1、第28卷第5期2011年5月沈 陽 藥 科 大 學 學 報Journa l o f Sheny ang Phar m aceutica lU nive rsit yV o l 28 N o 5M ay 2011p 350收稿日期:2010 12 20作者簡介:李磊(1981 , 男(蒙古族, 黑龍江大慶人, 博士研究生, E ma il lil e i 360si na . com; 陳大為(1959 , 男(漢族 , 遼寧海城人, 教授, 博士, 主要從事藥物新劑型與靶向給藥系統的研究, T el . 024 23986308, E m ail chenda w ei syphu . edu

2、 . cn 。文章編號:1006 2858(2011 05 0339 06采用星點設計 效應面法優化及制備阿霉素白蛋白納米粒李 磊1, 陳大為1, 趙秀麗1, 胡海洋1, 喬明曦1, 楊春榮2(1 沈陽藥科大學藥學院, 遼寧沈陽110016; 2 佳木斯大學藥學院, 黑龍江佳木斯154000 摘要:目的采用星點設計 效應面法優化阿霉素白蛋白納米粒的制備工藝。方法采用去溶劑化 固化交聯法制備阿霉素白蛋白納米粒。以白蛋白質量濃度(X 1: 1, g L -1 、阿霉素的質量濃度(X 2: 2, gL -1 、p H 值(X 3 及白蛋白理論交聯度(X 4, % 為考察對象, 以納米粒平均粒徑(Y

3、1:d , n m 、zeta 電位(Y 2:V , mV 、載藥量(Y 3:w 1, % 和包封率(Y 4:w 2, % 為評價指標, 以四因素五水平的星點設計 效應面法篩選出最佳制備工藝; 并采用透射電鏡觀察制得納米粒的形態。結果優化后的處方工藝為:白蛋白質量濃度為17g L -1、阿霉素質量濃度為2g L -1、p H 值為9、白蛋白理論交聯度為125%。以此條件制得的納米粒平均粒徑為(151 0 43 n m, zeta 電位為-(18 8 0 21 mV, 載藥量為(21 4 0 70 %, 包封率為(76 9 0 21%, 均與預測值偏差較小。結論阿霉素白蛋白納米粒的制備采用星點設

4、計-效應面法設計并優化是可行的。關鍵詞:阿霉素; 白蛋白納米粒; 制備工藝; 效應面法; 去溶劑化法中圖分類號:R 94 文獻標志碼:A阿霉素(doxor ubic i n , DOX 是一種抗腫瘤抗生素, 對急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌及多種其他實體腫瘤均有殺滅作用。但其嚴重的心臟毒性及脊髓抑制等不良反應, 極大地限制了阿霉素廣泛應用于臨床的抗腫瘤治療1。目前, 減小阿霉素毒性的主要方法是應用藥物載體, 改變其生物分布, 減少它在全身特別是心臟組織中的分布, 提高其在局部腫瘤部位中的含量。白蛋白材料具有安全無毒、無免疫原性、可生物降解、生物相容性好等特點。而且, 與其他膠體載體系統如脂質

5、體相比, 白蛋白納米粒具有更好的存儲穩定性和更高的親水性藥物的負載能力, 并且釋藥性能的可控性更好, 是一種理想的藥物載體2。星點設計(central co mposite desi g n , CCD 是國外近年來常用的實驗優化方法。在試驗設計上, 國內大多采用正交設計和均勻設計, 這兩種方法雖實驗次數較少, 但二者多用線性數學模型, 精度不如星點設計, 預測性較差。星點設計方法簡便, 且在模型建立上采用非線性數學模型擬合, 復合相關系數較高, 預測值更接近真實值3-4。作者采用白蛋白作為載體材料, 應用 去溶劑化 固化交聯法 制備阿霉素白蛋白納米粒。利用星點設計 效應面法優化制備工藝, 采

