1、植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課程論文 學(xué)號：A09130090題目：低溫脅迫對玉米抗寒性的影響學(xué)生姓名：劉洋任課教師：于晶所在班級：生科1301所在學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院東北農(nóng)業(yè)大學(xué)中國·哈爾濱2015年5月低溫脅迫對玉米抗寒性的影響生科1301 劉洋（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱，150030）摘要 對兩個(gè)玉米品種（九龍11號、利禾1號）進(jìn)行4低溫脅迫處理12h和24h，以0為對照，測量其葉綠素含量、過氧化物酶活性和電導(dǎo)率。結(jié)果表明，隨低溫處理時(shí)間增加，九龍的葉綠素含量先降低后上升，利禾葉綠素含量先升高后降低。九龍過氧化氫酶活性升高，利禾過氧化氫酶活性降低。兩種玉米傷害率均在處理12h時(shí)變?yōu)樽畲?/p>

2、的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種玉米在低溫脅迫下，均有不同程度的損害，在葉綠素含量、過氧化物酶活性和電導(dǎo)率這三個(gè)生理生化指標(biāo)在不同溫度下受到不同影響。關(guān)鍵詞 玉米 低溫脅迫 過氧化物酶 傷害率 葉綠素含量 前言 玉米屬于禾本科玉蜀黍族玉蜀黍?qū)儆衩追N，隨玉米逐漸傳到世界各地，現(xiàn)成為最重要的糧食作物之一。加強(qiáng)對低溫脅迫植物的各種生理現(xiàn)象的研究，了解植物的適應(yīng)和逆境傷害機(jī)制，并加以人為控制對于農(nóng)業(yè)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。低溫在一定程度上破壞細(xì)胞膜，從而影響膜系統(tǒng)的生理功能【1】。研究指出，大部分植物在溫度介于0-15之間時(shí)一系列生理功能被破壞【2】當(dāng)外界氣溫和地溫明顯低于玉米所需的適宜溫度，接近或超過其在這

3、一時(shí)期生理狀態(tài)所能忍受的極限最低溫就會造成脅迫和傷害。【3】同一植物不同品種間對寒冷的抗性也有顯著差異。【4】植物固著于某地生長，難以遷移，因此易于受到環(huán)境如凍害，冷害【5】等影響。 黑龍江屬于高寒地區(qū)，玉米是其主要農(nóng)作物之一，因此研究低溫對玉米產(chǎn)量有重大意義。1材料與方法1.1材料、儀器、試劑與用品1.1.1材料九龍11號、利禾1號玉米種子1.1.2儀器 分光光度計(jì)；天平；研缽；漏斗；濾紙；離心機(jī)；電導(dǎo)率儀；注射器；剪子；離心管;刻度試管；移液管(0.1ml，1ml，2ml，5ml，10ml)；比色杯；燒杯；吸耳球;冰箱（-20，4）；微波爐；容量瓶（25ml）；恒溫箱(37);打孔器。 1

4、.1.3試劑與用品： 蒸餾水；0.05mol/L磷酸緩沖鹽溶液（pH=5.5）；0.05mol/L愈創(chuàng)木酚；2%H2O2; 20%三氯乙酸；95%乙醇。1.2方法 1.2.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備1.2.1.1玉米的種植 各取300粒九龍11號與利禾1號玉米種子裝入大燒杯中，先用95%乙醇浸泡消毒，再用蒸餾水沖洗一遍，隨后將蒸餾水注滿整個(gè)燒杯，放入37恒溫箱中12h。將水倒掉，沖洗種子，在頂部用濕濾紙蓋住。每十二小時(shí)進(jìn)行一次觀察，既要保持濾紙潮濕，又要保證當(dāng)種子出芽后即時(shí)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，并在其中加水至沒過種子一半處。待芽張長后，轉(zhuǎn)入沙土培養(yǎng)基中，保持光照與沙土濕潤。1.2.1.2預(yù)處理 在做實(shí)驗(yàn)前12h與

