1、轉鐵蛋白修飾的喜樹堿-樹技狀高分子復合物的藥動學研究 基金項目：國家自然科學基金（30672543），上海市科委基礎重點項目（10JC1402202）唐國濤1,2 作者簡介：唐國濤，男，博士，講師，研究方向：靶向給藥系統的研究，藥物制劑制備工藝及質量標準的研究。Tel: E-mail: * 通訊作者：姜嫣嫣，女，博士，副教授，主要研究方向：腫瘤靶向傳釋系統的應用基礎研究和藥物新劑型和新技術應用開發研究。Tel: Email: ，朱賽杰1，洪鳴凰1，姜嫣嫣1*，裴元英1（1復旦大學藥學院藥劑學教研室，智能化遞藥教育部和全軍重點實驗室，上海，201203；2南華大學藥學與生命科學學院藥學系，湖南衡

2、陽，421001）摘要：目的探討轉鐵蛋白修飾的主動靶向納米載藥復合物在大鼠體內的藥動學行為。方法堿水解后采用HPLC法測定大鼠尾靜脈給藥后血漿中的藥物濃度。結果經轉鐵蛋白修飾的主動靶向復合物能顯著提高喜樹堿在大鼠體內的半衰期及平均滯留時間，比未經轉鐵蛋白修飾的載藥復合物的半衰期的平均滯留時間短。結論轉鐵蛋白-聚乙二醇-聚酰胺-胺樹枝狀分子-喜樹堿復合物具有顯著的長循環效果。關鍵詞：聚酰胺-胺樹枝狀聚合物；轉鐵蛋白；聚乙二醇；喜樹堿；藥動學中圖分類號：R969.1，R285.6文獻標識碼：A文章編號：Study on tumor active targeting with Transferrin

3、-PEG-PAMAM dendrimer-CPT conjugateTang Guotao1, Zhu Saijie2, Hong Minghuang2, Jiang Yanyan2*, Pei Yuanying2（1 Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Fudan Univeristy, Shanghai, 201203; 2Department of Pharmacy, School of pharmacy and Life Science, Nanhua Univeristy, Hengyang, Hunan, 421001）

4、Abstract: Objective To explore the pharmacokinetics characteristic of transferrin modified PEGylated polyamidoamine dendrimers (PEG-PAMAM) as the carrier for tumor targeting of the anticancer drug camptothecin(CPT) in rats. Method CPT solution and PEG-PAMAM-CPT as control, transferrin modified PEG-P

5、AMAM-CPT was injected via the tail vein. The plasma concentration of CPT in rats was determined by HPLC following alkaline hydrolysis. Results Transferrin modified PAMAM-PEG-CPT could enhance half-life and mean residence time comparing with that of CPT solution, but were relative shorter than that o

6、f CPT-PAMAM-PEG. Conclusion Transferrin modified PAMAM-PEG-CPT had a better long-circulating effect in rats.Keywords: Poly(amidoamine) Dendrimer; Transferrin; Poly(ethylene glycol); Camptothecin; Pharmacokinetics喜樹堿（camptothecin, CPT）是上世紀60年代從中國喜樹中提取的同類抗腫瘤單體中抗癌作用最強的微量生物堿1，系統的藥理研究表明其抗癌機理為抑制DNA拓撲異構酶（T

7、opo）2。半衰期短（30 min左右）；脂、水溶性不好；E環內酯環對光、pH敏感，開環后喪失藥理活性，毒副作用大，這些缺點限制了其臨床應用。為提高喜樹堿的溶解度和內酯環穩定性、延長血中循環時間以及降低毒副作用，本實驗制備了以聚酰胺-胺樹枝狀聚合物（Polyamidoamine dendrimer，PAMAM）為載體，轉鐵蛋白（Transferrin，Tf）為靶向頭基的主動靶向給藥系統。將CPT共價連接在材料上，可提高藥物的溶解性，且CPT結構中20S位經酯鍵連接后可提高藥物穩定性，材料經聚乙二醇修飾后可提高藥物在體內的半衰期，以Tf修飾后可提高藥物在腫瘤部位的濃度。本文以CPT溶液及未經靶向