6、用粒徑、zeta 電位、載藥量及包封率作為評價指標, 著重研究制備過程中不同工藝條件對制備制劑的影響。從而篩選出制備阿霉素白蛋白納米粒的最佳優化工藝。1 儀器與材料FA1104電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司, DF 101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義英峪予華儀器廠, H L 2恒流泵(上海滬西分析儀器廠, LS320激光粒度儀(美國Beckm an 公司, TGL 16c 臺式高速離心機(上海菲代爾分析儀器公司, UV 9100紫外分光光度計(北京瑞利分析儀器廠, J E M 1200EX 透射電子顯微鏡(日本電子公司, DLESA 440SX 型zeta 電位測試儀(美國BEC

7、KMAN COULTER 公司 。鹽酸阿霉素(北京華奉聯博科技有限公司, 牛血清白蛋白(美國Am resco 公司, 無水乙醇(天津大茂化學試劑廠, 質量分數50%戊二醛(天津博迪化工有限公司, 胰蛋白酶(美國Amresco 公司, 其他試劑(分析純, 市售 。2 方法與結果2 1 阿霉素白蛋白納米粒的制備將阿霉素1m g 與牛血清白蛋白100m g 溶解到1mL 的蒸餾水中, 為了使藥物有效吸附到牛血清白蛋白上, 在室溫下攪拌2h ; 調節p H 值至710之間; 4mL 乙醇以0 5mL m i n -1的速度滴至已經孵化好的藥物與白蛋白混合溶液中, 繼續攪拌, 該過程為去溶劑化過程, 納

8、米粒形成; 向納米粒溶液中滴加質量分數為8%的戊二醛水溶液20 L , 室溫磁力攪拌1224h , 使納米粒交聯固化, 制得固化納米粒的溶液。將納米粒溶液以1 5 104r m in -1的轉速高速離心, 傾去上清液, 加水至原體積, 超聲。洗滌3次后, 真空干燥得固體粉末。2 2 含量測定方法學的建立2 2 1 檢測波長的選擇及確定分別將阿霉素水溶液和白蛋白水溶液稀釋至一定濃度后用紫外可見分光光光度計在200500nm 內掃描, 結果見圖1、2。由圖1、2可見, 空白白蛋白消化液在289nm 附近有干擾, 而在480nm 處沒有干擾, 因此選擇最大吸收波長480nm 為檢測波長。F ig .

9、 1 UV scanogra m of doxorub ici n water sol u tionFig . 2 UV scanogra m of al bum in water solution s2 2 2 標準曲線的制備精密稱取真空干燥至質量恒定的阿霉素適量, 用蒸餾水溶解定容至50mL 制成200m g L-1的儲備液。精密量取0 00、0 50、0 80、1 10、1 40、1 70、2 00mL 儲備液置于10mL 量瓶中, 用蒸餾水定容配成標準系列溶液。以蒸餾水為空白, 在480nm 處分別測定標準系列溶液的吸光度(A , 以質量濃度( 對吸光度(A 進行線性回歸, 結果見圖3

10、 。Fig . 3 UV standard curve of doxorub ici n標準曲線回歸方程為:A =2 04 10-2+2 89 10-2, r =0 9989, 阿霉素質量濃度在1040m g L -1內線性關系良好。2 3 阿霉素白蛋白納米粒粒徑及zeta 電位的測定 利用動態光散射粒度測定儀測定納米粒的粒徑大小; 利用DLESA 440SX 型zeta 電位分析儀測定載藥納米粒的zeta 電位。2 4 鹽酸阿霉素白蛋白納米粒載藥量及包封率的測定精密稱取按 2 1 條方法制得的阿霉素白蛋白納米粒10m g , 加入含100mg L -1胰蛋白酶的生理鹽水溶液25mL , 避光

11、, 37 恒溫磁力攪拌至溶液澄清。然后將溶液全部轉移至100mL 量瓶中, 用蒸餾水定容, 過濾, 取續濾液于480n m 處測定吸光度, 代入標準曲線計算藥物含量。按下列公式分別計算納米粒的載藥量和包封率。w 1(載藥量 =(納米粒中阿霉素的含量/納米粒的總質量 100%; w 2(包封率 =(納米粒中阿霉素的含量/阿霉素的總質量 100%。2 5 試驗設計在預試驗的基礎上, 選擇對阿霉素白蛋白納米粒的制備影響較顯著的4個因素作為考察對象。即白蛋白質量濃度(X 1: 1 、阿霉素質量濃度(X 2: 2 、pH 值(X 3 、白蛋白理論交聯度(X 4, 并確定其用量范圍為:1為10 0030