5、24h時(shí)，分別取合適數(shù)量（本實(shí)驗(yàn)各取7株）的九龍11號與利禾1號玉米苗，轉(zhuǎn)入4的冰箱中。1.2.2 植物組織中過氧化物酶活性測定1.2.2.1酶液的制備 分別稱取0.5克九龍11號與利禾1號玉米葉片，剪碎，放入研缽中，加適量的磷酸鹽緩沖溶液，研磨成勻漿。將全部勻漿轉(zhuǎn)入離心管中，4000rpm，離心10分鐘，取上清液定容至10ml。1.2.2.1過氧化物酶活性測定 酶活性測定的反應(yīng)體系包括2.9ml 0.05mol/L磷酸緩沖鹽溶液（pH=5.5），1.0ml 2%H2O2，1.0ml 0.05mol/L愈創(chuàng)木酚和0.1ml酶液。用加熱至沸騰的酶液作對照。反應(yīng)體系加入酶液后，立即放入37恒溫箱中

6、保溫15分鐘。之后加入20%三氯乙酸終止反應(yīng)，然后于470nm波長下測定吸光值。1.2.2.2計(jì)算公式 過氧化氫酶活性=（A470*VT）/(0.01*W*VS*t) A470:反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化 VT：酶液總體積（ml） W：樣品鮮重（g） VS：反應(yīng)所用酶液體積（ml） t:反應(yīng)時(shí)間（min）1.2.3 電導(dǎo)法測定植物細(xì)胞質(zhì)膜透性1.2.3.1容器洗滌 電導(dǎo)法對水和容器的潔凈度要求嚴(yán)格，所用容器必須清洗干凈，再測試實(shí)驗(yàn)所用蒸餾水的電導(dǎo)值（S0）。1.2.3.2材料處理 分別稱取1.0克九龍11號與利禾1號玉米葉片，分成兩份，一份放入-20冰箱中冷凍15分鐘，另一份放在常溫下。1.2.3

7、.3測定 先蒸餾水沖洗葉片，再用濾紙吸凈水份。用打孔器避開主脈打取圓葉片，每份20片，放入燒杯中。將每份燒杯中葉片倒入注射器中，加入10ml蒸餾水，進(jìn)行抽氣，直至所有葉片均不漂浮說明葉片中氣體全部除去，倒回小燒杯中。再加入10ml蒸餾水，室溫下靜置10分鐘，并不斷搖晃。10分鐘后，用電導(dǎo)率儀測試初電導(dǎo)值（S1），測試后放入微波爐中加熱一分鐘，冷卻后再測試其電導(dǎo)值（S2）1.2.3.4計(jì)算 相對電導(dǎo)率L=（S1-S0）/(S2-S0) 傷害率（%）=（Lt-Lck）/(1-Lck) S0:蒸餾水電導(dǎo)率 S：煮沸前電導(dǎo)率 S2：煮沸后電導(dǎo)率 Lt：低溫處理葉片相對電導(dǎo)率 Lck：對照葉片的相對電導(dǎo)

8、率1.2.4葉綠體色素含量的測定1.2.4.1色素的提取 分別稱取0.2克九龍11號與利禾1號玉米葉片，剪碎放入研缽中，加入少量石英砂和碳酸鈣及3ml 95%乙醇，研成勻漿，再加入5ml 95%乙醇，繼續(xù)研磨至組織變白。室溫靜置3-5分鐘后移入10ml離心管中，4000r·min-1，離心5分鐘。取上清液用95%乙醇定容至25ml。1.2.4.2測定吸光度 取葉綠素提取液導(dǎo)入比色杯中，以95%乙醇為空白組，在波長665nm，649nm下，分別測出吸光度1.2.4.3計(jì)算 CA=13.95A665-6.88A649; CB=24.96A649-7.32A665; CT=CA+CB 葉綠