8、頭基修飾的復合物為參比，考察尾靜脈注射后大鼠體內的藥動學過程，為腫瘤主動靶向給藥系統的研究提供研究基礎。1材料與方法1.1主要儀器島津LC-10AT高效液相色譜儀，SPD-10A檢測器（日本島津），HSG2000色譜數據工作站（杭州英譜），Zetasizer Nano ZS納米粒度儀（英國馬爾文），冷凍干燥機（Christ Alpha 2-4，GermanyXW-80A），蝸旋混合器（上海醫大儀器廠），TGL-16C飛鴿牌離心機（上海安亭科學儀器廠）。1.2主要試劑第4代PAMAM（Mr =14215，美國Dendritech），NHS-PEG-MAL （Mr = 3500，北京鍵凱），喜樹堿

9、（上海駿杰），肝素鈉粉末（上海冠亞科技發展有限公司），色譜級甲醇和乙腈（美國Tedia），其他試劑均為分析純。1.3實驗動物Sprague-Dawley雄性大鼠，體重（200±20）g（上海斯萊克實驗動物有限責任公司），昆明種雄性小鼠，體重（20±2）g（上海實驗動物中心）。1.4 復合物的制備CPT-PAMAM-PEG-Tf的結構見Fig 1，首先將PEG活化的羧基端與PAMAM表面的氨基共價連接，制備了3種不同PEG化程度的PAMAM-PEG復合物，按照PEG與PMAM的投料比分別稱為PP16，PP32和PP48，以丁二酸酐為連接劑，將CPT與PAMAM表面剩余的氨基連

10、接，得到載CPT的PAMAM-PEG復合物，分別稱為CPP16，CPP32和CPP48；最后將巰基化的Tf與PEG外端的馬來酰亞胺共價連接，分離后得到具主動靶向頭基的載藥復合物，分別稱為CPP16T，CPP32T和CPP48T。圖1CPT-PAMAM-PEG-Tf的結構Fig. 1Structure of CPT-PAMAM-PEG-Tf1.5喜樹堿復合物的藥動學研究1.5.1色譜條件色譜柱：Thermo Scientific ODS-2 Hypersil 150×4.6，流動相：甲醇水 5050，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：室溫，檢測波長：365 nm，進樣量：

11、20L。1.5.2血漿樣品處理方法測定血漿樣品中游離CPT的處理方法：大鼠血漿100L，加0.1moL·min-1 HCl 100L，混勻，加甲醇200L，漩渦1 min, 12000 rpm離心10 min，取上清液20L HPLC測定。測定血漿樣品中總CPT的處理方法：取大鼠血漿100 L，加0.2 moL·L-1 NaOH 50 L，混勻，室溫放置1 h，加0.5 moL·L-1 HCl 50 L，加甲醇200 L，漩渦1 min，12000 rpm離心10 min，取上清液20L HPLC測定。1.5.3標準曲線的建立CPT儲備液：精密稱取CPT 20mg

12、用DMSO定容至25 mL，得濃度為800g·mL-1的CPT溶液，于冰箱4保存。標準曲線：精密量取CPT儲備液，用DMSO稀釋得1、4、20、100、400、600 g·mL-1的標準溶液。取空白血漿90L，分別準確加入上述標準溶液10L，使血漿濃度分別為0.1、0.4、2、10、40、60g·mL-1，每個濃度配制5份，按方法操作進行血漿處理后進樣。以CPT峰面積（A）對相應濃度（C）線性回歸，得標準曲線方程。1.5.4供試樣品的配制CPT溶液3,4：稱取CPT粉末適量，溶于50 mL DMSO，PEG400，乙醇和pH3.5磷酸緩沖液的混合溶劑（比例為202

