1、 現代化學化工實驗技術現代化學化工實驗技術 和分析方法和分析方法 色色 譜譜 分分 析析 方方 法法一、色譜分析法概述 色譜分析法已成為當代科技迅速發展時期的最適宜的最重要的分離分析方法，形成了一門新興學科色譜法。氣相色譜、液相色譜、凝膠滲透色譜、離子色譜等都得到了廣泛深入的應用。色譜法的獨到之處在于它的高分離效能，實質是討論譜峰間的距離和譜峰的寬窄，即所謂色譜柱的高效性和高選擇性。這兩個性能指標的理論本質，是由組分在兩相中分配系數不同的熱力學過程和組分在兩相中擴散速度不同的動力學過程所決定的。因此，要達到多組分復雜混合物通過色譜柱理想地分離，就必須從熱力學和動力學兩個方面進行綜合性地研究；同

2、時對難分離物質要選擇最佳色譜分離條件，以達到快速分離的目的。1、色譜方法的分類 隨著色譜理論的不斷完善和色譜技術的進步，其分類方法眾多，常見的如下：用氣體作為流動相氣相色譜法Gas chromatography(GC)液相色譜法Liquid chromatography(LC)用液體作為流動相A、按兩相狀態分類：以流動相狀態為準劃分方法類型等十余種方法。 B、按樣品組分在兩相間分離機理分類: 利用組分在流動相和固定相之間的分離原理不同而命名的分類方法。吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠滲透色譜法離子色譜法超臨界流體色譜法2、色譜技術問題色譜技術有如下幾方面：進樣技術，特別是關于毛細管色譜的

3、進樣技術；色譜柱制備技術；固定相和流動相的選擇技術；多維色譜系統組合切換技術；流出組分檢測技術；程序升溫技術和剃度洗脫技術等。 這些技術都在實踐中得到了廣泛應用和繼續提高，是色譜工作的一個重要方面。3、色譜儀器 色譜儀器是驗證色譜理論和色譜技術應用的重要手段，也是建立各種分析方法的必須條件。上世紀90年代以來，色譜儀器的多樣化、高精化、智能化等程度日新月異。著名的色譜儀器廠家有：美國的安捷倫公司、日本的島津公司、waters公司等，國內的上海、大連等公司也生產了質量較高的色譜儀。4、色譜法的應用 由于色譜法獨具特點，使它在各領域中獲得廣泛的應用。石油化學環境科學和環境保護生物學、微生物化學、生

4、命科學食品工業、農林牧漁業醫學及醫藥學商品檢驗應用領域二、色譜法的本質及流程 1、 色譜法的本質色譜法的本質在于色譜柱高選擇性和高效能的分離作用與高檢測技術的結合。 混合組分的樣品在色譜柱中分離的依據是：同一時刻進入色譜柱中的各組分，由于在流動相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換等作用的不同，隨流動相在色譜柱中運行時，在兩相間進行反復多次（103106）地分配過程，使得原來分配系數具有微小差別的各組分，產生了保留能力明顯差異的效果，進而各組分在色譜柱中的移動速度就不同，經過一定長度的色譜柱后，彼此分離開來，最后按順序流出色譜柱而進入信號檢測器，在色譜數據機上顯示出各組分的色譜行為和譜峰數值

5、。2、 色譜方法的裝置系統流程色譜方法裝置流程圖見下圖5-記錄儀二、色譜法的本質及流程 1-流動相及控制裝置；2-流動相凈化器3-色譜柱4-檢測器三、色譜分析法的一般特點1、 高選擇性 色譜分析方法對那些性質極為相似的物質，如同位素、同系物和烴類異構體等有良好的分離效果。這種選擇分離，主要采用高選擇性固定液，使各組分間的分配系數能產生較大的差別而實現保留值不同。 2 、高效能 色譜分析法對那些沸點極為相近的多組分混合物和極其復雜的多組分混合物，有能力改善它們的峰形，使各組分彼此間有良好的分離效能。這種高效能作用,主要是通過色譜柱具有足夠的理論塔板數（填充柱為幾千塊/m，毛細管柱可達105106