9、素含量（mg/g）=濃度（mg/L）*提取液總體積/重量（g）/10002結(jié)果與分析2.1植物組織中過氧化物酶活性測定結(jié)果數(shù)據(jù)記錄表原始數(shù)據(jù)九龍利禾0h0.1010.2170.0870.22412h0.1380.1730.130.1724h0.1310.1540.1390.158平均過氧化氫酶吸光值A(chǔ)470A4700h0.0940.22112h0.1340.17124h0.1350.156 表一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表二過氧化氫酶九龍活性（）利禾活性（）0h125.33294.67表三圖一2.2小結(jié)1： 過氧化物酶是由植物所產(chǎn)生的一類氧化還原酶，主要存在，主要存在于過氧化物酶體中，可以催化過氧化氫氧化酚類和

10、胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類的毒性作用。過氧化物酶能夠清除體內(nèi)的活性氧，減少活性氧對植物的傷害，因此，通過過氧化物酶活性判斷植物的抗逆性。【6】 九龍過氧化物酶活性隨低溫處理時(shí)間的增加而增加，而利和過氧化物酶活性隨低溫處理時(shí)間的增長而減少，這說明九龍玉米對低溫具有一定的耐受性，抗逆性較強(qiáng)，而利和玉米對低溫不具有耐受性或耐受性較差，說明利和玉米的抗逆性較差。2.3電導(dǎo)法測定植物細(xì)胞質(zhì)膜透性測定結(jié)果原始數(shù)據(jù)記錄表初始數(shù)據(jù)九龍利禾S0電導(dǎo)率S1S2S1S24.610h35.324461.628312h93.8282127.431824h86.135879.5340表四實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)論數(shù)據(jù)九龍

11、利禾相對電導(dǎo)率L1（s/cm）傷害率L2（s/cm）傷害率0h0.128 0.205 12h0.32222.18%0.39223.53%24h0.23111.75%0.2232.34%表五圖二 2.4小結(jié)二：植物細(xì)胞膜系統(tǒng)是冷害過程最敏感部位。細(xì)胞膜在低溫下由液相轉(zhuǎn)變?yōu)槟z相，膜外形和厚度發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性上升，膜酶和酶系功能改變，引起細(xì)胞代謝紊亂。低溫脅迫引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞是導(dǎo)致植物冷害損傷和死亡的根本原因，而膜系統(tǒng)修復(fù)能力是膜功能得到有效行使的關(guān)鍵。相關(guān)研究表明，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與玉米品種的耐寒性呈正相關(guān)，耐寒性強(qiáng)的玉米品種膜透性增大程度較慢，而耐寒性弱的品種膜透性增大迅速，造成細(xì)

12、胞膜嚴(yán)重?fù)p傷【7】 水中的含鹽量越大，水的導(dǎo)電性越強(qiáng)。故根據(jù)導(dǎo)電率的大小可以推斷傷害率的大小。電導(dǎo)率越大，表明玉米葉片受到傷害的程度也越大。【8】從上圖表中我們可以看出，在4的冷凍處理的條件下，無論九龍還是利禾，其12h的傷害率高于24h的傷害率。12h的傷害率大于24h傷害率的原因是由于植物利用自身的修復(fù)能力可將受損細(xì)胞流失的有機(jī)物質(zhì)再利用，使得傷害率降低。12h二者傷害率接近，24小時(shí)利禾的傷害率遠(yuǎn)小于九龍，說明利禾的自身修復(fù)功能更強(qiáng)。2.5葉綠體色素含量的測定原始數(shù)據(jù)九龍利禾葉綠素吸光值A(chǔ)649A665A649A6650h0.4441.0340.4391.0420.4421.0480.4