12、00g L -1、 2為1 005 00g L -1、X 3為7 59 5、X 4為50%150%理論上, 使1 g 白蛋白完全交聯所需要的戊二醛用量為87 5 g , 即:使A g 白蛋白產生理論交聯度為B %所需的戊二醛用量為(87 5 A B 100 g ; 作者通過使用不同用量的戊二醛來控制白蛋白的理論交聯度。采用四因素五水平的星點設計, 以納米粒平均粒徑(Y 1:d 、zeta 電位(Y 2:V 、載藥量(Y 3:w 1 和包封率(Y 4:w 2 為指標進行實驗考察。因素及水平見表1, 實驗安排及結果見表2。Tab le 1 Factors and th eir levels in

13、cen tra l co m posite desi gnIndependent v ariab l esSymbo l Coded l eve l-1 732-10+1+1 732 1(a lX 37 588 599 5D eg ree o f cro ssli nk i ng of a l bu m i n /%X 45075100125150Tab le 2 E xper i m en ta l de sign and results of the cen tral co m posite desi gnA ssay V ariab l esX 1X 2X 3X 4R esponses2

14、038 5100376-1 7223 1081 292 5 1 二次回歸模型的建立利用Desi g n ExpertVersi o n 7 0實驗軟件對表2實驗數據進行回歸分析, 得二次多元回歸模型為:Y 1=364 83-10 75 X 1+16 08 X 2-56 08 X 3+8 75 X 4+13 63 X 1 X 2+18 88 X 1 X 3+34 50 X 1 X 4+57 25 X 2 X 3+36 1 X 2 X 4+11 13 X 3 X 4+17 58 X 21-48 54 X 22+10 96 X 23-36 42 X 24(P<0 05, R 2=0 8908;

15、 (1Y 2=-7 21+0 69 X 1-0 45 X 2-5 1 X 3+0 92 X 4+0 84 X 1 X 2+0 44 X 1 X 3+0 48 X 1 X 4+0 94 X 2 X 3+1 25 X 2 X 4+1 85 X 3 X 4-3 3 X 21-1 59 X 22-0 6 X 23-5 2 X 24(P<0 01, R 2=0 7105;(2Y 3=20 01-0 37 X 1-3 69 X 2+3 24 X 3-0 28 X 4+2 49 X 1 X 2-4 15 X 1 X 3+1 31 X 1 X 4-2 X 2 X 3+1 59 X 2 X 4-1 49

16、X 3 X 4-3 67 X 21-2 34 X 22-3 1X 23-0 56 X 24(P<0 01, R 2=0 7000;(3Y 4=77 87+3 3 X 1+7 63 X 2+1 7 X 3+4 35 X 4-3 80 X 1 X 2-2 39 X 1 X 3-1 59 X 1 X 4-2 38 X 2 X 3-5 27 X 2 X 4-0 14 X 3 X 4-0 37 X 21-2 92 X 22-1 99 X 23-0 49 X 24(P<0 05, R 2=0 7927 。(42 5 2 方差分析和顯著性檢驗四個擬合方程的相關系數說明設計模型擬合程度良好, 可以

17、用此模型對鹽酸阿霉素白蛋白納米粒的處方進行分析和預測。從表3回歸系數的顯著性檢驗可知, 模型(1 中X 2(P<0 05 、X 3(P<0 05 、X 1X 3(P<0 05 、X 21(P<0 05 、X 23(P<0 05 項差異顯著, 其他項不顯著; 模型(2 中X 2(P <0 001 、X 4(P <0 05 、X 2X 4(P <0 05 差異顯著, 其他項不顯著; 模型(3 中X 3(P<0 01 、X 2X 3(P<0 01 、X 22(P<0 01 差異顯著, 其他項不顯著; 模型(4 中X 3(P<0