6、塊/m）來實現的。3 、高靈敏性色譜分析法的高靈敏度檢測信號，表現在檢測器方面。目前在色譜界已出現幾十種檢測器，可檢測出10111013g的物質量。因此在痕量分析中可大顯功效 。 如 超 純 氣 體 、 高 純 試 劑 中 的ppmppb級的痕量雜質測定，測定大氣污染物中的ppbppt級的痕量毒物；測定 農 、 副 產 品 、 水 果 、 食 品 中 的ppmppb級的農藥殘留物。4、 分析速度快 色譜分析法，特別是氣相色譜法，分析速度較快。一般較為復雜的樣品可在幾分鐘到幾十分鐘內完成。而且現在的色譜儀器多數已實現自動化、計算機化，配以高速分離的色譜系統，分析速度會更快。5 、 GC與LC特點

7、之比較 兩種色譜法的根本區別在于流動相狀態。氣相色譜法多由永久性氣體作流動相，由于載氣相對分子質量低，分子間空隙大，故粘度低，流動性好，組分在氣相中運輸速度快，流動相滲透性強，因此可以增加柱長，提高色譜柱理論塔板數，從而增加柱效；氣體作流動相價格較液體的有機溶劑低廉；氣相色譜法可以選擇愈來愈多的合成新固定液；氣相色譜法分析的對象多為相對分子質量M1000、低沸點、易揮發、熱穩定性較好的化合物，而且，樣品必須在柱前變成氣態分子，否則不能隨載氣運輸分離。對于大分子、難揮發、熱穩定性差的化合物較為困難。裂解氣相色譜法可以對高分子化合物進行裂解后分離分析。 液相色譜法采用液體作流動相。適于作液相色譜的

8、流動相較僅有幾種惰性氣體的GC流動相多；流動相對樣品組分有較好的溶解作用，且參與溶質的分配，可增大分離的選擇性。液相色譜適于分析高沸點、難揮發、熱穩定性差的、分子量（M10002000）較大的液體化合物，樣品可直接進樣， 一般不需作樣品衍生化處理。 選擇好流動相是改善液相色譜分離的關鍵之一（液體種類繁多，選用二元或三元流動相時同時洗脫，改變載液的種類濃度、比例、極性、pH穩定等，則可以提高LC的分離度）；流動相因為是液體，所以密度較高，組分擴散系數（DL）低（大約占氣體的105），故LC分析速度慢；液體粘度大于氣體100多倍，傳質也較慢，故采用小顆粒，窄分布固定相和高壓泵強制流動相通過色譜柱以

9、獲得高效率分離；高效液相色譜有其獨特的檢測器，如紫外檢測器、示差檢測器、熒關檢測器等，它們都有高的靈敏度；高效液相色譜可進行大組分量制備，收集柱流出組分十分方便。四、色譜基本理論1、 色譜圖 色譜圖是色譜柱流出物通過檢測器系統時所產生的響應信號對時間或載氣流出體積的曲線圖。色譜圖是色譜基本參數的源流，可根據色譜圖中峰位置點進行定性，根據峰高或峰面積進行定量；根據各峰不同的位置及其峰寬變化狀態，可對色譜柱的分離性能進行評價，表征色譜操作條件的優劣。2、色譜圖相關名詞 （色譜）峰（Chromatographic）Peak色譜柱流出組分通過檢測器系統時所產生的響應信號的微分曲線。 峰底Peak ba

10、se 峰的起點與終點之間連接的直線（見圖3中的CD）。 峰高（h）Peak Height從峰最大值到峰底的距離（見圖3中的BE）。 峰寬（W）Peak Width在峰兩側拐點處作切線與峰底相交兩點之間的距離（見圖3中的KL）。 色譜流出曲線圖 半高峰寬（Wh/2）Peak Width at half height 通過峰高的中點作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側相交兩點之間的距離（見圖3中的HJ）。 峰面積（A）Peak area 峰與峰底之間的面積（見圖3中的CHEJDC）。 標準偏差（）Standard error 0.607倍峰高處所對應峰寬之一半。 拖尾峰Tailing Peak后沿較

