1、動物醫(yī)學(xué)進展,2008,29(11):83-88ProgressinVeterinaryMedicine不分節(jié)段負股RNA病毒作為活疫苗載體研究進展王曲直'，黃忠L孫慶2,劉佩紅(1.上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海201103；2.揚州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點開放實驗室.江蘇揚州225009)摘要：不分節(jié)段負股RNA病毒(nonsegmentednegative-strandRNAviruses*NNSV)屬于單負股病毒目，具有許多優(yōu)良的特性，可以作為活病毒疫苗的候選載體，利用反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，表達外源基因，研發(fā)新型疫苗。NNSV栽體疫苗的免疫原性，栽體的容量，外源糠蛋白對載體病毒生物

2、學(xué)的影響，以及插入基因的遺傳秘定性等已成為當前活病毒疫苗栽體研發(fā)的重要課題。關(guān)鍵詞：活疫苗栽體；不分節(jié)段負股RNA病毒；反向遺傳系統(tǒng)中圖分類號:S852.65文獻標識碼：A文童編號：1007-5038(2008)11-0083-06選擇致弱的活病毒作為疫苗，主要是因為其能表達病毒抗原的完整組分，誘導(dǎo)廣泛的局部免疫和系統(tǒng)免疫，提供持久的保護力。在某些特定的情況下,致弱的活病毒疫苗也有一些缺點：一些病毒不能作為減毒活疫苗，如能引發(fā)持續(xù)性感染的入免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV),高致病性的埃博拉病毒；一些病毒在體外試驗中生長不佳，如人乳頭瘤病毒和丙型肝炎病

3、毒；一些高致病性的病毒在疫苗研制過程中存在安全隱患，如嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒(Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus,SARS-CoV)和埃博拉病毒；一些病毒會由于物理不穩(wěn)定性而失去感染力，如人呼吸道合胞體病毒(Humanrespiratorysyncytialvirus,HRSV)；-些病毒能與正在流行的病毒株發(fā)生基因交換，如冠狀病毒、流感病毒和腸道病毒等。然而，合適的載體疫苗可以克服這些不利因素。特定的候選病毒載體的生物學(xué)特征還可能提高免疫效力。載體疫苗另一個主要優(yōu)點是能夠較快地構(gòu)建疫苗，預(yù)防新出現(xiàn)的高致病性病毒病。在這種情況下，對新出現(xiàn)的

4、病原序列進行分析，鑒定出可能的保護性抗原，然后將它們的cDNA克隆插入到預(yù)先已檢驗過的、有廣泛臨床用途的載體中，可以加快疫苗的研發(fā)速度。收稿日期：2008-08-09作者簡介：王曲(1980-).女，江蘇常州人士，主要從事病卓冬因功能研究。“通訊作者ProgressonScrapieZHANGTai-xiang.ZHANGLi-ping,TIANGuo-hua,TIANGuo-ning,WANGBing-jun»ZHANGJin-ling»HANLiang(WrifanEntry-exitInspectionandQuarantineWeifangShandong9260A

5、19China)Abstract：scrapieisanervalrecessiveencephalopathyofsheepandgoat,andisoneofthehotresearchspotsintheworld.Thepathogenofthediseaseisaprion,whichhasthesamefirststructurewiththenormalprioncodedbythehostbuthasthedifferentconformationinthesecondstructure.Theprionstrainsandtheirmolecularcharacteristi

6、csaccordingtotherecentreports.Keywords:scrapie；transmissiblespongiformencephalopathies?prionstrains；molecularcharacteristicsMournT.OlsakerI.HoppP,etal.Polymorphismsatcodons141and154intheovineprionproteingeneareassociatedwithscrapieNor98casesJ.JGenVirol,2005.86(1>t231-235.20 Papasawa-StylianouP.Kl

7、canthousM.ToumasosP.etal.Novelpolymorphismsatcodons146and151intheprionproteingeneofCyprusgoat3(andtheirassociationwithnaturalscrapieCJ.VetJ,2007,173(2),459-462.f221VaccariGDiBariMA»MorelliL*ctal.IdentificationofanallelicvariantofthegoatPrPgeneassociatedwithresistancetoscrapieJJ.JGenVirol.2006.8

