1、病毒的純化和保存病毒純化目的(了解)n為了了解病毒的結構、傳染與免疫、遺傳與變異等性質，常常需要高純度的病毒病毒純化原理病毒純化原理(熟悉熟悉)n利用物理或化學的方法盡可能地去除宿主細胞中的組分，將病毒從其宿主細胞內提純出來，在純化過程中保持病毒的生物活性生物活性和感染性感染性。病毒純化的一般原則病毒純化的一般原則(熟悉熟悉)n1、釋放病毒到胞外、釋放病毒到胞外 1.1 容易釋放病毒(培養液/尿囊液) 1.2 不容易釋放病毒(細胞破碎)n2、去除細胞碎塊、去除細胞碎塊 低速離心，以20006000r/min離心3040分鐘，可除去90以上的細胞碎片和雜質 n3、病毒懸液濃縮、病毒懸液濃縮細胞破

2、碎方法細胞破碎方法(熟悉熟悉)n超聲破碎：密集的小氣泡迅速炸裂，破壞細胞n高壓勻漿：機械切割力n高速珠磨：玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑 n酶溶法：溶菌酶、蛋白酶、葡聚糖酶n化學滲透：滲透壓改變使細胞破裂n反復凍融：形成冰晶，使細胞膨脹破裂 病毒純化方法病毒純化方法聚乙二醇(PEG)濃縮法nPEG是環氧乙烷和水縮合而成的水溶性非離子聚合物，無毒、無刺激性。n平均分子量不同，性質也有差異。分子量200600者常溫下是無色無臭粘稠液體，分子量在600以上者就逐漸變為半固體狀、蠟狀固體。n隨著分子量的增大，其吸濕能力相應降低。 不同分子量PEG性質比較聚乙二醇(PEG)濃縮法(掌握)n分子量200

3、06000的PEG用于病毒濃縮n PEG可使病毒顆粒形成多聚體，較低離心力即可沉淀 n(1)直接加入法 病毒懸液量少時候使用此法； 病毒懸液中加入8%-10%的PEG聚乙二醇(PEG)濃縮法(掌握)n(2)液體濃縮法 聚乙二醇(PEG)濃縮法(掌握)n(3)固體濃縮法 將PEG固體覆蓋于裝有病毒懸液的透析袋上，進行濃縮。 透析袋孔徑大小超過濾法(熟悉)n原理：利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過，將大分子或病毒等顆粒截留。n超濾膜孔徑要比病毒顆粒小n只能去除比病毒小的細胞碎塊吸附法(熟悉)n原理：病毒顆粒表面離子與吸附劑有親和性，病毒吸附之后，使用適當的條件將病毒洗脫下來。n吸附劑必須具備的特點：

4、較大的表面積和吸附能力； 較高的吸附選擇性； 便于洗脫； 性質穩定；凝膠吸附法-磷酸鈣凝膠n常用的凝膠，由0.5 mol/L CaCl2和0.5 mol/L Na2HPO4溶液混合制備凝膠狀沉淀物，用0.001 mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮，置于445天，使之充分沉淀后應用。凝膠吸附法-氫氧化鋅凝膠n是由7 mol/L氨水與0.1 mol/L醋酸鋅溶液滴加混合(pH8.5)制備，在制備后數小時內較穩定。n方法：將水泡性口炎病毒懸液與氫氧化鋅凝膠混合，使它們形成復合體后沉淀，然后用0.08mol/L EDTA(pH8.5)解離回收病毒。 凝膠吸附法-焦磷酸鎂凝膠n是由0.1 mol/L焦磷酸鈉和0

5、.1 mol/L MgCl2，以2：10(體積)比例在室溫中緩慢滴加混合而獲得的較穩定的焦磷酸鎂凝膠。n將牛痘病毒懸液同此凝膠混合，使病毒吸附于凝膠，然后用0.1 mol/L鹽水洗2次，最后用0.3 mol/L枸櫞酸鈉溶液解離病毒，將病毒較好地回收于水相中。 紅細胞吸附法(熟悉)n用于某些與紅細胞吸附的病毒的濃縮n選擇適宜的動物紅細胞：雞紅細胞n基本步驟：1) 1%-3%的紅細胞與病毒懸液混合，2吸附1h以上； 2) 1000 r/min 離心10分鐘，沉淀吸附病毒的紅細胞，棄上清，生理鹽水洗滌2次； 3) 用1/50原體積的磷酸緩沖液重懸紅細胞沉淀，在37保溫2-3h； 4) 1000 r/

6、min 離心10分鐘，上清即是濃縮的病毒懸液。葡聚糖柱層析法(熟悉)n葡聚糖凝膠是指由葡聚糖與其它交聯劑交聯而成的凝膠。n最常見的是Sephadex 系列，主要型號是G-10 G-200，后面的數字是凝膠的吸水率(單位是mL / g 干膠)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干膠。 葡聚糖柱層析法(熟悉)nSephadex 的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號的Sephadex 的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離范圍也不同。數字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。 G-25 分離范圍 1000-5000 適用于脫鹽、肽與其它小分子的分離； G-200 分離范圍