11、前沿平緩的不對稱的峰。 前伸峰leading Peak前沿較后沿平緩的不對稱的峰。假峰Ghost Paek并非由試樣所產生的峰。畸形峰 Distorted Peak形狀不對稱的峰，如拖尾峰、前伸峰。基線Baseline 在正常操作條件下，僅有載氣通過檢測器系統時所產生的響應信號的曲線。基線漂移Baseline drift基線隨時間定向的緩慢變化。基線噪聲（N）Baseline noise由各種因素所引起的基線波動。三、色譜基本參數 1、 死時間（tM）Dead time 不被固定相滯留的組分，從進樣到出峰最大值所需的時間（見圖3中的tM）。2、 保留時間（tR）Retention time 組

12、分從進樣到出現峰最大值所需的時間（見圖3中的tR） 調整保留時間（tR）Adjusted retention time 減去死時間的保留時間（見圖3中的tR） tRtR.tM3、 死體積（VM）Dead Volume 不被固定相滯留的組分，從進樣到出現峰最大值所需的載氣體積。4、 保留體積（VR）Retention Volume組分從進樣到出現峰最大值所需的載氣體積。VR= tR.FC FC載氣流速（ml/min）。5、 柱效能Colume efficiency色譜柱在色譜分離過程中主要由動力學因素（操作參數）所決定的分離效能。通常用理論板高或有效板數表示。、理論板數（n）Number of

13、theoretical plate表示柱效能的物理量，可由下式計算n=5.54(tR/W)n=5.54(tR/W)2 2=16()=16()2 2、理論板高（H）Height equivalent to a theoretical plate單位理論板的長度。H=L/n 有效板數（neff）Number of effective plate減去死時間后表示柱效能的物理量，可由下式計算：neff5.54()5.54()2 2=16()=16()2 2色譜的定性分析 一般定性 1、用已知物直接對照法定性利用已知物直接對照法定性，是一種簡單可靠的定性方法，在具有已知標準物情況下常使用這種定性方法。該

14、方法定性的依據是：在一定的柱條件（柱長、固定相）操作條件下，組分有固定的保留值。因此，控制條件一定，比較已知物和未知物的保留值，就可方便地確定某一色譜峰是什么物質。A、利用保留時間和保留體積定性利用保留時間tR定性是最簡單地一種定性方法。只要準確測量未知物和標準物地保留時間進行比較，相同者為同一物質。利用保留時間定性，缺點是tR受操作條件影響大，載氣流速微小的波動、穩定微小的變化都會使tR改變，從而給定性帶來困難。用保留體積VR定性，不受載氣流速的影響，操作也很方便。B、用相對保留值定性利用保留時間或保留體積定性受條件影響大。保留體積雖不受流速影響，仍受其它操作條件影響。而相對保留值僅受柱溫、

15、固定相性質影響，柱長、填充情況、流速等均不影響ris值。因此在柱溫、固定相一定時，ris為定值，可作為定性的較為可靠的參數。C、用已知物增加峰高法定性如果樣品組成復雜，峰間距小，這時要準確定出保留值有一定困難，峰高增加法是在此條件下最可靠的定性方法。具體方法是：先進一樣品，得一譜圖，然后在樣品中加入一定量的標準物質，同樣條件下進一針標樣品，從新得到的譜圖上看，哪個峰高了，那么，該峰就是加入的標準物組分。2、色譜定量分析色譜分析的重要作用之一是對樣品定量。色譜法定量的依據是：組分的重量或在載氣中的濃度與檢測器的響應信號成正比。在此，響應信號指峰面積或峰高，表示為：wi=fiAi，其中wi為欲測組