8、7(5>,1395-1402.23ZhangL.LiN,FanB.ctal.PRNPpolymorphismsinChineseovine,caprineandbovinebreedsJ.AniniGenet,2004,35(6),457-461.1NNSV成為疫苗載體的潛力選擇NNSV作為病毒載體是由于、NSV有許多優(yōu)良的特征。許多動物、肉類和人的NNSV,已經(jīng)過全面的研究鑒定，表明可以用作疫苗載體。一些動物或禽類的NNSV,如水皰性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus*VSV)和新城疫病毒(Newcastlediseasevirus.NDV),在抗原性上與常見的

9、人類病原迥然不同。因此，整個人群應(yīng)該對感染和免疫都比較敏感。一些人類的NNSV.511人副流感病毒1,2和3型(Humanparainfluenzavirus,HP1V)在易感人群中具有成為疫苗載體的潛力。例如嬰兒和兒童未曾接觸過HPIV-1.2和3,因此,減毒的HPIV-H2和3都可以開發(fā)成為適用于兒童接種的疫苗載體。人們對減毒的、SV生物學(xué)活性了解也比較多°由于自然宿主范圍的限制性，一些動物或禽類病毒在靈長類動物體內(nèi)會出現(xiàn)毒力減弱的現(xiàn)象。如果研究鑒定出與病毒毒力減弱相關(guān)的突變，那么可以運用反向遺傳技術(shù)進行修飾改造。因此.能夠以減毒的NNSV作為載體表達異源性病毒保護性抗原，從而在

10、定向的免疫群體中能很好地平衡毒力減弱與免疫原性之間的關(guān)系。作為載體的、NSV在細胞中能高效地繁殖，例如在適合于人用疫苗生產(chǎn)的Ver。細胞上。大多數(shù)的NNSV能夠通過鼻腔內(nèi)途徑高效感染，有效地誘導(dǎo)局部的IgA和系統(tǒng)的屈(；抗體免疫應(yīng)答以及細胞介導(dǎo)的保護性免疫應(yīng)答。鼻腔內(nèi)疫苗可以簡便、安全地進行接種,從而便于在疾病暴發(fā)或流行時快速進行。鼻腔內(nèi)疫苗對于經(jīng)呼吸道感染和傳播的病毒尤其有效，如對SARS-CoV和流感病毒等。作為載體的、SV只在細胞質(zhì)中增殖，不會整合到宿主細胞基因組中，因此不會造成細胞轉(zhuǎn)化。NNSV之間發(fā)生基因交換的機率非常罕見，而且在自然界中還沒有報道NNSV編碼5到11種不同的蛋白質(zhì)，

11、而大DMA病毒，如痘病毒，編碼多達200種蛋白質(zhì)。這些復(fù)雜的病毒表達的兒種蛋白質(zhì)能調(diào)節(jié)或頡頑宿主免疫應(yīng)答，從而可能降低疫苗的免疫效力。麻疹病毒是一種具有強免疫抑制的NNSV,是由另一種機制介導(dǎo)，而非干擾素機制介導(dǎo)，因此，不太適于作為載體候選病毒。復(fù)雜的載體抗原可能會稀釋針對外源性抗原的抗體和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致T記憶細胞總?cè)簲?shù)筮的降低。NNSV的基因組是由多個不重疊的(絕大部分來說)、以單個不同的mRNA單位進行表達的基因組成，因此，構(gòu)成了一個可調(diào)朽的基因組結(jié)構(gòu)，便于外源基因的插入以及維持外源基因的穩(wěn)定性。2NNSV載體疫苗的構(gòu)建2.1反向遣傳技術(shù)NNSV的反向遺傳操作技術(shù)是指在體外通過構(gòu)