7、5000-600000 適用于蛋白分離純化、分子量測定、平衡常數測定。 葡聚糖柱層析法n將初步濃縮的材料，通過葡聚糖G150或G200柱層析，然后用0.020.15 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.6)洗脫，分部收集，測定280nm波長處的OD值，滴定各部分的效價，將含病毒的各部分相混合，再濃縮，透析之后，即可得到比較純的病毒。nNagano(1989年)用Sephacryls-1000柱層析純化了雞傳染性支氣管炎病毒。 葡聚糖柱層析法差速離心法(掌握)n原理：不同大小和比重的粒子有不同的沉降速度n適合分離沉降速度差別較大的粒子n適用于從組織培養液、雞胚尿囊液或經過紅細胞吸附-釋放的病毒懸液中

8、提純病毒。n優點：能迅速處理大量樣品，作為病毒提純精制的第一步n常用方法(熟悉)：以低速(2000-3000 r/min)及中速(10000 r/min)離心20-30分鐘去除較大的宿主細胞碎片、污染的細菌及其它較大的雜質，再選擇較高速度離心1-2h使病毒沉淀。差速離心法密度梯度離心n原理：將樣品加在惰性密度梯度介質上進行超速離心，在一定的離心力下把樣品顆粒分配到密度梯度介質中相等密度層中，吸出目的顆粒所在的介質層，從而達到分離純化的目的。n常用的介質為氯化銫CsCl、蔗糖 1040蔗糖密度梯度制備 n首先配置好不同百分比(w/v)的蔗糖溶液，然后在離心管中先加入濃度最小（10%）的溶液，然后

9、用吸管加入濃度稍大的溶液，注意，加時吸管要插入離心管的底部，緩慢加入，務求界面分明。然后按上法依次分層加入其余各濃度的蔗糖溶液，即可配成蔗糖梯度液。n將事先用更低密度蔗糖溶液（小于10%）懸浮的樣品輕輕加入10%蔗糖溶液的表面，進行密度梯度離心即可。梯度混合儀等密度梯度離心(掌握)n原理：與密度梯度法相同，但不制備梯度介質，而是在樣品中加入CsCl，離心過程中CsCl隨離心力而下沉，形成連續密度梯度，樣品中顆粒隨其密度大小而下沉或上浮到相等密度梯層中。n每毫升病毒懸液加1g的CsCl，混勻，40000g離心24-36h。病毒蛋白的分離SDS-PAGEnPAGE：聚丙烯酰胺凝膠電泳 Poly-A

10、crylamide Gel Electrophoresis 以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術。PAGE：聚丙烯酰胺凝膠電泳n聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。n催化聚合的常用方法：化學聚合法。化學聚合以過硫酸銨（APS）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產生自由基，后者引發丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲叉鍵交聯，從而形成三維網狀結構。連續與不連續PAGEPAGE按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應分為連續系統和不連續系統兩大類。 連續系統電泳體系中

11、緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。 不連續PAGEn不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳是指使用不同孔徑和不同緩沖系統的電泳，它由濃縮膠和分離膠兩部分所組成。由于濃縮膠的堆積（濃縮）作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度的凝膠上進行分離。n樣品顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較連續電泳系統佳。SDS-PAGEnSDS：十二烷基磺酸鈉 (重點)SDS是陰離子去垢劑，使蛋白質變性解聚，并與蛋白質結合成帶強負電荷的復合物，掩蓋了蛋白質之間原有電荷的差異，使各種蛋白質的電荷質量比值都相同

12、，因而在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時遷移率主要取決于蛋白質分子大小。SDS-PAGEn也稱變性PAGEn通常采用不連續垂直型系統 濃縮膠、分離膠濃縮膠濃縮膠分離膠分離膠首次應用SDS-PAGE的論文(了解)nLaemmli UK (1970).Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.SDS-PAGE實驗步驟(熟悉)1、清洗、烘干、組裝 電泳器材SDS-PAGE實驗步驟2、1%瓊脂封底SDS-PAGE實驗步驟3、配制分離膠SDS-PA

13、GE實驗步驟4、灌注分離膠灌注完后，加水覆蓋隔絕空氣，同時可使界面平整一般20-30分鐘凝固SDS-PAGE實驗步驟5、配制、灌注濃縮膠，插上梳子SDS-PAGE實驗步驟5、往電泳槽加電泳緩沖液，上樣2上樣緩沖液(樣品溶解液 Loading Buffer)：SDS,琉基乙醇，甘油，溴酚藍，Tris-HCl緩沖溶液。蛋白樣品與上樣緩沖液1:1混合，沸水浴3分鐘，離心，上樣其中一個上樣孔：蛋白分子量標準n電泳緩沖液(電極緩沖液)包含SDSn一般配制成10或5SDS-PAGE實驗步驟6、連接電源，電泳開始SDS-PAGE實驗步驟7、電泳結束，剝膠，染色，脫色染色液：考馬斯亮藍； 銀染法用硝酸銀脫色液