16、分I的量，Ai為組分I的峰面積，fi為比例系數，在此稱為校正因子。因此，要準確定量，首先要準確測出峰面積與定量校正因子。定量校正因子是定量計算公式中的比例常數，其物理意義是單位峰面積所代表的被測組分的量。定量分析的依據是被測組分的量與響應信號成正比，但是，同一含量的不同物質，由于其物理、化學性質的差別，即使在同一檢測器上產生的信號大小也不同，直接用響應信號定量，必然產生較大誤差。因此提出了定量校正因子。定量校正因子對信號加以校正，校正后的峰面積可定量地代表物質的含量。A、 面積的測量 對稱峰面積的測量對稱色譜峰近似地看作一個等腰三角形等腰三角形，按照三角形求面積的方法，峰面積為AihiW，經驗

17、證明該方法計算的面積只有實際面積的0.94倍，故再乘一系數1.065，Ai1.065 hiW，這是目前應用較廣的計算法。1、 不對稱峰面積的測量在色譜分析中，經常會遇到不對稱峰，多數不對稱峰為拖尾峰，峰面積的計算方法為：取峰高0.15倍處和0.85倍處峰寬平均值，乘峰高：A=(W0.15h+W0.85h)h 峰高在定量分析中的作用峰高在定量分析中的作用峰高也可作為定量指標，對于一定的樣品，如果操作條件保持不變，在一定的進樣量范圍內，半高峰寬是不變的，峰高可直接代表組分的濃度，由峰高代替面積計算。方法快速、簡便，適用于固定不變的常規分析。與使用面積定量法比較，對于出峰早的組分，由于半高峰寬很小，

18、相對誤差大，這時用峰高定量更準確。對于出峰晚、峰較寬的組分，用峰面積定量更準確。百分含量的計算 1、 歸一化法歸一化法 歸一化法是常用的一種簡便、準確的定量方法。使用這種方法的條件是樣品中所有組分都出峰，將所有出峰組分的含量之和按100計，當測量參數為面積時，計算如下： xi%= =100 式中 xi-試樣中組分i的百分含量； fi-組分i的校正因子； Ai-組分i的峰面積。如果樣品中組分是同分異構體或同系物，已知校正因子近似相等，就可以不用校正因子，將面積直接歸一化，即可按下式計算：xi(%)= =100 xi(%)= =100 歸一化定量的優點是方法準確，進樣量的多少與結果無關，儀器與操作

19、條件對結果影響小。缺點是某些組分在所用檢測器上可能不出峰，樣品中含有沸點高，出峰很慢的組分，不需定量的個別組分可能分離不好，重疊在一起，影響面積的測量，使其應用受到一定程度的限制。2 2、 外標法外標法外標法又稱校正曲線法。用已知純樣品配成不同濃度的標準樣進行試驗，測量各種濃度下對應的峰高或峰面積，繪制響應信號百分含量標準曲線。分析時，進入同樣體積的分析樣品，從色譜圖上測出面積或峰高，從校正曲線上查出其百分含量。在一些工廠的常規分析中，樣品中各組分中的濃度一般變化不大，在檢量線通過原點時可不必做校正曲線，而用單點校正法來分析。即配制一個和被測組分含量十分接近的標準樣，定量進樣，由被測組分與外標

20、組分峰面積或峰高比求被測組分百分含量。xi= Ei式中 xi-試樣中組分i的含量； Ei標準樣中組分i的含量； AE標準樣中組分i的峰面積。該方法的優點是操作簡單和計算方便。缺點是儀器和操作條件對分析結果影響很大，不像歸一化和內標法定量操作中可以互相抵消。因此，標準曲線使用一段時間后應當校正。3、 內標法內標法當分析樣品不能全部出峰，不能用歸一法定量時，可考慮用內標法定量。方法：準確稱取樣品，選擇適宜的組分作為預測組分的參比物，也稱內標物。加入一定量的內標物，根據被測物和內標物的質量及在色譜圖上相應的峰面積比按下式求組分的含量;xi(%)=100式中 xi-試樣中組分I的百分含量； ms-加入

