1、ABOB型正、反定型操作規(guī)程 目的 保證ABOto型鑒定準確，確保臨床輸血安全。 適用范圍 XXX 醫(yī)院輸血科 職責 具有專業(yè)技術(shù)的工作人員主要負責本院輸血（或備血）標本的ABCa型鑒定（但只對該單份標本負責） 。 相關(guān)文件 試劑采購、保存和使用管理程序 設(shè)備采購、使用管理程序 消毒與清潔管理程序 標本采集、運輸、保存和報廢管理程序 緊急用血管理程序 相關(guān)記錄 儀器設(shè)備的采購、使用和維護記錄 儀器的溫度記錄 恒溫水溫箱的換水和消毒記錄 消毒液的配置記錄 清潔消毒記錄 試劑采購、使用記錄 標本交接和報廢記錄 緊急用血記錄 實驗原理 ABO1型是根據(jù)紅細胞表面存在的凝集原決定的。存在 A凝集原的稱

2、為A型，存 在 B 凝集原的稱為 B 型。而血清中還存在凝集素。當A 凝集原與抗A 凝集素相遇或 B凝集原與抗B凝集素相遇時，會發(fā)生紅細胞凝集反應(yīng)。一般A型血清中含有抗B凝集 素，B型血清中含有抗A凝集素，因此可以用標準血清中的凝集素與被測者的紅細胞 反應(yīng)（稱為正定型） ，用標準紅細胞與被測者血清中的凝集素反應(yīng)（稱為反定型） ，以 確定其ABO1J1型。 儀器器械 玻璃試管、玻片、記號筆、一次性塑料滴管、顯微鏡、普通離心機、試管架、恒溫水溫箱、試劑保存冰箱、標本保存冰箱。 試劑 抗A標準血清、抗B標準血清、A型標準紅細胞、B型標準紅細胞、。型標準紅 細胞、生理鹽水。以上試劑均為有合格證件的正品

3、。 標本收集與處理1 .受檢者血清：采集受檢者靜脈血 23ml,經(jīng)1000r/min離心1分鐘或室溫靜 置 1 小時后取上清。2 25%的受檢者紅細胞：采集受檢者靜脈血或末梢血，用生理鹽水制成25紅細胞鹽水懸液備用，制備方法見本節(jié)質(zhì)量控制和注意事項。3標本出現(xiàn)中度以上溶血者，為不合格標本，不能用于檢測。 實驗方法與步驟 1 .ABO血型的正定型（試管法）：、取2支試管，分別標上抗A和抗B;、制備待測標本25%勺紅細胞懸液（取1支試管，加入2ml生理鹽水，再加 入1滴待測標本紅細胞，混勻備用）；、在抗A管中加入2滴抗A標準血清，在抗B管中加入2滴抗B標準血清；、在抗A和抗B管中分別加入1滴已制備

4、好的待測標本25%：細胞懸液；、混勻后，立即對稱放入離心機中進行1000r/min離心1分鐘，或室溫靜置1 小時，再輕輕搖動試管，使沉于管底的紅細胞浮起，先肉眼觀察有無凝集現(xiàn)象，如內(nèi) 眼不見凝集，應(yīng)將反應(yīng)物倒于玻片上，再以低倍鏡檢查。根據(jù)有無凝集現(xiàn)象判定結(jié)果如下。注意凝集強 度，此有助于A、B亞型、類B或cisAB的發(fā)現(xiàn)。國工9 1 A3G in空/定示苴用ABOJ1 型抗A標準血清抗B標準血清A型十一B型一十。型一一AB型十十凝集強度判斷標準4十紅細胞凝集成一大塊，血清清晰透明。3十紅細胞凝集成數(shù)小塊，血清尚清晰。2十紅細胞凝塊分散成許多小塊，見到游離紅細胞1十肉眼可見大顆粒，周圍有較多游離

5、紅細胞。士鏡下可見數(shù)個紅細胞凝集在一起，周圍有很多游離紅細胞。MF 混合凝集外觀（mixed field）是指鏡下可見少數(shù)紅細胞凝集，而極大多數(shù)紅細 胞仍呈分散分布。一 表示陰性，鏡下未見凝集，紅細胞均勻分布。2 .ABO血型的反定型（試管法）：3 、取3支試管，分別標上A B和O;4 、在3支試管中分別加入2滴待測標本的血清；5 、將ABOB準紅細胞輕輕地充分混勻后， 在A管中加入1滴A型標準紅細胞，在B管中加入1滴B型標準紅細胞，在。管中加入1滴。型標準紅細胞；、混勻后，對稱放入離心機中進行 1000r/min離心1分鐘（或3400 r/min離 心15秒）；、取出后，先觀察是否溶血（溶血