13、03030）。各復合物溶液：取各復合物適量，溶解于5 mL去離子水中，按照測定復合物中CPT含量的方法測定CPT的量，調整溶液的濃度，使與CPT溶液的濃度一致。1.5.5血藥濃度分析方法的評價（1）絕對回收率取空白大鼠血漿90 L，分別加入CPT標準液、各種復合物溶液各10 L，配制高、中、低3個濃度水平的血漿樣品（0.4、10、60 g·mL-1），每一濃度配制3份樣品。按血漿樣品處理方法進行處理后進樣，分別與同濃度的CPT標準溶液直接進樣的峰面積作比較，計算絕對回收率。（2）相對回收率取空白大鼠血漿90L，分別加入CPT標準液、各種復合物溶液各10L，配制高、中、低3個濃度水平的

14、血漿樣品（0.4、10、60 g·mL-1），每一濃度配制3份樣品。按血漿樣品處理方法進行處理后進樣，測定峰面積A，代入標準曲線得濃度C，按下式計算相對回收率：相對回收率測得量/理論量×100（3）檢測限以信噪比S/N=3測得最低檢測限為16 ng·mL-1。（4）精密度考察取空白大鼠血漿90L，分別加入CPT標準液、各種復合物溶液各10L，配制高、中、低3個濃度水平的血漿樣品（0.4、10、60g·mL-1），每一濃度配制3份樣品。按血漿樣品處理方法操作，進行HPLC分析。一天內重復操作5次，統計測定數據的平均值和標準差，計算相對標準偏差（RSD），即

15、為日內精密度（inter-day precision）。以同樣的方法連續5 d操作測定高、中、低3個濃度（n=3），統計測定數據的相對標準偏差（RSD），即為日間精密度（intra-day precision）。1.5.6給藥方案與血樣采集 取于溫度25±2，相對濕度75±5和自然光條件下，飼養1周的SD雄性大鼠（200±20）g 35只，隨機分成7組，每組5只。分別尾靜脈注射，劑量為1 mg·kg-1（以CPT量計）。第1組：CPT溶液；第2、3、4組：CPP16，CPP32和CPP48復合物；第5、6、7組：CPP16T，CPP32T，CPP48T復

16、合物；靜脈給藥后，分別于5、15、30min、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、48、72 h，眼眶取血0.5 mL，置肝素鈉抗凝的離心管中，8000 r/min離心5 min后取血漿于-20保存。處理后經HPLC測定血藥濃度。采用3P97軟件計算藥動學參數，用excel對每個時間點血藥濃度進行方差分析，并進行比較。2結果2.1血藥濃度測定方法的確定方法專屬性空白血漿、空白血漿加一定濃度CPT溶液和給藥后血漿樣品按方法項下所述步驟處理后，總CPT含量測定HPLC色譜圖見圖2。結果表明，CPT的保留時間約為5 min。在上述色譜條件下分析，空白血漿對CPT測定無干擾。ACB圖2鼠

17、血漿中總CPT 含量HPLC色譜分析（A：空白血漿，B：空白血漿加一定濃度CPT溶液，C：給藥后血漿樣品）Fig 2Chromatograms of CPT in rat plasma. A: blank plasma sample; B: blank plasma spiked with CPT; C: plasma sample標準曲線和線性范圍以CPT的峰面積A對其濃度C（g·mL-1）進行線性回歸，得方程式如下：A15939C-816.42，（r20.9999, n=5），線性范圍0.160g·mL-1。2.2血藥濃度分析方法的評價絕對回收率與相對回收率復合物血漿樣

18、品測定方法的絕對回收率測定結果見表1。結果表明：在線性范圍內所用方法的絕對回收率為80.23%86.34%。相對回收率為95.58%103.76%。表1 鼠血漿中CPT測定的準確性評價Table 1 Accuracy of the determination of CPT in rat plasma（n=3）復合物絕對回收率相對回收率低0.4g·mL-1中10g·mL-1高60g·mL-1低中高CPT80.23±2.3583.65±2.1686.34±1.67103.76±4.1599.14±2.1796.57&#