21、內標物的質量； As-內標物的峰面積； m-試樣的質量 Ai-組分I的峰面積；fsi=fi/fs。對內標物的要求是：不能與樣品或固定相發生反應；能與樣品完全互溶；與樣品組分很好的分離，又比較接近；加入內標的量要接近被測組分的含量；要準確稱量。內標法定量非常準確，主要缺點是：內標物不容易找到；每次需要用分析天平準確稱量內標和樣品，日常分析使用很不方便，樣品中多了一個內標物，顯然對分離的要求更高些。4、 疊加法疊加法又叫內加法，是以樣品中已有的組分做內標，比較該組分加入前后面積的改變，計算被測組分含量。其步驟如下：先做樣品色譜圖，然后在原樣品中定量加入含量較小組分的純樣品，同樣條件下，再進一色譜樣

22、得一色譜圖。定量分析誤差的來源 除峰面積與校正因子測量精度外，定量結果的準確性還受如下因素的影響：1、 樣品的穩定性及代表性樣品的穩定性及代表性樣品的代表性是得到準確定量結果的前提。 氣相色譜分析的許多樣品是氣體或揮發性液體，因此，要特別注意泄漏、揮發等問題，同時，從取樣到進樣要快速，盡量避免樣品組分的揮發損失。液相色譜取樣要注意樣品的均勻性，樣品是否完全溶解組成均勻的溶液，溶解樣品的溶劑最好就是流動相，或是與流動相互溶的溶劑。2、 進樣系統影響進樣系統影響采用定體積進樣法作定量分析，進樣的重復性是一個很關鍵的問題。對于氣體樣品，一般都采用進樣閥，重復性好，液體樣品一般用微量注射器。3、 柱系

23、統的影響柱系統的影響如果色譜柱不能將組分完全分離，有重疊峰或嚴重拖尾峰，那么，無論用何種測量方法也會有誤差。因此，保證色譜峰良好的分離是定量準確的必要條件。同時要注意保養柱子，以保證良好的重現性。4、 氣相色譜操作條件的影響、柱溫柱溫直接影響保留值和峰高，不同組分保留值的對數值隨柱溫變化的直線斜率是不同的，如果要減小柱溫造成的誤差，柱溫應控制在0.5范圍以內。、檢測溫度對于熱導池檢測器，溫度升高，靈敏度下降，它的影響比柱溫影響小，允許溫度變化1。、載氣流速的影響對于熱導池檢測器，是測量流動相中組分濃度的瞬間變化，即響應信號與流動相中組分濃度成正比。流速加大，濃度不變，故峰高與流速無關，峰面積與

24、流速成反比。對于氫火焰離子化檢測器，測量的是單位時間進入檢測器的物質量。流速加大，單位時間進入的量增大，峰高增加，面積與流速無關，因此在絕對定量時，用面積定量誤差小一些。高效液相色譜法高效液相色譜法 液相色譜是色譜中的一類分離與分析技術，其特點是以液體作為流動相。對于大量有機化合物、離子型化合物以及易受熱分解或失去活性的物質，不能直接或不適合用氣相色譜方法進行分析，因此高效液相色譜的應用領域不斷擴大和深入。特別是近幾十年來，液相色譜固定相的高度發展，儀器不斷更新，高效液相色譜目前已成為許多學科科學研究和日常分析的重要手段。一、高效液相色譜法的特點 1、高效液相色譜可以分離分析高極性，高分子量和

25、離子型的各種物質，只要被分析對象能夠溶解于可作為流動相的溶劑中并能夠被檢測，就可以直接進行分析。某些目前尚不能被直接檢測，或檢測靈敏度不夠的，也可以采用各種衍生技術，實現這些物質的檢測。2、高效液相色譜儀主要由高壓輸液泵、進樣閥、柱子和檢測器等組成。3、柱子的柱效（以理論板數計）很高，每米可達3萬塊以上。一般只使用2025cm長的柱子。由于填料的不斷發展和改進，目前最短的柱子只有3cm長，板數可達30004000。已能夠滿足一般分析的需要，并具有很高的分析速度。4、高效液相色譜儀通常在室溫下操作，樣品一般不須預處理，操作簡便，很容易掌握。5、高效液相色譜操作的難點在于流動相的選擇。可以采用純溶

