1、血管性癡呆大鼠海馬Ng及其磷酸化水平的動態變化陳文1, 王玉良1*，張立紅2(1.濰坊醫學院生理學教研室，濰坊 261042;2.濟南軍區總醫院脊髓修復科，濟南 250000)摘 要 目的：觀察血管性癡呆(VD)模型大鼠海馬神經顆粒素(Ng)及其磷酸化水平的動態變化，探討Ng在VD學習記憶功能障礙中的作用及其機制。方法：采用雙側頸總動脈夾閉再灌注同時腹腔注射硝普納建立血管性癡呆模型，在 15 d，1、2、4個月等時間點 ，采用Morris水迷宮和免疫熒光方法分別觀察大鼠空間學習記憶能力及海馬Ng及其磷酸化水平的變化。結果：模型組大鼠各時間點的逃逸潛伏期(EL)比假手術組均明顯延長(P0.01)

2、;海馬CA1區Ng 及其磷酸化Ng免疫陽性神經細胞數表達較假手術組明顯減少(P0.01, P0.05) ，而且隨造模手術后時間的延長，以上變化逐漸加重。齒狀回僅在2個月和4個月時間點的免疫陽性神經細胞數比假手術組顯著減少(P0.01, P0.05)。結論：模型組大鼠的空間學習記憶功能障礙可能與海馬(特別是CA1區)的Ng及其磷酸化Ng表達水平持續降低有關。關鍵詞 血管性癡呆;學習記憶;神經顆粒素;磷酸化;海馬;大鼠Dynamic changes of neurogranin and phosphorylated neurogranin expressionsin hippocampus of

3、vascular dementia ratsChen Wen1, Wang Yuliang1, Zhang Lihong2(1.Department of Physiology, Weifang Medical University, Weifang 261042;2.General Hospital of Jinan Military Region Spinal Cord Injury, Jinan 250000, China)Abstract Objective：To observe the dynamic changes of neurogranin (Ng) and its phosp

4、horylation in hippocampal formation and their roles in learning and memory disorders in vascular dementia (VD) rats. Methods：Eighty SD rats were randomly divided into VD model group (n=40) and sham-operated (SO) group (n=40). VD models were established by repeatedly clipping the bilateral common car

5、otid arteries of the rat in combination with an intraperitoneal injection of sodium nitroprusside solution in anesthetized SD rats. Morris water maze was used to detect the changes of spatial learning and memory ability, immunofluorescent technique was used to observe the expressions of Ng and phosp

6、horylated neurogranin (p-Ng) in hippocampal formation. Results: The escape latency (EL) of model group was obviously longer than that of the SO group at different time points after VD modeling operation (P0.01); Compared with SO groups, the numbers of Ng and p-Ng positive neurons in model groups wer

7、e noticeably decreased at all time points in CA1 region (P0.01, P0.05), but decreased at only 2 months and 4 months time points in dentate gyrus (DG) region (P0.01, P0.05). Conclusion: The results suggest that the long-lasting low expression of Ng and p-Ng in hippocampal formation (especially in CA1

8、 region) may be one mechanism of resulting in learning and memory dysfunction of VD rats.Key words vascular dementia; learning and memory; neurogranin; phosphorylation; hippocampus;rat神經顆粒素(Neurogranin, Ng)是一種新發現的腦特異性神經元突觸后蛋白，是蛋白激酶C的天然底物及鈣調素(calmodulin, CaM)儲存庫1。研究表明，CaM 依賴性蛋白酶大多參與長時程增強(long term po

9、tentiation, LTP)和長時程抑制的誘導，而Ng的基因表達和蛋白質合成與神經元的突觸形成、分化同步2，因此，Ng在學習記憶、神經系統發育(可塑性)等生理性變化中具有重要作用。目前，雖然有關Ng及其磷酸化水平在腦缺血再灌注損傷急性期的改變已有報道3.4 ，而且其結果并不完全一致，但在VD發病后較長時間的變化未見報道。故本實驗在VD模型大鼠，采用免疫熒光化學方法，觀察Ng及其磷酸化水平在VD發病中的動態變化，探討突觸后因素改變在VD大鼠學習記憶和突觸傳遞中的作用。材料和方法1 材料健康SD大鼠，月齡34月，雄性，體重(25030) g，由解放軍第89醫院實驗動物中心提供。將Morris水

