1、淺析HPLC法測定陜西女貞子中齊墩果酸與熊果酸的含量         【摘要】  目的 測定陜西境內不同產地、不同生長期女貞子中齊墩果酸與熊果酸的含量。方法 采收陜西境內關中3市(渭南、西安、寶雞)與陜南2市(安康、漢中)10月產女貞子；并采收西安8、9、10、11和12月產女貞子,去雜質陰干,室溫密閉貯藏。采用HPLC法,Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm,5 m) 色譜柱,Waters600高效液相色譜儀,流動相為乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(5030200.020.

2、04),流速1 mL/min。建立標準工作曲線,檢測各地、各時間點樣品中齊墩果酸和熊果酸含量。結果 安康產女貞子中齊墩果酸與熊果酸含量均達到同期最高。不同生長期女貞子在10月份出現齊墩果酸含量最高值；而熊果酸在幼果中(8月)含量最高并隨生長期延長逐漸下降。到12月時二者含量均降至最低。結論 女貞子在不同產地、不同生長期齊墩果酸和熊果酸的含量是不同的,故在實際應用時應根據不同需要適時采收。 【關鍵詞】  女貞子；陜西；齊墩果酸；熊果酸；高效液相色譜法    Abstract：Objective To determine oleanolic acid (OA

3、) and ursolic acid (UA) from Fructus Ligustri Lucidi in diffrernt habitat and various growing stages. Method We picked the fruits of Fructus Ligustri Lucidi in  Otober in five cities of Shanxi, and in August, September, October, November and December in Xian. Removed impurities and storaged the

4、 fruits under room temperature .By HPLC with Waters 600 as its chromatographic system, and Lichrospher C18 (4.6 mm×250 mm, 5 m) column was applied with CH3CN-CH3OH-H2O-H3PO4-(C2H5)3N (5030200.020.04) as its mobile phase, the flow rate was 1 mL/min. The standard working curve was made to determi

5、ne the contents of OA and UA at different habitat and different time spot from samples. Result The contents of OA and UA were highest in Ankang city. During prolonging growing stages, the highest contents of OA and UA were October and August, respectively. They both reduced to the lowest point in De

6、cember. Conclusion The contents of OA and UA changed in different habitat and diffrernt growing stages of Fructus Ligustri Lucidi. It was suggested that we should mainly base on the highest contents to select the harvest time according to our demands.   Key words：Fructus Ligustri Lucidi；Sh

7、anxi；habitat；growing stages；oleanolic acid；ursolic acid；HPLC   女貞子是木犀科植物女貞(Ligustrum lucidum Ait.)的果實,在我國藥材資源豐富,具有滋補肝腎、明目烏發之功效1。女貞子中含有齊墩果酸、熊果酸、甘露醇、多糖及微量元素等多種成分,已見的報道中齊墩果酸與熊果酸是其發揮藥理作用的主要有效成分。這兩種成分的含量與女貞子的生長空間、時間的變化密切相關。本實驗測定陜西境內不同地點、不同生長期女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量,對于指導該藥的采收時間及合理應用具有實際意義。1  臨床資料&#

8、160;  Waters600高效液相色譜,2996二極管陣列檢測器,7725i手動定量進樣閥,Empower軟件。Agilent微量進樣器。R200D電子分析天平(德國Sartorius公司)。250LH超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)。   流動相所用甲醇、乙腈均為色譜純(美國Fisher公司),超純水(美國Millipore純水系統)；磷酸、三乙胺(AR,西安化學試劑廠)。齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢驗所,批號110709-200304)；熊果酸對照品(中國藥品生物制品檢驗所,批號110742-200415)。女貞子藥材采自陜西境內不同產地,經

9、陜西省藥品檢驗所鑒定該藥材系木犀科植物女貞(Ligustrum lucidum Ait.)的果實。2  方法與結果2.1  色譜條件   色譜柱Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm,5 m,江蘇漢邦公司)；流動相：乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(5030200.020.04)；流速：1 mL/min；檢測波長：205 nm；柱溫：室溫；進樣量：20 L。2.2  對照品溶液的制備   精密稱取齊墩果酸與熊果酸對照品12.68、5.12 mg,分別置25 mL容量瓶中,加甲醇制成每1 mL分別含0