26、劑，二元或多元混合溶劑作流動相。但流動相的選擇必須遵循一定的規律，并以科學的方法優選。6、高效液相色譜技術也存在一些問題。柱子價格昂貴，要消耗大量的溶劑，而且許多溶劑對人體是有害的。高效液相色譜儀的價格和損耗也比氣相色譜儀高。此外，尚缺少象氣相色譜中氫火焰離子化檢測器那樣的通用型、高靈敏度的檢測手段。因此，高效液相色譜無論在技術上，在理論上，還是在應用上都處于發展階段。二、高效液相色譜系統 下圖是高效液相色譜系統的示意圖。它由輸液泵為核心的輸液系統、進樣器、柱子和檢測器四個基本部分組成。實際儀器比圖要復雜得多，它們可能有幾個泵，幾種檢測器，自動進樣系統，柱和檢測器的溫度控制系統等。 1、 輸液

27、系統輸液系統的作用是向柱子提供壓力高，流速穩定的流動相。它以高壓輸液泵為核心，由溶劑儲槽、過濾器、輸液泵、梯度溶劑混合器等組成。為了測量系統流量和壓力，在輸液系統的輸出通路上還安裝了不同類型的傳感元件。儲液槽儲液槽是盛裝溶劑的容器。它可以是一個普通的溶劑瓶，或是一個專門設計的儲液槽，用于除去溶劑中的氣體。過濾器各種泵的柱塞、進樣閥的閥芯加工的精密度都非常高，微小的機械雜質將導致這些部件的損壞，而不能很好的工作。同時雜質在柱頭的積累還影響柱子的使用，增大柱壓，因此過濾溶劑，設置過濾器是必須的。過濾器的芯子通常是一個由多孔聚四氟乙烯制成的具有一定空隙度的圓柱體，鑲嵌在一個不銹鋼的殼體中，形成一個完

28、整的、安裝方便的部件。高壓輸液泵高壓輸液泵是現代液相色譜裝置中最關鍵的設備，輸出高壓溶劑是實現快速分析的前提。除了最高使用壓力外，還有線性流量范圍，輸出流量的精確度，泵的操作方式，流量輸出或壓力恒定的穩定性，以及易于操作和維修等。高效液相色譜儀中所用的泵可分為兩類：恒壓泵和恒流泵。恒壓泵主要指氣動放大泵，泵出口壓力在系統中是恒定的，流速由柱的阻力決定。恒流泵有往復泵和注射泵，這類泵輸出的溶劑流量恒定，柱前的壓力由柱后的阻力確定。目前使用最多的是往復泵。梯度洗脫裝置當樣品是一個含有不同種類組分的復雜混合物時，通常用一種純的或固定組成的混合溶劑難以實現滿意的分離，往往是先溜出來的峰分不開，而后溜出

29、來的峰保留時間太長。因此，在液相色譜中常在一個樣品的分析過程中，不斷調整混合溶劑的組成，改變溶劑強度或溶劑的選擇性。如果溶劑組成隨洗餾時間按一定規律變化，稱這種洗餾過程為梯度洗脫。梯度洗脫過程溶劑組成的變化可以是線性的，也可以是非線性的；可以是二元的，也可以是三元，甚至多元溶劑的混合。梯度洗脫裝置根據溶劑混合時的壓力分為兩種類型：低壓梯度和高壓梯度。低壓梯度是溶劑在常壓下混合，然后用一個高壓輸液泵把它輸送至柱系統中。多元溶劑在混合室或溶劑罐中混合，并以一定速度改變溶劑的組成。這種方式簡單、經濟，只能用往復泵。高壓梯度使用兩臺高壓輸液泵，每臺輸送一種溶劑，兩臺泵輸出的溶劑在一個混合室內混合。每臺