19、177;2.59CPP3280.63±4.3184.50±1.5084.98±0.72102.61±4.8197.07±1.7197.95±0.71CPP32T81.34±1.8383.40±0.7284.91±3.45103.48±2.0395.82±0.8297.87±3.37精密度精密度實驗結果見表2。實驗數據表明，CPT體內測定方法的日內和日間精密度良好，RSD均小于6.5，符合生物樣品分析要求。表2鼠血漿CPT測定精密度評價Table 2Precision for

20、CPT assay in rat plasma（n=5）復合物日內精密度（%）日間精密度（%）低中高低中高CPT3.582.873.044.562.673.42CPP325.351.783.086.063.613.68CPP32T2.240.853.456.152.312.83喜樹堿分子中的內酯環在血液中存在開環和閉環的平衡，非共價連接的納米給藥系統5在測定喜樹堿血藥濃度的時候可以同時測定血漿中內酯環開環和閉環的藥物量。樣品用3倍體積的乙腈沉淀蛋白后，加pH6.0的磷酸緩沖鹽調整樣品至流動相比例，同時測定樣品中開環和閉環的CPT。本研究由于喜樹堿與材料共價連接，在血漿中部分藥物與材料仍然共價連

21、接，參考文獻方法3將喜樹堿從材料上水解下來，再酸化來測定血漿中總的喜樹堿濃度。同時不水解復合物直接酸化樣品測定血漿中游離喜樹堿的濃度。2.3 大鼠體內藥動學參數大鼠尾靜脈注射CPT溶液，CPP16，CPP32，CPP48，CPP16T，CPP32T和CPP48T復合物后，平均血藥濃度-時間曲線見圖3，原料藥在體內很快被清除，半小時以后血藥濃度低于檢測限，復合物除了CPP16以外，其余的在48h都能檢測到。4 h以后，復合物的血藥濃度下降趨勢隨PEG化程度的升高而減緩。將原料藥與各復合物在大鼠血漿中的濃度數據按3P97軟件的統計矩分析，結果見表3。CPP16，CPP32和CPP48的血漿半衰期分

22、別為CPT溶液的29.4，44.7和48.4倍；MRT分別為CPT的33.6、40.6和49.4倍；AUC0分別為CPT溶液的451.5、563.5和1014.0倍，表明隨著PEG化程度的提高，藥物在血漿中的滯留時間明顯延長，藥物清除減慢，從而導致AUC提高。 圖3 注射CPT，CPP，CPPT各種復合物，大鼠體內平均血藥濃度-時間曲線（n=6）Fig. 3 Mean plasma concentration-time curves of CPT in normal rats dosed with CPT solution, CPP and CPPT to rats (µg·

23、;mL-1) n=6表3 大鼠體內原料藥與各復合物藥動學參數Table 3 Pharmacokinetics parameters of HCPT injection, non-NS, PEG-NS and Tf-PEG-NS after intravenous administration to rats（±SD, n6）ParametersCPT solutionCPP16CPP32CPP48A （g·mL-1）28.56±3.629.80±1.1017.74±2.1512.66±4.85 （h-1）0.85±0.100

24、.23±0.010.16±0.010.17±0.01B （g·mL-1）1.84±0.273.56±0.395.77±0.4412.86±0.061 （h-1）2.1±0.050.077±0.0040.053±0.0040.051±0.001T1/20.33±0.039.69±0.2414.75±0.5615.96±1.36Vc （L）0.02±0.0020.056±0.0260.043±0.0030.04

25、0±0.007AUC0 （h·g·mL-1）0.26±0.01117.41±3.92146.53±3.04263.63±9.87MRT （h）0.38±0.0812.78±0.1315.44±0.7918.78±0.34CPP16TCPP32TCPP48TA （g·mL-1）9.25±0.2218.78±0.7712.86±2.44 （h-1）0.27±0.030.16±0.0010.15±0.001B （g

26、3;mL-1）15.14±5.556.21±0.597.98±0.17 （h-1）0.091±0.010.053±0.0010.051±0.001T1/27.94±0.63*13.13±0.36*13.78±0.31*Vc （L）0.043±0.0080.040±0.0010.045±0.005AUC0 （h.g·mL-1）105.38±4.27133.34±9.73199.47±6.30MRT （h）12.15±0.4713