12、建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,在DMA分子水平上對其進行各種體外操作，由病毒基因組和各種輔助蛋白來組裝成新的有感染性的R、A病毒的一項研究技術(shù)。NNSV反向遺傳的核心就在于構(gòu)建有功能性的核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNPs)o功能性的核衣殼成分是由全長基因組或反基因組RNA和參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的主要蛋白質(zhì)，即核衣殼蛋白("11-cleoproiein.N或NP)、磷蛋白(phosphorproteinP)以及大聚合前蛋白(largeprotein,L)組成的。將編碼病毒功能性的核衣殼成分的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，就可以從克隆的cDNA中拯救出

13、有感染性NNSV。此外，HRSV和絲狀病毒科馬爾堡病毒或埃博拉病毒的拯救還分別需要轉(zhuǎn)錄延伸因子M2-1或轉(zhuǎn)錄活化因子VP30。通過轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒運送到支持特殊的病毒復(fù)制的細胞系。質(zhì)粒的表達是由T7RNA聚合酶指導(dǎo)的。有3種途徑可以實現(xiàn)：與表達T7RNA聚合磨的重組痘苗病毒共感染；利用穩(wěn)定表達T7RNA聚合酶的細胞系；共轉(zhuǎn)染表達T7RNA聚合酶的質(zhì)粒。第3種方法最受歡迎，因為它能夠使病毒可以在用于疫苗生產(chǎn)的細胞系(如Vero)中拯救，而不需要添加其他使基因表達調(diào)控復(fù)雜化的成分(如痘苗病毒)。這些RNA和蛋白質(zhì)成分的細胞內(nèi)表達引起病毒核衣殼的組裝，組裝的核衣殼成分具有基因表達和基因組復(fù)制的功能，因此，

14、建立了生產(chǎn)性感染，產(chǎn)生感染性病毒。2.2表達外源基因的減毒野生型NNSV最簡單的載體策略就是將一個或多個外源抗原基因插入到有復(fù)制功能的、:MSV中，然后從中表達一個或多個外源性抗原。NNSV載體必須是顯著致弱的，才能安全地用于人類或動物。例如NDV,由于自然宿主限制性，在靈長類動物中是減毒的,其野生型病毒可直接作為疫苗載體。其他的NNSV在用作人類潛在疫苗載體前需要利用反向遺傳技術(shù)進行致弱。例如，VSV不是一個普通的人類病原，但VSV感染與一些疾病相關(guān),盡管這些病通常對于人是輕微的。因此，在VSV用作疫苗載體前.需要致弱并進行細致的臨床評價。另外一個例子是HPIV-3,能引發(fā)人類產(chǎn)生呼吸道疾病

15、。因此，在使用的時候，必須制備減毒的毒株，并證實其安全性。NNSV的致弱可以運用多種策略來實現(xiàn)，病毒基因在基因組中的次序可以重排，產(chǎn)生一個最佳水平的基因表達，從而降低了病毒復(fù)制的效率。鑒定與毒力相關(guān)的核昔酸或賽基酸，然后利用反向遺傳技術(shù)對其進行點突變，再以理想的組合引入到病毒基因組或蛋白質(zhì)中，也可以通過對相關(guān)病毒的序列進行比對，鑒定出點突變，然后利用反向遺傳技術(shù)將這些點突變在相關(guān)病毒中傳遞。缺失或者沉默非必需的輔助基因，包括那些編碼干擾素頡頑蛋白質(zhì)的基因，通常會產(chǎn)生減毒的重組病毒。對于狂犬病毒而言，可以將G慵蛋白細胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域部分截斷，從而有效的降低其復(fù)制，但不會顯著削弱其免疫原性。外源基因

16、的插入，常常具有減毒效應(yīng)。致弱也可以通過交換相關(guān)的人類和動物或者禽類病毒之間內(nèi)部蛋白基因而引入宿主范圍限制性來實現(xiàn)2.3抗原嵌合病毒從插入的基因中表達外源抗原的另一種策略就是用致病性病毒的目的基因替代載體的主要的保護性表面抗原。這些構(gòu)件被稱為抗原嵌合病毒。只有外源的表面蛋白有效地摻入到病毒顆粒中以及在載體下有功能性，所拯救的抗原嵌合病毒才能存活。幾個很典型的抗原嵌合病毒就是以VSV作為載體的，用流感病毒的血凝素糖蛋白(hemagglutinin.HA)或者埃博拉病毒、馬爾堡病毒或者拉沙病毒的各自的糖蛋白將VSV的G糖蛋白替換。在體外，構(gòu)建的嵌合病毒，相對于親本VSV毒力減弱，表明載體蛋白與外源

