特定波長下的吸光度A,并根據葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區的最大吸收峰。已知葉綠素a、葉綠素b的80%丙酮溶液在紅外區的最大吸收峰分別位于663、645nm處。已知在波長663nm下葉名素a、葉名素b在該溶液中的吸光系數的分別為82.04和9.27;在波長645nm處的吸光系數分別為16.75和45.60。根據加和性原則列出以下關系式：A663=82.04Ca+9.27Cb(1)A645=16.76Ca+45.60Cb(2)式(1)(2)A663nm和A645nm為葉綠素溶液在

3、663nm和645nm處的吸光度，CaCb分別為葉綠素a、葉2素b的濃度，以mg/L為單位。解方程(1)(2)組得Ca=12.72A6632.59A645(3)Cb=22.88A6454.67A663(4)將Ca+Cb相加即得葉綠素總量CtCt=Ca十Cb=20.29A6458.05A663(5)從公式(3)、(4)、(5)可以看出，就可計算出提取液中的葉綠素a、b濃度另外，由于葉綠素a葉綠素b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的吸光系數(均為30.5),也可以在此波長下測定一次吸光度(A652)而求出葉綠素a、葉綠素b總量Ct=A6521000(6)所測定材料的單位面積或單位重量的葉綠素含

4、量可按下式進行計算:34.5有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時測出溶液中類胡蘿卜素的含量。Licht-enthaler等對Arnon進行了修正，提出了80%丙酮提取液中3種色素含量的計算公式:Ca=12.21A6632.59A646Cb=20.13A6465.03A663(8)1000A470-3.27Ca-104ChCx.c=470ab229(9)式中：CaCb分別為葉綠素a、葉名素b的濃度;Cx.c為類胡蘿卜素的總濃度;A663A646A470分別為葉綠素提取液在波長663nm646nm470nm下的吸光度。由于葉綠素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時，計算

5、公式也有所不同。綠素a、葉綠素b在95%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665nm和649nm,類胡蘿卜素為470nm，可據此列出以下關系式；Ca=13.95A6656.8A649（10）Cb=24.96A6497.32A665(11)Cx.c=1000A470-2.05Ca-114.8Cb248(12)二、材料、儀器設備及試劑（一）材料新鮮（或烘干）的植物葉片。（二）儀器設備1.分光光度計；2.電子頂載天平（感量0.01g）;3.研缽；4.棕色容量瓶；5.小漏斗；6.定量濾紙；7.吸水紙；8.擦境紙；9.滴管。（三）試劑1.96%乙醇（或80%丙酮）。2 .石英砂。3 .碳酸鈣粉。三、實驗步驟1

6、 .取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。2 .稱取剪碎的新鮮樣品0.2g,共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及23m195%乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml,繼續研磨至組織變白。靜置35min。3 .取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。4 .用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25ml,搖勻。5 .把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內。以95%乙醇為空白

7、，在波長665nm、649nm下測定吸光度。四、實驗結果計算與分析按公式（10）、（11）、（12）（如用80%丙酮，按公式7、8、9）分別計算綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的濃度（mg/L）。（10）、（11）式相加即得葉綠素總濃度。求得色素的濃度后再按下式計算組織中個色素的含量（mg/L鮮質量或干質量表示）：葉綠素含量（mg/g）=CVNW1000式中：C為色素含量（mg/L）;V為提取液體積（mL）;N為稀釋倍數；W為樣品鮮質量或干質量（g）;1000即1L=1000ml。注意事項（1）為了避免葉綠素光解，操作時應在弱光下進行，淹沒時間應盡量短些。（2）葉綠體色素提取液不能渾濁?？稍?10nm或750nm下測量吸光度，其值應小于當波長為葉綠素a吸收峰時吸光之哦的5%,否則應重新過濾。（3）用分光光度計法測定葉綠素含量，對分光光度計的波長精確度要求較高。如果波長與原吸收峰波長相差1nm,則葉綠素a的測定誤差為2%,葉綠素b為19%,使用前必須對分光光度計的波長進行校正。校正方法除按儀器說明書外，還應以純白葉