30、泵的溶劑流量由獨立的電路或計算機控制，它們按一定比例改變。對于梯度系統來說，關鍵是要保證流速的穩定，梯度洗脫重現性好。因此混合室的體積應盡可能地小，且不存在死角。進樣裝置在液相色譜中，進樣方式有微量注射器進樣，進樣閥進樣，自動進樣裝置等。高效液相色譜最主要的特點要求進樣器設計要耐高壓，死體積小，與溶劑接觸的部分具有很好的耐蝕性。 進樣口處的隔墊把系統和外界分開。為了使隔墊能承受上百公斤的壓力，頂蓋的通孔很細，而且長。在系統處于高壓時，用一根金屬棒壓住隔墊的通孔部分，避免內部壓力太大把隔墊沖破。液相色譜的進樣口目前大部分都是采用六通閥，六通閥進樣的原理如圖所示。 進樣時樣品中不應混入雜質。溶解樣

31、品的溶劑最好和使用的流動相一致，以防止溶劑變化出現不溶物而堵塞柱子。檢測器檢測器在色譜系統中非常重要。因為液相色譜系統的所有特性都通過檢測器的輸出信號表現出來。目前液相色譜儀常備的檢測器主要是紫外分光光度計和光二極管陣列檢測器，示差折光儀，熒光檢測器。紫外和示差折光檢測器是液相色譜最基本的檢測器，下面介紹這兩種檢測器的工作原理。紫外、可見紫外分光檢測器這種檢測器在液相色譜中應用最廣。幾乎是一切色譜儀必備的檢測器，它的特點是：噪音低、具有相對高的靈敏度、結構簡單、易于維修。紫外檢測器的工作原理是：當一束紫外光通過樣品池時，入射光的一部分被溶液中的某種物質吸收，吸收的多少取決于溶質的性質。溶質的濃

32、度和響應值之間存在線性關系。紫外檢測器有固定波長檢測器，可變波長檢測器兩種可變波長檢測器采用氘（do）燈或氘燈與鎢絲組合的光源，波長在190800nm范圍可調。示差折光檢測器示差檢測器的工作原理每一種物質在一定的溫度、壓力等條件下都有固定的折光指數。樣品組分從柱中洗餾出來與流動相組成一混合物，它的折光指數與純流動相或純溶質都不相同。示差折光檢測器就是以純溶劑作參照物，連續監測柱后洗餾物折光指數的變化，并根據變化的差值決定樣品中各組分的量由于折光指數具有加合性，任何溶劑都具有一定的折光指數，因此對所有物質都有響應，是通用型檢測器。三、高效液相色譜柱 1、 柱型目前液相色譜常用的標準柱型是內徑為4

33、.6或3.9mm,長度為2025cm的不銹鋼柱。柱流動相的體積流速是每分鐘1ml左右。填料顆粒度510m，柱效以理論板數計大約在700010000。液相色譜柱發展的趨勢，一是減少顆粒度（35m）提高柱效，縮短柱長，提高分析速度。另一方面是減小柱徑，節省溶劑用量，提高檢測濃度，特別是用于復雜組分的分析。2、 柱的選擇性柱的選擇性主要指柱固定相對分離的控制。固定相對不同類型的化合物有一定的選擇性。選擇固定相的一般標準還是以“相似相溶”原理為基礎。如果溶質溶于烴類溶劑，表明它是低極性化合物，這樣就可以選用非極性或亞極性固定相。若樣品溶于極性溶劑中，如醇類，則可選擇極性固定相，也可以選擇非極性固定相。