10、迷宮篩選出較靈活的大鼠80只，隨機抽取40只作為假手術組;其余40只復制VD模型。假手術組、模型組在造模后15 d，1、2、4個月等4個時間點分為4個亞組，每亞組10只，并在不同時間點進行Morris水迷宮法檢測和免疫熒光檢測。2 方法2.1 VD模型復制及篩選 采用重復夾閉雙側頸總動脈(CCA)同時腹腔注射硝普鈉溶液方法，復制腦缺血再灌注大鼠VD模型，具體步驟見我們以前的方法5。假手術組麻醉及手術過程與模型組相同，但不阻斷CCA及注射硝普鈉。在術后1周進行Morris水迷宮實驗(觀察指標為平均逃逸潛伏期)篩選，以假手術組大鼠逃逸潛伏期均值的95%上限值為標準，將超出上限值的腦缺血再灌注大鼠確

11、定為癡呆大鼠。2.2 Morris水迷宮試驗 各組大鼠分別在造模后15 d，1、2、4個月進行Morris水迷宮定位航行實驗6 , 檢測反映大鼠空間學習和記憶能力改變的EL。2.3 免疫熒光檢測 Morris水迷宮檢測后，各組大鼠麻醉后經右側CCA向腦組織依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛溶液，至流出液體澄清。取視交叉后4 mm處至小腦前腦組織，入4%多聚甲醛后固定12 h，常規石蠟包塊，組織切片機制備腦冠狀面切片，片厚約5 m。將組織切片常規脫蠟入水，山羊血清室溫封閉30 min，分別滴加稀釋的一抗：兔抗Ng(1:100，Upstate公司)、兔抗磷酸化Ng(1:100，Protein-tech

12、公司)和PBS空白對照(陰性對照)，再滴加生物素化羊抗兔IgG和SABC-cy3試劑，用SABC-Cy3法進行Ng和磷酸化Ng免疫熒光染色。顯微鏡下觀察海馬組織結構中目標物的表達情況。光鏡下(400 ) 選取細胞數較為恒定的 CA1區中段拍片，每張照片取相同面積計數錐體細胞，3張切片的平均值為該樣本的錐體細胞數。統計學處理: 所有數據均用 s 表示，應用SPSS11.5軟件進行統計，采用方差分析，q檢驗。以P0.05為有統計學顯著性差異。結 果1 行為學觀測結果Morris水迷宮檢測顯示，與假手術組比較，模型組大鼠在15 d，1月、2月、4月各相應時間點的EL均明顯延長 (P0.01)。組內各

13、時間點前后比較，模型組2月、4月時間點的EL明顯長于15 d時間點(P0.05，P0.05，表1)。2 免疫熒光染色結果2.1 Ng在VD模型大鼠海馬中的表達變化 熒光顯微鏡下，海馬CA1區、CA2區、CA3區和齒狀回(DG)神經元內均可見CY3標記的紅色熒光免疫反應陽性產物。假手術組大鼠海馬錐體細胞層和顆粒細胞層的胞漿染色亮，Ng免疫陽性神經纖維顯色清晰;CA1區錐體細胞帶排列緊密清晰，頂樹突整齊排列于輻射層，Ng陽性熒光染色深，分布均勻。模型組大鼠海馬Ng陽性細胞數減少，染色淺，神經元突起縮短或消失，細胞脫落較嚴重，細胞帶斷裂，排列分散(Fig.1)。陽性細胞計數發現，模型組大鼠CA1區各