17、糖蛋白之間存在一定程度的不兼容性，但VSV的復(fù)制效率沒有明顯改變。并非所有以VSV做載體的嵌合病毒都具有復(fù)制功能。HRSV的每一個蛋白都可以摻入到VSV病毒顆粒中，在體外試驗中單獨的融合蛋白(fusionprotein,F)也足以賦予HRSV有效的感染性和生長能力，但VSV的G蛋白為HRSV的G或F蛋白所替代后構(gòu)建的嵌合病毒是不能存活的。用HPIV-1的HN和F糖蛋白取代HPIV-3中相應(yīng)的基因，拯救出的嵌合病毒在體內(nèi)和體外試驗中復(fù)制效率和野生型病毒相當這種嵌合并沒有引起病毒毒力下降，可能反映了這兩種病毒之間關(guān)系相近.和這一觀點一致的是，用遺傳距離較遠的HPIV-2的(HN)和F蛋白取代HPI

18、V-3中相應(yīng)的基因.并不能拯救出活的嵌合病毒。對HP1V2的HN和F蛋白進行一定的修飾，用HPIV-3的HN和F蛋白細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域取代HPIV2的H、和F蛋白相應(yīng)的結(jié)構(gòu)，可以拯救出活的抗原嵌合病毒，雖然在體內(nèi)試驗中毒力減弱，但在體外試驗中可以有效地復(fù)制。因此，異源性糖蛋句在抗原嵌合病毒中高效的發(fā)揮功能依賴于其細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與載體病毒的匹配性。抗原嵌合病毒涉及到用人HPIV-3的HN和F基因替代牛副流感病毒3型(Heefcattleparainfluenzavirus3,BPIV-3)的HN和F表面糖蛋白基因，BPIV-3對于人類而言，由于自然宿主范圍的限制性.毒力是減弱的。這將BPIV-3的宿主范

19、圍的限制性與HPIV-3的主要抗原決定因素結(jié)合起來，拯救出減毒的牛-人嵌合PIV-3(B/HPIV-3).在體外的復(fù)制效率并沒有降低，仍然保持對非人的靈長類動物宿主致弱的表型。2.4 表達外源基因的抗原嵌合病毒除了直接作為活疫苗，抗原嵌合病毒也可以用來表達外源性抗原。例如,B/HPIV-3嵌合病毒可以作為載體，插入外源的HRSV或者HMPV保護性抗原基因，分別表達這些病毒的保護性抗原。這些應(yīng)用可以構(gòu)建出雙價疫苗，針對HPIV-3和HRSV或者HPIV-3和HMPVl表達HRSV的F糖蛋白的B/HPIV-3嵌合病毒正在進行臨床試驗。2.5 外源基因插入到NNSV的基因組中典型的NNSV基因組模塊

20、式結(jié)構(gòu)組成，轉(zhuǎn)錄起始于3'基因末端，病毒聚合酶在基因起始(genestart,GS)和基因終止(geneend,GE)信號的指導(dǎo)下，依次復(fù)制基因。GS和(；E構(gòu)成了每個基因的上游和下游限制區(qū)。這些信號分別指導(dǎo)每個基因轉(zhuǎn)錄起始和終止/多聚腺甘酸化，產(chǎn)生單個mRNA。病毒啟動子存在于基因組(和反基因組)的3'端，長度約為44到96個核昔酸不等，主要取決于不同的病毒，每個GS和GE信號通常由8個126個核昔酸組長。因此,順式作用信號是比較短的。表達外源性抗原的轉(zhuǎn)錄單位構(gòu)建的方法是將外源基因的開放式閱讀框的cDNA進行加工，在其兩側(cè)加上載體特異性的GS和GE信號序列。再將此轉(zhuǎn)錄盒插入到