10、.507 2 mg齊墩果酸與0.204 8 mg熊果酸的混合溶液,搖勻,即得對照品貯備液,備用。2.3  供試品溶液的制備    精密稱取過65目篩的女貞子干燥粉末0.2 g,加甲醇50 mL,稱重,超聲處理30 min,取出,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,經0.45 m微孔濾膜過濾,即得供試品溶液。2.4  線性關系考察   精密吸取2.2項下對照品貯備液1、2、3、4、5 mL,分別置于10 mL容量瓶中,甲醇定容,搖勻,得5個不同濃度的混合對照品溶液。分別精密吸取20 L,按上述色譜條件進樣分析。以濃度

11、X(g/mL)為橫坐標、峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線并計算回歸方程。回歸方程為：齊墩果酸Y=12 373.29X+108 249.93, r=0.999 6；熊果酸Y=12 098.02X+85 955.73,r=0.999 8。結果表明：齊墩果酸在50.72253.6 g、熊果酸在20.48102.4 g呈良好的線性關系。2.5  精密度試驗   精密吸取同一混合對照品溶液20 L,按上述色譜條件,重復進樣5次,測得齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為1.3%、2.2%。        

12、60; 2.6  穩定性試驗   取同一供試品,按供試品溶液的制備方法操作,分別于0、1、2、4、8 h精密吸取20 L進樣,測得齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為1.7%、2.3%。結果表明,供試品溶液在8 h內穩定性較好。2.7  重復性試驗   精密稱取同一樣品10月樣(3)5份,按供試品溶液制備方法分別制備5份供試品溶液,測得齊墩果酸、熊果酸含量的RSD分別為0.64%、2.9%。2.8  加樣回收率試驗   取已知含量的供試品5份,分別精密加入一定量齊墩果酸與熊果酸對照品,照供試品溶液的制備方

13、法進行處理,按上述測定方法進行測定,計算回收率。結果見表1。表1  加樣回收率試驗結果(略)2.9  樣品含量測定   取不同產地、不同生長期的女貞子樣品0.2 g,按2.3項下方法制成供試品溶液,在上述色譜條件下,每個樣品重復測定5次,測量峰面積并用外標法計算樣品中齊墩果酸與熊果酸的含量。對照品和樣品的高效液相色譜圖見圖1,樣品含量測定結果見表2、表3。表2  陜西境內不同產地女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量（略）表3  西安產不同生長期女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量（略）3  討論3.1  空間環境對植物的影響(

14、不同產地)   由表2可見,陜西地區在同一時期安康產女貞子中的齊墩果酸和熊果酸的含量最高,這與當地的氣候環境(氣溫、日照、土壤)等因素有關。女貞子屬常綠植物,適宜生長在溫暖潮濕的環境,陜北最冷月1月平均氣溫為-10-4 ,故女貞子不適宜在陜北生長。本次研究未涉及陜北地區。3.2  時間變化對植物的影響(不同生長期)   通常認為女貞子在12月冬至前后果實紫黑色且飽滿即為成熟,并大多在此時采收。由表3可見,不同生長期女貞子在10月份出現齊墩果酸含量最高值；而熊果酸在幼果中(8月)含量最高并隨生長期延長逐漸下降。到12月時二者含量均降至最低。故中藥

15、材的采收應考慮其有效成分含量的動態變化,再結合其產率,以保證藥物能發揮最大的療效和節約資源。3.3  流動相的選擇   齊墩果酸和熊果酸為五環三萜類同分異構體,在中性流動相中三萜酸可解離,很難分離。參考文獻2-3實驗中曾采用的甲醇-水(9010)、乙腈-水(8020)、乙腈-水-磷酸(75250.02)、甲醇-0.5%醋酸銨溶液(9010)、乙腈-0.5%冰醋酸(7525)、乙腈-甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(5030200.020.04)等多種流動相,分離效果均不理想。其中選擇冰醋酸峰形較平,故選用磷酸。通過加入適量磷酸和三乙胺調節流動相pH值,可抑制齊墩果酸和熊果酸的解離,改善色譜峰的峰形,且pH值對齊墩果酸和熊果酸的分離有較大影響。經過反復實驗,最終選擇乙腈-甲醇-