14、時間點的Ng陽性神經細胞計數較假手術組均明顯減少(P0.01);隨時間點的推移，陽性細胞減少更為明顯，1月、2月和4月時間點的陽性細胞計數明顯少于15d時間點(P0.01)。在DG區，模型組2月和4月時間點的免疫陽性神經細胞數顯著少于假手術組相應時間點(P0.01);各時間點前后比較，模型組2月和4月時間點陽性細胞計數明顯少于15 d時間點(表2)。2.2 P- Ng在VD模型大鼠海馬中的表達變化 各組大鼠海馬切片中均可見CY3標記的紅色熒光分布于神經元的胞漿及突起中，主要集中在DG、CA1、CA2及CA3，這些部位陽性細胞較密集，熒光著色深，其中以海馬CA1區錐體細胞層和DG區顆粒細胞層最密

15、集，其它各層散在稀疏分布。假手術組大鼠海馬CA1區錐體細胞和DG區顆粒細胞P-Ng免疫反應陽性神經元排列密集，熒光著色深，有的P-Ng陽性神經細胞有較長的突起。模型組大鼠海馬P-Ng陽性細胞數減少，細胞脫落較嚴重，細胞帶斷裂、排列分散(Fig.2)。陽性細胞計數顯示，模型組大鼠海馬CA1區各時間點的P-Ng陽性神經細胞數明顯少于假手術組相應時間點(P0.05, P0.01);而且隨時間點推移減少得更為明顯，模型組2月和4月時間點的陽性細胞數明顯少于15 d時間點(P0.05)。在DG區，模型組僅在2月、4月時間點的P-Ng陽性神經細胞數明顯少于假手術組 (P0.05，表3)。Fig. 1 Ex

16、pression of neurogranin in CA1 region of hippocampus (immunofluorescent staining, 400). A: sham- operated group, B: model group (model group, 2 mouths time point).Fig. 2 Expression of phosphorylated neurogranin in CA1 region of hippocampus (immunofluorescent staining, 400). A: sham- operated group,

17、B: model group (model group, 2 mouths time point).討 論本實驗通過雙側頸總動脈反復夾閉再通結合腹腔注射硝普鈉降壓法復制了學習記憶障礙的VD大鼠模型。Morris水迷宮測試顯示，模型組大鼠各時間點的EL均比假手術組的EL明顯延長(P0.01)，提示模型大鼠學習記憶功能明顯障礙。模型組大鼠各時間點前后比較，隨著時間點推移EL有延長趨勢，至2月和4月時間點的EL已明顯長于15d時間點(P0.01)。這與趙小貞等7的研究不完全一致，可能與復制模型損傷程度有關。結合我們以前研究的結果8,9，提示腦缺血再灌注后大鼠的腦學習記憶功能損害在一定時間內是逐漸加重

18、的，到后期進展緩慢。與VD發展的慢性病程特征相符。Li等10的研究表明，大鼠腦挫傷后在受損部位表現出Ng免疫反應性的缺乏，而大腦中動脈阻塞(MCAO)可導致同側大腦半球廣泛性的Ng染色缺失。Shughrue等11在頸總動脈阻塞的缺血模型大鼠發現，缺血后大鼠海馬CA1區Ng mRNA表達明顯下降，考慮為該區域的神經元存在急劇的選擇性缺失所致。由于Ng主要存在于神經元的樹突棘上，因此，Ng可作為中樞神經系統病變時樹突受損的一種標記物，Ng蛋白水平的高低可反應樹突棘的密度和突觸結構的可塑性。槐雅萍等3的實驗結果顯示MCAO術后第1 d出現Ng表達的減少，隨時間推移表達逐漸增高，到第2周左右達高峰然后

19、逐漸下降。這些結果提示，Ng可能在腦缺血再灌的神經元損傷和修復中起重要作用。那么，腦缺血急性期的神經突觸后Ng變化在VD慢性期的遲緩性損傷中是否也起一定的作用?目前尚未見報道。因此本實驗觀察了Ng在腦缺血/再灌注后的長時程改變，以探討其在VD發病后學習記憶等慢性智能障礙中的作用。本研究采用免疫熒光計數法，分析檢測各組大鼠海馬齒狀回分子層外帶、CA1區輻射層和始層Ng陽性細胞數，結果顯示：假手術組大鼠海馬Ng免疫陽性神經元顯色清晰;模型組大鼠于腦缺血再灌注損傷后15 d，1、2、4月海馬CA1區免疫陽性細胞計數和Ng表達均低于假手術組。這些結果提示，學習記憶障礙可能主要與CA1區Ng免疫陽性神經