27、.62±0.3216.35±0.77*P<0.05（與未經Tf修飾的復合物相比）經Tf修飾后的CPP16T，CPP32T和CPP48T在血漿中半衰期同樣比CPT溶液有明顯延長，分別為CPT溶液的24.1，39.8和41.8倍。但比對應的CPP16，CPP32和CPP48要短，分別縮短為原來的81.94%，89.02%和86.29%。MRT分別為CPT的31.9、35.8和43.0倍；AUC0分別為CPT溶液的405.4、512.7和767.3倍。3討論樹枝狀大分子（Dendrimer）具有完美的多分散性和規整的三維結構。自有關樹枝狀大分子的報道以來，具有特殊功能和應用

28、價值的樹枝狀大分子逐漸引起人們的關注，聚酰胺-胺樹枝狀大分子（Polyamidoamine dendrimer，PAMAM）是目前研究最為廣泛的一類樹枝狀大分子材料，其具有穩定、無免疫原性、在使用劑量范圍內無毒性、對生物活性物質轉運效率高等優點，已成為藥物傳釋系統的研究熱點之一6。PAMAM納米微粒載藥系統用PEG進行表面修飾后，可降低網狀內皮系統對微粒的識別，延長半衰期，通過EPR效應濃集于腫瘤部位7,8。CPP復合物半衰期的延長是藥物共價連接在材料上延緩藥物釋放以及PEG修飾的復合物具有減少血漿蛋白吸附、降低補體消耗、躲避巨噬細胞吞噬能力的雙重作用所致。由于藥物復合物在體外的釋放速率一致，

29、所以復合物的消除半衰期隨PEG化程度的增加而延長主要受PAMAM表面PEG的影響。連接Tf后的復合物CPP16T，CPP32T和CPP48T在血漿中半衰期和平均滯留時間比相應的CPP16，CPP32和CPP48短（P<0.05），AUC也比相應的CPP小（P<0.05）。而對于Tf修飾的脂質體9，泡囊10等主動靶向載藥系統與未經Tf修飾的載藥系統相比，其藥動學參數并無顯著性差差異，其可能原因主要是因為脂質體，泡囊等的粒徑都在100 nm以上，Tf修飾后對其粒徑和表面性質并無大的影響，而CPP復合物的粒徑較小，經Tf修飾后其Zeta電位由正變負，對其在體內的分布有較大的影響：a）主動

30、靶向復合物中每個分子上平均連接有一個轉鐵蛋白分子，轉鐵蛋白分子量為80 KD，與未連接轉鐵蛋白的復合物分子量大致相當，從分子大小來看，連接上轉鐵蛋白使復合物粒徑增加了近一倍。粒徑增大（約7 nm左右），可能有利于體內單核巨噬細胞系統的攝取，在一定程度上使其消除稍有加快。b）從體內分布角度考慮：由于體內正常組織和器官也具有轉鐵蛋白受體，能與轉鐵蛋白相結合，從而導致一部分Tf修飾的復合物分布到了組織和器官中，使血漿中測得的藥物量有所減少。參考文獻1Li Q.Y, Zu Y.G., Shi R.Z, et al. Review Camptothecin: current perspectivesJ.

31、 Current Medicinal Chemistry, 2006, 13(17): 2021-2039.2Joseph F P, Leonard B S. The camptothecinJ. The Lancet, 2003, 361: 2235-2242.3Schluep T, Cheng J.J, Khim K. T, et al. Pharmacokenetics and biodistribution of the camptothecin-polymet conjugate IT-101 in rats and tumor-bearing miceJ. Cancer Chemo

32、theapy Pharmcology. 2006, 57: 654-662.4Lalloo A, Chao P.Y, Hu P, et al. Pharmacokinetic and pharmcodynamic evaluation of a novel in situ forming poly(ethylene glycol)-based hydrogel for the controlled delivery of the camptothecinJ. Journal of Controlled Release, 2006, 112: 333-342.5Dennis O.S, Dilbir S.B, Valentin