21、NNSV載體中，側(cè)翼是基因間區(qū)域。在拯救的重蛆NNSV中，外源基因作為額外的獨立的mRNA被表達。NNSV能接納并高效地表達插入到第一個基因前的、或者任何一個基因間區(qū)域的、或者最后一個基因之后的外源基因。目前應(yīng)用比較廣泛的是VSV和NDV,以其減毒的病毒株為載體表達各種外源性蛋白，例如前者表達Yersiniapestis的低鈣應(yīng)答蛋白V(lowcalciumresponseprotein,LcrV)，棉尾兔乳頭多瘤早期蛋白時】，H1V的囊膜蛋白(envelope,Env)w,丙肝病毒的結(jié)構(gòu)蛋白面.后者表達H5亞型禽流感病毒的HA蛋白5,SARS-CoV的纖突糖蛋白（spike,S）g,RSV的

22、F蛋白NNSV的一個分類群具有獨特的特征.基因組的長度必須是6的整數(shù)倍，才能高效夏制。-些研究者認為這反映了核衣殼的嚴格組成，每一個N單體精確地與6個核昔酸相結(jié)合。“6堿基原則”只適用于副黏病毒科副黏病毒亞科，包括仙臺病毒（SendaivirusSeV）HPIVs和NDV。此外對于符合“6堿基原則''的病毒而言，由于基因組的六聚體相變，每個GS信號的位置在轉(zhuǎn)錄的效率方面有一定的作用。因此，對于這些病毒，插入的長度和組成必須符合“6堿基原則”。2.6外源基因插入到基因組中不同位置NNSV的轉(zhuǎn)錄具有一定的極性，啟動子近側(cè)的基因比遠側(cè)的基因表達的效率更高。因此，當外源基因插入到基因組

23、上游時，表達的效率更高。由于轉(zhuǎn)錄存在極性，一個或多個外源基因的插入，也會降低下游載體基因的表達，可能會降低載體病毒在體內(nèi)和體外的復(fù)制性能。與外源基因插入到啟動子遠側(cè)相比，插入到啟動子近側(cè)對病毒的致弱影響更強，很可能是因為外源基因插入到啟動子近側(cè)會影響載體病毒下游許多基因的表達。對NDV和VSV而言，在基因連接點插入外源基因，外源基因插入到N與P基因之間產(chǎn)生的致弱影響最強。這是因為N與P蛋白之間的犀爾比發(fā)生變化，、與P蛋白是核衣殼中相互作用的兩種蛋白質(zhì)，外源基因插入對于病毒的轉(zhuǎn)錄和RNA的復(fù)制有害。2.7載體的容量外源基因插入到NNSV會增加基因組的長度和基因的數(shù)目，通常這會對病毒在體內(nèi)和體外試

24、驗的復(fù)制性能產(chǎn)生衰減效應(yīng)，這種影響在體內(nèi)試驗中更明顯。這可能是由于外源基因的插入影響了病毒的轉(zhuǎn)錄。RNA的復(fù)制和包裝也可能受到影響，目前對此還未進行深入透徹的研究。2.8插入基因的毒性在一些情況下,表達的外源糖蛋白似乎是有毒性的，能強烈地誠弱NNSV載體的復(fù)制。在體外生長時,這些外源基因快速積累突變，產(chǎn)生變化的蛋白質(zhì)，降低表達水平，或完全停止表達。插入的外源基因與載體的毒性組合的例子有HPIV-1的HN蛋白插入到HPIV-3基因組中.可能具有抑制性，因為它會包裝到載體病毒粒子中，由于存在相似性，可能會干擾HPIV-3的HN蛋白；腮腺炎病毒的F基因插入到麻疹病毒中以及麻疹病毒的F蛋白插入到VSV