20、元減少和殘存神經元合成Ng功能下降有關。CA1區位于信息整合、強化的最后關鍵腦區，腦缺血再灌注損傷時可能損傷最嚴重。出現這種變化的可能機制是：腦缺血再灌注損傷后, 殘存神經元失代償，出現能量代謝障礙和蛋白合成能力降低，海馬細胞Ng基因轉錄和翻譯減弱，因而Ng蛋白表達水平的降低。而Ng含量的高低可以影響神經元的再生、樹突棘密度和功能，可導致神經元數量減少和缺失，突觸數量和突觸重建受損，突觸傳遞功能受損，從而導致學習記憶功能障礙。本研究結果還顯示，VD大鼠海馬DG區分子層的Ng表達在15 d、1月時間點與假手術組無顯著性差異，但在2月和4月時間點模型組Ng的表達明顯低于假手術組，這與CA1區Ng表

21、達結果明顯不同，提示腦缺血再灌注后海馬不同腦區Ng表達對損傷有不同的反應。出現這種變化的可能機制是：腦缺血再灌注早期(15 d、1月)，由于神經元的丟失啟動了機體代償機制，如各種神經營養因子表達增多、突觸重構等引起殘存神經元為適應功能的需要合成代謝旺盛，從而引起殘存神經元Ng表達增多;而隨著腦缺血再灌注損傷后時間的延長腦損傷逐漸加重，殘存神經元失代償，出現能量代謝障礙和蛋白合成能力下降，Ng合成減少。隨著神經干細胞(neural stem cells，NSCs)研究的不斷深入，發現多種成年哺乳動物包括人在內的腦室下區(SVZ)和海馬DG顆粒下帶(SGZ)細胞終生具有分裂增殖能力，病理性刺激可以

22、激發SVZ和SGZ的神經再生12-15，這些神經生發區在腦缺血后神經的再生和損傷修復中起著重要的作用16,17。因而我們推測，腦缺血后早期大鼠SGZ的細胞增殖明顯增強，并且增殖細胞部分分化為神經元和膠質細胞，從而引起Ng表達增多;而后期機體出現適應性反應，病理性刺激因素減弱，SGZ的細胞增殖明顯減弱，從而出現DG區的Ng表達先期(15 d、1月)降低不明顯，而后期(2月、4月)明顯降低的現象。關于腦缺血后Ng磷酸化水平的改變，目前研究較少。胡俊等4的研究表明，MCAO大鼠缺血3 h Ng磷酸化水平即已呈上升趨勢，隨著缺血時間的延長，Ng的磷酸化水平顯著升高，在缺血1 d左右即達到高峰。而本實驗

23、結果顯示，模型組大鼠海馬p-Ng陽性神經元計數比假手術組減少，P-Ng表達也降低。這些結果的不同，可能與腦缺血后Ng磷酸化的觀察時間點不同有關。出現這種變化的可能機制是：腦缺血再灌注損傷后，由于細胞內Ca2+濃度大量增加，泵功能衰竭，線粒體、溶酶體等細胞器自溶，缺血神經元發生不可逆性死亡，Ng磷酸化水平顯著下降并不再恢復。腦缺血再灌注損傷后神經細胞內存在鈣超載現象18，鈣穩態的失衡，PKC的活化降低，從而導致其底物Ng磷酸化降低。隨著腦缺血再灌注損傷后時間的延長腦損傷逐漸加重，由于氧的缺乏導致能量供應不足，進而影響到蛋白質的合成，Ng合成減少，相應的磷酸化Ng表達也減少，導致突觸后信號轉導障礙

24、。因此我們推測，Ng激活程度上的持續減少可能是VD發病后智能障礙持續存在的機制之一。參考文獻1 Ran X, Miao HH, Sheu FS, et al. Structural and dynamic characterization of a neuron-specific protein kinase C substrate, neurogranin J. Biochemistry, 2003, 42: 5143-5150.2 Alvarez-Bolado G, Rodrguez-Snchez P, Tejero-Diez P. Neurogranin in the developme

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