14、：甲醇/異丙醇+醋酸按下式計算相對遷移率： 每個蛋白標準的分子量對數對它的相對遷移率作圖得標準曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分子量，這樣的標難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。= 蛋白樣品距加樣端遷移距離cm溴酚藍區帶中心距加樣端距離cm 相對遷移率8、蛋白相對分子質量測定(重點) 當蛋白質的分子量在15,000200,000之間時，樣品的遷移率與其分子量的對數呈線性關系。 符合如下方程式：Lg MW =b m R + K 其中，MW 為蛋白質的分子量，m R 為相對遷移率，b為斜率，K為截距。當條件一定時，b與K均為常數 因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較，就可

15、以得出未知蛋白的分子量SDS-PAGE實驗步驟8、蛋白相對分子質量測定 蛋白質電泳 常用的SDS-PAGE：單一亞基組成的蛋白質 非變性PAGE：多個不同亞基組成的蛋白質 未聚合的聚丙烯酰胺具有神經毒性，未聚合的聚丙烯酰胺具有神經毒性，操作時要戴手套操作時要戴手套Western Blot 蛋白質鑒定nSouthern Blot：DNAnNorthern Blot：RNAnWestern Blot：單向電泳后的蛋白質印跡nEastern Blot：雙向電泳后的蛋白質印跡Edwin Mellor SouthernWestern Blot 蛋白質鑒定n原理(重點掌握)：將SDS-PAGE上的蛋白質轉

16、移到硝酸纖維素膜上，讓第一抗體與膜上的目的蛋白質的抗原決定簇結合，然后用經過特定酶標記的第二抗體結合第一抗體，加入酶的顯色底物即可檢測的目的蛋白條帶存在與否。Western Blot 步驟(熟悉)n1、SDS-PAGE電泳結束后，不染色，進行轉膜，把SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉移到NC膜或PVDF膜上。(注意凝膠和膜的放置方向) Western Blot 步驟2、膜的染色 (麗春紅、氨基黑) 判斷凝膠上的蛋白是否已經轉移到膜上； 記錄蛋白分子量標準/樣品的位置；Western Blot 步驟n3、磷酸緩沖液漂洗，進行膜的脫色n4、膜的封閉 封閉是用高濃度的無關蛋白質封閉膜上未被占據的表面，使

17、抗體僅僅只能跟特異的蛋白質結合而不是和膜結合。常用的封閉液有牛血清白蛋白BSA，脫脂奶粉等，一般用脫脂奶粉。 將膜浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時。 Western Blot 步驟n5、結合一抗 (與目的蛋白結合) 將膜轉移到含一抗的封閉液中，室溫下輕搖孵育一小時。緩沖液洗滌三次 6、一抗與二抗結合 二抗是一抗的抗體 如果一抗是通過免疫兔子制備，即選擇抗兔的二抗，如羊抗兔、鼠抗兔等。 緩沖液洗滌三次Western Blot 步驟n7、顯色 (1)生物素-親合素系統 生物素(biotin)標記二抗，生物素容易與親和素(avidin)結合,而親和素事先已進行酶標記，如過氧化物酶，則形成 生物素-親和素

18、-過氧化物酶復合物 加入底物，即可顯色Western Blot 步驟n7、顯色 (2) 辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP) HRP經過碘酸鈉氧化而標記到二抗， 顯色底物：二氨基聯苯胺（DAB）、氯萘酚和氨乙基咔唑等。病毒的保存(掌握)n1、低溫及超低溫保存法 低溫(-20-60)、超低溫(-70以下)冰箱 液氮罐(-150-196) 溫度越低，保存時間越長； 常用保護劑：脫脂牛奶、5%蔗糖、血清 用保護劑配制病毒懸液或與病毒懸液混合病毒的保存n2、冷凍干燥保存 原理：微生物懸液冷凍后，在真空中使水分由固體直接升華為氣體，在低溫、干燥和缺氧環境下，微生物的生長和代謝暫時停止，因此保存期較長，便于運輸。病毒的保存n2、冷凍干燥保存 保護劑：脫脂牛奶或血清 保護劑作用原理：在冷凍干燥的脫水過程中穩定病毒結構，防止病毒受冷凍或干燥而造成損傷。2、冷凍干燥保存步驟n(1) 準備安瓿管(高壓滅菌后備用)2、冷凍干燥保存步驟n(2) 制備保護劑：脫脂牛奶取市售新鮮、清潔、無抗生素污染的牛奶2