25、中，也都可能具有抑制性，可能是由于F蛋白具有融合性，也可能是由于F蛋白干擾了載體病毒的糖蛋白。2.9插入基因的遺傳穩(wěn)定性為了使NNSV載體疫苗適合人和動物免疫接種，外源基因在NNSV中必須能夠在生產(chǎn)和使用的所有過程都保持穩(wěn)定。RNA病毒在每一輪復(fù)制中平均每一個核苜酸有ICT，io5錯配率。以正股RNA病毒為載體常常會在體外傳代過程中很快地完全或部分缺失外源基因。然而，以NNSV為載體插入的外源基因只是比較緩慢地積累點突變,很少會發(fā)生基因的缺失。即便外源基因通常保持穩(wěn)定，對所有疫苗制劑進行監(jiān)測依然是必要的.必須要確保插入的外源基因的保真性。2.10外源械蛋白對栽體病毒生物學(xué)特性的影響XNSV在出

26、芽過程中，從宿主細胞漿膜中獲得囊膜，將表面表達的外源糖蛋白摻入到載體病毒顆粒中，抗原嵌合病毒依賴這些外源糖蛋白代替缺失的載體糖蛋白發(fā)揮功能。在以VSV為載體的重組病毒中，表達的外源糖蛋白能高效地摻入到病毒粒子中，例如流感病毒神經(jīng)氛酸酶（NA）和血凝素蛋白（HA）,麻疹病毒的H和F蛋白.HRSV的F蛋白。這些外源糖蛋白以相當于載體G蛋白相對摩爾量的30%水平被包裝到病毒粒子上。HIV-1囊膜蛋白是一個例外，只能痕鼠地摻入到病毒顆粒中，但是如果用VSV的G蛋白的細胞質(zhì)尾取代HIV-1囊膜蛋白的細胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域,摻入量會顯著增加。然而.互換細胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域的方法并不能增加HRSV的F蛋白或CD4表面

27、糖蛋白的摻入量，表明VSV的（；蛋白的細胞質(zhì)尾是非必需的。HRSV的F蛋白和HIV-1囊膜蛋白在VSV囊膜上是有功能的，能夠以不依賴于載體G蛋白的方式起始感染。因此，就摻入的外源性表面蛋白而言，VSV病毒粒子似乎是不加區(qū)別的，在大多數(shù)例子中，這似乎與結(jié)構(gòu)的或分類的相關(guān)性或者VSV細胞質(zhì)尾的存在無關(guān)。研究者對P1V病毒載體表達的外源糖蛋白摻入到病毒粒子展開了相關(guān)的研究，結(jié)果與VSV的研究略有差異。重組SeV表達的HRSV的G蛋白或者B/HP1V3表達的SARSCoV纖突S蛋白并不能顯著地摻入到病毒顆粒中。然而，HPIV-1的H蛋白能摻入到HPIV-3病毒粒子中，的確干擾了載體的復(fù)制。這可能是因為

28、HPIV-1與HPIV-3的相關(guān)性很高的緣故。可是，相近的分類/序列聯(lián)系對于摻入并非必需的，因為HPIV-1表達的HMPV的F蛋白能有效的摻入到病毒粒子中，HPIV-3表達的埃博拉病毒GP慵蛋白也能摻入到病毒粒子中。將外源糖蛋白摻入到載體病毒顆粒中可能會改變載體病毒的嗜性或載體在宿主內(nèi)的傳播能力，這可能會引起高致病性病原的毒力增強。但現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)還沒有證實這一點。表達HIV-1囊膜糖蛋白的重組VSV和表達埃博拉病毒，馬爾堡病毒，或拉沙病毒的GP蛋白的抗原嵌合VSV已經(jīng)在非人的靈長類動物上進行臨床評估了。表明是安全致弱和具有免疫原性及保護力的。這表明在總體水平上，外源糖蛋白并不會顯著增加載體的毒

29、力。3NNSV載體疫苗的免疫原性.有幾種因素影響載體疫苗的免疫原性。首先，任何活病毒疫苗的免疫原性和保護效力的水平都依賴于其復(fù)制水平。因此，由于減毒而引起復(fù)制能力下降，會導(dǎo)致免疫原性下降。將病毒致弱，以保證疫苗的安全，同時也使其保持-定的復(fù)制水平，可以產(chǎn)生較好的免疫原性，但這是具有挑戰(zhàn)性的,最終還得依賴于臨床評估。載體的擴散與免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和基因組RNA的持續(xù)存在相關(guān)I血。第二，影響疫苗免疫效力的因素是所表達的病原抗原的種類。典型的載體疫苗只表達一個或兩個耙病原的蛋白.通常是表面糖蛋白，而減毒的病原表達全部的病原抗原。盡管中和抗原能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒中和抗體.但和相對減毒的全病原相比，病原抗原的