13、391.0460.4531.0280.4441.05112h0.3330.7150.5971.3870.3190.6820.5771.3770.3460.7490.5971.39224h0.430 0.9460.4671.1350.4430.9490.4681.1410.4410.9650.4641.136表六實(shí)驗(yàn)結(jié)果九龍葉綠素含量測定CA(mg/L)CB(mg/L)葉綠素含量(mg/g)0h11.26 4.04 1.91 12h7.68 3.08 1.35 24h10.30 3.88 1.77 利禾葉綠素含量測定CA(mg/L)CB(mg/L)葉綠素含量(mg/g)0h11.56 3.35

14、1.86 12h15.26 4.59 2.48 24h12.66 3.31 2.00 表七圖三2.6小結(jié)3： 正常狀況下，隨著低溫處理時(shí)間的增加，植物體葉綠素遭到破壞，其含量降低。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，九龍玉米在低溫處理12h的時(shí)候，其葉綠素含量低于24h；利禾玉米，在低溫處理12h的時(shí)候，其葉綠素含量高于0h和12h，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)期不同。由于前兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證明利禾比九龍抗逆性強(qiáng)，且高溫會破壞葉綠素，所以在低溫處理12h后，利禾玉米葉片中葉綠素分解減弱，在低溫處理12h的時(shí)候，其葉綠素含量高于0h和24h。九龍玉米葉片由于具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，對逆境的忍耐能力高，同時(shí)十二小時(shí)的幼苗是經(jīng)歷的黑夜，二十四

15、小時(shí)的幼苗經(jīng)歷的是一晝夜，經(jīng)歷的時(shí)間段不同可能也會對葉綠素含量產(chǎn)生影響。3 結(jié)論與討論 3.1結(jié)論 過氧化物酶普遍存在于植物體各組織中，是一種對環(huán)境條件十分敏感的氧化酶類。【9】低溫脅迫下，植物葉片中的過氧化物酶的活性越大，膜的穩(wěn)定性越強(qiáng)，植物的抗寒性越強(qiáng)；若過氧化物酶的活性越小，則植物膜的穩(wěn)定性越弱，傷害越大。 各種逆境作用首先作用于細(xì)胞膜，低溫脅迫下，膜的結(jié)構(gòu)受到損傷，導(dǎo)致膜透性增大，電解質(zhì)溶液外滲，電導(dǎo)率增大，能夠比較客觀的反映出植物在低溫逆境中受損傷的程度。所測得的電導(dǎo)率越大，說明植物葉片的抗寒性越弱，植物組織所受傷害越大；電導(dǎo)率越小，植物葉片的抗寒性越強(qiáng)，傷害越小。 植物受到低溫傷害

16、，光合系統(tǒng)遭受攻擊，光合系統(tǒng)的破壞使光合電子傳遞鏈相關(guān)產(chǎn)物積累，進(jìn)而對光合系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用，同時(shí)破壞類囊體內(nèi)的葉綠素【10】由于低溫，使生理代謝過程中產(chǎn)生的某些毒物積累不能及時(shí)清除，這正是受到低溫脅迫的植物葉綠素含量低的一個(gè)原因【11】。3.2分析本次試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)與理論預(yù)期中的個(gè)別數(shù)據(jù)差別較大，可能原因如下：1. 不同操作人員的操作手法不完全相同；2. 選取實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量過少導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不具有代表性；3. 同一品種的不同個(gè)體間也存在差異,同一品種的不同部位間也存在差異；4. 在逆境培養(yǎng)中沒有注意對光照等一些變量保持一致。參考文獻(xiàn)【1】王忠 植物生理學(xué)【M】.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000，432.【2】Fitter A H,R K M.Hay Environmental Physiology of plants M Academic Press 1981,171-197.【3】孫寶啟 郭天財(cái)，曹廣才，中國北方玉米，2004.5（1）：196-197 .【4】李合生 蒼晶等。植物的逆境生理【J】。植物生理學(xué)（第三版）. 2011,12.2.1.1,361【5】李合生 夏凱等。植物的逆境生理【J】。植物生理學(xué)（第三版）. 2011,12,355【6】蒼晶 趙會杰。植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程，高等教育出版社，2013.4