6、可能是陽性結(jié)果，或者是細菌污染），再輕輕搖動試管，肉眼觀察有無凝集現(xiàn)象，肉眼不易分辨的用顯微鏡觀察；根據(jù)有無凝集現(xiàn)象判定結(jié)果如下。注意凝集強度，此有助于A、B亞型、類B或cisAB的發(fā)現(xiàn)。ABO& 型A型標準紅細胞B型標準紅細胞O型標準紅細胞A型一十一B型十一一。型十十一AB型一一一凝集強度判斷標準（同ABO&型的試管法正定型）質(zhì)量控制和注意事項1、分型標準血清試劑必須為三證齊全的合格產(chǎn)品，質(zhì)量性能符合要求，且在有 效期內(nèi)使用。試劑開封后必須貼上注有開封日期和開封人的標簽，使用后應(yīng)及時置于28c專用冰箱中保存，以免細菌污染和變質(zhì)而影響試驗結(jié)果。試劑開封后有效期為 一周。2、商用分型標準紅細胞試

7、劑必須為三證齊全的合格產(chǎn)品，質(zhì)量性能符合要求， 且在有效期內(nèi)使用；自制分型標準紅細胞試劑必須以3個健康者同型新鮮紅細胞混和， 用生理鹽水洗滌13次，以除卻存在于血清中的抗體及可溶性抗原，再制成25%勺紅細胞懸液備用。試劑開封或制備后必須貼上注有開封或制備日期和開封人或制備人 的標簽，使用后應(yīng)及時置于28c專用冰箱中保存，以免細菌污染和變質(zhì)而影響試驗 結(jié)果。試劑開封或制備后有效期為一周。3、生理鹽水啟用后，有效期為二周。4、所有試劑在使用時，必須檢查是否有渾濁、變色、凝集等變質(zhì)現(xiàn)象；凡可疑 者，必須更換新的試劑進行檢測。若分型標準血清使用時間較長后，最好用已知的ABO 標準紅細胞檢查結(jié)果是否與已

8、知的血型相符；若分型標準紅細胞使用時間較長后， 最好用已知的分型標準血清檢查結(jié)果是否與已知的血型相符，以防標準血清或紅細胞制品污染、變質(zhì)失效而造成鑒定錯誤。5、試管、滴管和玻片必須清潔干燥，防止溶血。6、操作方法應(yīng)按規(guī)定進行，一般應(yīng)先加血清，后加紅細胞懸液，以便容易核實 是否漏加血清。7、IgM抗-A和抗-B與相應(yīng)紅細胞的反應(yīng)溫度以4c為最強，但為了防止冷凝集 現(xiàn)象的干擾，一般仍在室溫（2024C）內(nèi)進行試驗，37c可使反應(yīng)減弱。8、離心時間不宜過長或過短，速度不宜過快或過慢，以防假陽性或假陰性結(jié)果。 用試管法進行ABO血型的正定型時不能測出亞型（如 Ax）,需延長作用時間。9、在反定型試驗中

9、，如果受檢者的血清或血漿與 O型標準紅細胞產(chǎn)生陽性反應(yīng)， 則需要添加自身對照試驗。如果自身對照試驗為陽性，表明是自身冷凝集素導(dǎo)致。如 果自身對照試驗為陰性，則表明被檢者血清或血漿中可能存在 ABO8統(tǒng)以外其它系統(tǒng) 的抗體干擾，此時需做其它相關(guān)試驗加以解決上述定型問題。10、對含有較多自身冷凝集素的受檢者， 在使用標準血清進行正定型時往往被誤 定為AB型，遇到此種情況，需用37c生理鹽水洗滌受檢者的紅細胞 23次，以去除 吸附在紅細胞上的冷凝集素，然后再鑒定血型。11、觀察時應(yīng)注意紅細胞呈特異性凝集、繼發(fā)性凝固以及緡錢狀排列的區(qū)別。對 于可疑結(jié)果，必須更換所用的試劑，重新檢測。12、對于可能存在