30、種類減少很可能會降低細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，第三，載體表達的外源糖蛋白的免疫原性也受到其是否摻入到載體病毒顆粒上的影響。這反映了顆粒抗原要比可溶性抗原的免疫原性更強，尤其是能介導(dǎo)與抗原遞呈細胞結(jié)合。此外，與壞死或凋亡所介導(dǎo)的病毒釋放相比，病毒粒子結(jié)合蛋白能更快地從感染細胞中釋放。例如，用NDV的F蛋白的細胞質(zhì)尾和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域替換H7亞型禽流感病毒的HA糖蛋白的相應(yīng)區(qū)域，然后將此嵌合的HA插入到重組NDV中表達，與表達未修飾的HA蛋白的重組病毒相比，該重組病毒可以增加蛋白摻入到病毒顆粒中的量，增強免疫應(yīng)答，提高對流感病毒的保護效力"幻。另一個例子是，通過用VSV的(；蛋白細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域替換H

31、IV囊膜蛋白的相應(yīng)區(qū)域.可以增加HIV囊膜蛋白摻入到重組VSV顆粒中，增強了其免疫原性。第四，共表達的免疫刺激因子，如Y干擾素、IL-2、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和色素C等會影響NNSV載體的免疫原性。在一些情況下，共表達免疫刺激因子會使、NSV載體致弱，但允許其保持免疫原性。在另外一些情況下，免疫應(yīng)答的強度也會因為共表達的分子而增強，如表達巨噬細胞粒細胞集落刺激因子的抗原嵌合病毒B/HPIV-3和表達IL-2的RV。重組RV表達促凋亡蛋白色素C使病毒的毒力減弱.但提高了其免疫原性，該效應(yīng)的產(chǎn)生增強了抗原遞呈細胞捕獲凋亡細胞的能力。第五，NNSV載體也提供了加強免疫的策略。在用減毒活疫苗免疫

32、之后，如再用載體疫苗免疫，降低了免疫效力，因為針對首次接種的免疫應(yīng)答限制了隨后疫苗的復(fù)制和免疫原性。然而，再次免疫的效力可以通過使用不同載體的疫苗來改善。例如，與用同一病毒進行兩次免疫相比，分別用表達HIV-1囊膜蛋白的RV和VSV進行第一次和第二次免疫，會顯著增強細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答叫HPIV具有4種血清型，為在兒童群體中進行連續(xù)接種提供了可能性。第六，可以對載體進行修飾，使其可以攜帶一套表面抗原。例如，構(gòu)建3種VSV重組病毒每個都攜帶不同血清型VSV的G糖蛋白。研究表明依次用這3種載體疫苗免疫，每一種疫苗表達HIV-1Env或聯(lián)合表達Env和群抗原蛋白(groupantigen,Ga

33、g),可以加強免疫應(yīng)答。HPIV-3的HN和F表面蛋白也可以與HPIV-1和2病毒的表面蛋白交換。然而，這些糖蛋白交換載體含有一套不變的內(nèi)部蛋白，用它們來免疫，可以誘導(dǎo)針對內(nèi)部蛋白的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答.細胞免疫賦予了對重新感染的抵抗能力，但這種免疫在幾月內(nèi)就消失了，因此，需要考慮另一方法，就是連續(xù)免疫。最后,NNSV載體疫苗也能用于加強由活病毒疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。用減毒的HRSV毒株免疫后，再用表達HRSV的F蛋白的HPIV-1載體疫苗加強免疫，要比接種兩次減毒的HRSV毒株的免疫原性更強。如果用不同的接種途徑連續(xù)免疫，那么加強免疫也可能更有效，如首先肌內(nèi)接種VSV載體疫苗，然后再鼻腔內(nèi)接種N

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