18、01 、X 21(P<0 05 、X 24(P<0 01 差異顯著, 其他項不顯著。Tab le 3 ANOVA for th e m ode ls predicted for each respon seSource Y 1SS DF P va l ue Y 2SS DF P va l ue Y 3SS DF P value Y 4SS DF P va l ue M ode l 175014<0 05338414<0 013 1070 10514<0 01122 414<0 05X 13 3410 80260 910 052 7735 10310 5011

19、 510 67X 23281<0 051396 91<0 0016 2082 10310 324 910 78X 32521<0 0569 410 307 5488 1041<0 01624 91<0 01X 41 8310 85453 21<0 051 8375 103412241<0105108191740141<01018211510<01052501122942681929410060105292632152921513 效應面優化與預測采用Desi g n2Expert mVersi o n 710實驗設計軟件繪制各指標與影響較顯

20、著的自變量的三維曲面圖(圖4, 設計各指標權重, 得到優化后處方為Q 1=17g #L -1、Q 2=2g #L -1、X 3=9、X 4=125%。按此處方制備了3批納米粒, 其粒徑、zeta 、包封率、載藥量見表4。從表4可知, 實驗觀察值和模型預測值都比較接近,模型的預測性良好。 A Pa rtic l e s i ze(n m o f the DOX2A2NP s show ing i n terac tion bet ween a m ount o f doxorubic i n and p H; B Ze ta 2potenti a l(mV o f the DOX2A2NP s

21、s how i ng i nteracti on bet w een a m ount of doxo rub i c i n and p H; C Am ount of drug l oadi ng(% of the DOX2A2N Ps show ing i n terac tion bet ween albu m i n concentrati on and a m ount o f doxorubic i n ; D Encapsu lati on effi c i ency (% of the DOX2A2N Ps show i ng i nteracti on bet w een

22、a l bum i n concentration and a m ount o f doxorubic i nF i g . 4 Re s pon se surface p l ots for par ticle size , zeta2potentia, l a moun t of d rug load i ng and encapsu l at i on eff i c iency sho w ing i n teractions a mon g represen tat i ve d ifferen t factors Table 4 Op ti m ization formu lat

23、i on of the DOX2A2NPs and th e p red icted and observed respon ses Eva l uati oni ndex P red i c ted response O bserv ed responses Predicted e rror d /nm 136151? 01431110V /mV-20-1818? 01216100w 1/%21142018? 01702108w 2/%76197514? 01211195216 阿霉素白蛋白納米粒的穩定性考察將采用優化工藝制得的納米粒, 經微孔濾膜過濾后充氮分裝在安瓶中保存在4e 下, 并定

24、期取樣測定粒徑和包封率, 結果見表5。Tab l e 5 Stability of DOX2A2NPs at 4e (n =3 t /monthd /nm w (EE /%0154? 013879135? 01371159? 413376189? 01483167? 318974137? 0178結果表明, 4e 時, 隨時間延長粒徑有所增加, 包封率變化不大, 認為納米粒在4e 下放置較穩定。217 形態學觀察利用JE M 21200EX 透射電子顯微鏡觀察載藥納米粒的形態。操作方法為:分別取適量空白白蛋白納米粒與阿霉素白蛋白納米粒溶液滴在噴碳銅網表面, 使液體盡量鋪滿整個銅網, 以質量分數

25、210%磷鎢酸負染3m i n 后, 于透射電鏡下觀察形態。從圖5可以看出, 阿霉素白蛋白納米粒溶液大小均一, 結構完整, 為球形或類球形。載藥納米粒比空白納米粒粒徑略有增加。3 討論a1阿霉素白蛋白納米粒單因素(白蛋白溶液初始質量濃度、p H 值、攪拌速度、乙醇滴入用量及速度、鹽酸阿霉素含量、白蛋白理論交聯度 考察過程中發現, 影響納米粒性質的因素主要是白蛋344 沈 陽 藥 科 大 學 學 報 第 28卷 F ig. 5 T ransm ission electron m icrograph s of e ty album in nanopar tic les( A and op ti a