34、實際上，在液相色譜中，由于每一種分離方法所用固定相的種類很少，分離主要靠溶劑的選擇。由于十八烷基（ODS或C18）柱能夠用于多種化合物的分離，因此它是最常用的固定相。3、 柱效的評價 要實現對溶質分離，要求柱子具有很高的柱效。影響柱效的因素很多，對柱效的評價也就比較難，一般是測定它們的理論板數n，板數n主要依賴于保留時間（tR）與峰底寬度（Wb）的比值。Wb越窄，這項比值越大，柱效越高。同時還要考慮柱的滲透性，即操作條件下的最小進口壓力，以及峰的對稱性。商品柱子在出廠時都附有一張標準譜圖，根據所標明的條件，得到重復的譜圖，說明這根柱子是合格的。柱子經過長期使用或保存不當，柱子的性能會下降。突出

35、的表現是在給定溶質和溶劑等操作條件下，峰變寬且對稱性不好，可K值下降。計算峰不對稱性的方法見圖，峰不對稱性因子是在峰高10處測量的。如果柱子引起峰的不對稱性大于1.2，說明該柱子的質量不好了，若超過1.6，則這根柱子就不能再使用不能再使用了。四、液相色譜流動相及其選擇性 1、 流動相的作用 在給定固定相的情況下，溶質的保留和對溶質的分離主要由溶劑的性質決定。在液相色譜中，溶劑可以是非極性的，也可以是極性的。如果與固定相的極性相比，溶劑極性小于固定相的，稱這種色譜過程為正相液相色譜。如硅膠作為固定相，正己烷作為流動相的吸附色譜過程。如果與此相反，溶劑的極性大于固定相，如以ODS鍵合相作為固定相，

36、水和甲醇等作為流動相的分配色譜過程，稱為反相液相色譜。有的固定相，如NH2基鍵合相，可以使用非極性溶劑，極性溶劑，PH27的磷酸緩沖液作為流動相。因此，正相與反相的概念是相對的，取決于兩相極性的比較。 在液相色譜中溶劑還用來溶解樣品，并用于樣品的預處理中。總之，溶劑在液相色譜中是非常重要的，不應和氣相色譜中的載氣比較，因為后者只起攜帶樣品的作用。2、 作為流動相的溶劑性質溶劑的種類和數目是很多的，但是可作為流動相的溶劑的數目相對來說是很少的，說明溶劑的選擇在液相色譜中是比較不容易的。1所有的溶劑；2具有合適物理性質的溶劑；3K值合適的溶劑；4值合適的溶劑可作為流動相的溶劑至少應該具備如下一些性

37、質：、溶劑具有穩定的化學性質。它不能和固定相發生不可逆的化學反應，也不引起固定相表面活性基團的流失及基質的溶漲。除特殊的分配過程，溶劑只溶解樣品，而不發生化學反應。、溶劑的選擇與使用的檢測器要有相溶性。在使用紫外檢測器時，溶劑應該在選定的紫外區沒有吸收，或在溶質最大吸收波長段沒有吸收。使用示差折光檢測器時，溶質和溶劑的折光指數應有較大的差別，否則檢測靈敏度不夠高。、溶劑粘度既影響系統的壓降，也影響分析時間。因此使用粘度小的溶劑作為流動相在降低操作成本和加速分析時間方面具有明顯的意義。 溶劑可以從市場買到并易于純化。在某些分析中，特別是檢測靈敏度高時，溶劑的純度要求很高，所以溶劑應易于獲取并易于純化。 溶劑的沸點不應太低。如果沸點太低在溶劑傳輸過程中易出現氣泡，它將影響輸送流量的精度和混合溶劑的組成。 溶劑的毒性應盡可能小，并不易起火。大多數溶劑對人體都是有害的，因此操作者應該注意溶劑使用中的各種安全措施。 成本低。使用液相色譜分離或分析樣品要消耗大量的溶劑，這些溶劑使用后一般都不再回收，因此應盡可能使用低成本溶劑。3、 常用的溶劑 在日常工作中比較常用的溶劑是有限的十幾種，如表中列出的16種常用溶劑的性質，其它可選擇的溶劑還有：異丙醇、丁醇、異丁醇、環己烷、乙醚等。4、 緩沖溶液和流動相添加