10、不完全抗原的時候，應(yīng)在各反應(yīng)中加入凝聚胺試劑，以檢驗不 完全抗原的存在。13、判斷結(jié)果后應(yīng)仔細核對、記錄，避免筆誤。14、25%1細胞懸液的配制：先用生理鹽水洗滌紅細胞 3次，再根據(jù)下表進行紅 細胞懸液的配制。懸液濃度（壓積紅細胞（滴）鹽水（滴）2140(2ml)5116 (0.8ml)臨床應(yīng)用用于檢驗人的ABO血型歸屬 血型鑒定的影響因素及解決方法 準確的血型鑒定是臨床安全、 有效輸血的重要保證之一， 但影響血型鑒定結(jié)果的因素很多。如發(fā)現(xiàn)ABOE反定型結(jié)果不一致，應(yīng)先重復(fù)做1次試驗。重復(fù)做試驗時，應(yīng)嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，使用質(zhì)量合格的試劑，并細心觀察和解釋試驗結(jié)果，就可解決 明顯的問題。對一些疑

11、難問題必須做如下進一步研究：1 、標本血標本的采集錯誤、稀釋和溶血。另從受檢者采集l份新鮮血液標本，這樣可以糾正因污染或搞錯樣本造成的不合。 標本一般要求離體后盡快實驗， 最長不能超過 3天，每次輸血后受血者和供血者的血標本應(yīng)在28c保存7天。患者的藥物使用有時也對實驗有一定影響，當受血者使用肝素治療時，應(yīng)使用硫酸魚精蛋白對抗使標本凝集；如果受血者使用右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等治療，應(yīng)注意將紅細胞洗滌。受檢者紅細胞上抗原位點過少（ 如亞型 ） 或抗原性減弱 （ 見于白血病或惡性腫瘤），以及類B或cisAB等。如疑為A抗原或B抗原減弱，則可將受檢紅細胞與抗 -A或抗一B血清做吸收及放散

12、試驗，以及用受檢者唾液作 A B、H血型物質(zhì)測定（只 對80% HA明泌型的人有用）。如受檢者為A型血而疑為有類B抗原時，可用下列 方法進行鑒別：（1）觀察細胞與抗一A及抗一B的凝集強度，與抗一A的反應(yīng)要比與抗 B 的反應(yīng)強，這種區(qū)別用玻片法作試驗更為明顯； （2） 用受檢者紅細胞與自身血清作試驗， 血清中的或 B 不凝集自身紅細胞上的類B 或原； （3） 檢查唾液中是否有A、B物質(zhì)，如果是分泌型，可檢出 A物質(zhì)而無B物質(zhì)；（4）核對患者的診斷，類B抗原 的形成與結(jié)腸癌、直腸癌、革蘭陰性桿菌感染有關(guān)。受檢者血清中蛋白紊亂 （ 高球蛋白血癥） ， 或?qū)嶒灂r溫度過高， 常引起紅胞呈緡錢狀排列。如試

13、驗結(jié)果紅細胞呈緡錢狀排列，加等滲鹽水l 滴。混和，往往可使緡錢現(xiàn)象消失。 注意不應(yīng)先加鹽水l 滴于受檢者血清中而后和紅細胞做試驗， 以免使血清中或體被稀釋。細菌污染或遺傳因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。 如發(fā)現(xiàn)多凝集現(xiàn)象，應(yīng)考慮由遺傳產(chǎn)生的Cad抗原活性；被細菌酶激活的T或TK受體；或產(chǎn)生機制不太明了的 Tn 受體所引起。 多凝集紅細胞具有以下特點： （1） 能被人和許多 家兔的血清凝集； （2） 能與大多數(shù)成年人的血清凝集，不管有無相應(yīng)的同種或體。 （3） 不被臍帶血清凝集。 （4） 通常不與自身的血清凝集。 （5） 如有條件可用外源凝集素加以 鑒別。檢者血清中缺乏應(yīng)有的或-

14、A 及或或 B 或體， 如丙種球蛋白缺乏癥， 老年人血清中或體水平大幅度下降等。 如果試驗結(jié)果未見凝集， 應(yīng)將細胞及血清試驗至少在室 溫和4 c放置30min,用顯微鏡檢查核實。血清中有意外抗體，如自身抗一I,常引起干擾。用A1、A2、B、。紅細胞及自 身紅細胞檢查受檢者血清。如果懷疑是抗一I ,用。型（或ABCffi合的）臍血紅細胞檢 查。各種原因引起的紅細胞溶解，誤判為不凝集。部分溶血時，可溶性血型物質(zhì)中和了相應(yīng)的或體。 將紅細胞洗滌數(shù)次， 配成 25%生理鹽水細胞懸液，用或A、 或B、抗一Al,抗一A十B及抗H做試驗可以得到其它有用的信息。對受檢紅細胞作直接抗 球蛋白試驗，如結(jié)果呈陽性，

15、表示紅細胞已被或體致敏。2、試劑運輸、貯存等條件不適可導(dǎo)致試劑變質(zhì)失效，造成配血錯誤。實驗前進行試劑 外觀、效價等項目質(zhì)量控制。不同抗凝劑制備的標準紅細胞質(zhì)量也不同；另外，紅 細胞懸液過濃或過淡，抗原抗體比例不適當，使反應(yīng)不明顯，易誤判為陰性反應(yīng)。應(yīng)依據(jù)要求正確配制紅細胞濃度。分型血清效價太低、親和力不強，如抗一A血清效價不高，可將A亞型誤定為。型、AB型誤定為B型。實驗前應(yīng)進行試劑效價等項目質(zhì) 量控制。3 、冷凝集素在ABO&型鑒定和交叉配血的過程中，冷凝集素是影響 ABO&型正反不符和交叉 配血不合的常見原因，尤其是在冬天氣溫較低時，某些病人血清中含有冷凝集素而導(dǎo) 致出現(xiàn)假陽性。正常人血清

16、中冷凝集素效價一般不高，且在4c以下時才有活性。但由于人免疫系統(tǒng)的差異，在惡性月中瘤或病原體感染后有時冷反應(yīng)性自身抗體可異常增 高，造成溶血性貧血。這種冷凝集素效價在4c可高于1000,用37c生理鹽水洗滌紅 細胞，操作時再置于37c水浴中輕輕搖動可以排除冷凝集素的干擾。4 、自身免疫性溶血性貧血紅細胞被自身抗體強烈致敏后將干擾 ABOt型，且自身抗體的存在會導(dǎo)致交叉配 血不合，選擇合適的試驗方法對紅細胞上結(jié)合的抗體做放散處理，確定抗體的特異性。如果抗體屬于同種抗體，則交叉配血時應(yīng)選取該抗原陰性的獻血者的血液。如果該抗 體無法確定特異性，則交叉配血時要根據(jù)患者自身紅細胞與自身血清的對照反應(yīng)選取

17、 較弱反應(yīng)的獻血者血液，因為自身抗體的干擾而發(fā)生ABO正反定型不相符時，可用37 c45 c生理鹽水洗滌紅細胞三次，或者用放散后的紅細胞（放散方法需不破壞紅 細胞結(jié)構(gòu)），血清定型則可用洗滌或放散后的紅細胞將血清中的自身抗體吸收后再進 行。5 、弱凝集血型試驗是抗原抗體反應(yīng)，當患者紅細胞上抗原異常或血清中存在 ABOW型以外 的不規(guī)則抗體時，可能會導(dǎo)致減弱的或缺少的凝集反應(yīng)。抗原異常包括：亞型，這 種亞型紅細胞抗原性較弱，可以通過亞型定型試劑來具體定型。 紅細胞抗原形成不 足或敏感性降低，如新生兒、老年人及少數(shù)惡病質(zhì)患者。鑒定血型時要注意正反定型 的結(jié)合，加用抗H和抗A, B型標準血清、A2紅細

18、胞等檢查唾液中的血型物質(zhì)，必要 時作吸收放散試驗以確定。若血清中存在不規(guī)則抗體可在反定型用O細胞加以鑒定，有些亞型因為抗原的某些位點缺失， 也會產(chǎn)生相對于缺失抗原位點的抗體， 這些抗體 的產(chǎn)生有助于亞型的判定。6 、細菌性凝集常見有類B凝集，A型或。型病人因大腸桿菌O86感染，從而使紅細胞上獲得類 B抗原，能與抗B抗體發(fā)生凝集，表現(xiàn)為B或AB型。其不受溫度影響，病情好轉(zhuǎn)類B 凝集即消失。另外紅細胞被細菌或細菌酶污染，紅細胞上的 T抗原被激活，與供血者 中抗T抗體發(fā)生凝集。此種凝集在4c和37c之間隨著溫度的升高凝集程度逐漸減弱， 在37c時最弱或消失。7 、混合外觀凝集現(xiàn)象出現(xiàn)混合外觀凝集的情況時一般要核對標本，必要時可重新抽取血樣。患者在近 期有過骨髓移植或輸血史、胎盤出血和白血病等應(yīng)在疾病恢復(fù)后再確定血型。 其他原 因如嵌合現(xiàn)象、A3亞型及Tn多凝集反應(yīng)等在定型時可幫助正確判斷血型。8 、不規(guī)則抗體及亞型血型試驗是抗原抗體反應(yīng)，當患者血清中存在ABOS以外的IgM或IgG和IgM混 合型不規(guī)則抗體時，必然會導(dǎo)致ABOE反定型不一致。可通過測定唾液中的血型物質(zhì) 來鑒定ABOto型。由于受檢者紅細胞上有弱抗原，且抗原表