26、l doxorub icin albu in nanop2 mp m m artic les( B 白溶液初始質量濃度、 阿霉素含量、 H 值、 p 白蛋白 理論交聯度, 忽略以上任一因素都無法制備出正 常的納米粒。因此以這 4個因素為考察對象, 以 平均粒徑、 zeta電位、 載藥量及包封率為考察指標 進行了四因素五水平的實驗設計。 b1阿霉素白蛋白納米粒處 方的優選如果采 用均勻設計法設計本次試驗, 僅僅能研究單因素 對納米粒制備的影響。而星點設計作為一種因素 水平優化法既較好地保證實驗精度, 同時可以研 究多種因素交互影響 。結果表明, 采用星點設 計優選的處方的理論值和預測值相近, 說

27、明所建 立的數學模型的預測性較好 6 5 驗基礎。 參考文獻: 1 楊占華, 隋道敬, 陳思娟, 等. 補 氣養陰活血 法對阿霉 素減增效 作 用臨 床 研 究 J. 中國 藥 學 刊, 2006 24 , ( 2: 275- 277. 2 蘇華, 胡 晉紅, 李鳳 前. 白蛋白 納米 粒的制 備工 藝及 其靶向性研究進展 J. 中國藥學雜志, 2005, 40( 9: 641- 644. 3 鄭威威, 胡延 臣, 王曦 培, 等 . 洛 伐他 汀 - PLGA 納米 粒的制備及其性質 J. 沈陽藥 科大學學 報, 2010, 27 ( 4: 259- 264. 4 邢傳峰, 胡 海洋, 楊

28、春榮, 等. Box2Behnken 效應 面法 優化長春西汀長循環脂質體處方 J . 沈 陽藥科大學 學報, 2009, 26( 10: 761- 767. 5 STE I NHAU SER I SPANKUCH B, STREBHARDT K, et , a.l T rastuzum ab2m odified nanopa rtic les: opti ization o f m prepara tion and uptake in cancer cells J. B iom ater i 2 a ls, 2006, 27: 4975- 4983. 6 何軍, 奉建芳, 龐家忠, 等. 星

29、點 設計 - 效應 面法優化 水飛薊素固體脂質納米粒的制備 J . 中 國醫藥工業 雜志, 2005, 36( 1: 18- 21. 。 4 結論 作者采用星點設計 2 應面 法設計并優化了 效 阿霉素白蛋白納米粒的制備工藝, 發現 pH 值、 阿 霉素含量、 鹽酸阿霉 素含量的平方及 p 值與鹽 H 酸阿霉素含量交互作用顯著影響阿霉素白蛋白納 米粒的制備及其相關性質。實驗結果與預測值相 差較小, 提示采用星點設計 2 應面法制備阿霉素 效 白蛋白納米粒是可行的。這為作者下一步制備具 有主動靶向功能的阿霉素白蛋白納米粒奠定了實 (下轉至第 354頁 354 沈 陽 藥 科 大 學 學 報 第

30、28卷 C SPC Zhongnuo Pharm a ceutica l, Shijiazhuang 050000, China Abstract Objective T o iso late and identify the chem ical constituents from m arine bacteriu P an toea agg lo 2 : m m erans. M ethod s T he com po unds from the ethy l aceta te ex tractsw ere iso lated by silica ge l co lu n Sepha2 m

31、, dex LH 2 co lum n chrom ato graphy and HPL C techn iques And these com pounds w ere ident if ied by the 20 . phy sico2chem ica l properties and spectral analy sis. R esu lts T en com pounds w ere iso lated from the ethy l ace2 tate ex tracts of m arine bacteria P anto ea agg lom erans. T hey w ere

32、 id entif ied a s cyc lo ( Phe2 ro ( 1 , cyc lo P ( V a l2 ro ( 2, cyc lo ( A la2 eu ( 3 , cy clo ( T rp2Pro ( 4 , cyc lo ( T rp2 ly ( 5 , cy clo ( 42hydroxy l2 ro2 P L G P Phe ( 6 , cyc lo ( Pro2 y r ( 7, cy clo ( L eu2 eu ( 8 , cyclo ( P ro2 eu ( 9, cy clo ( V a l2Ile ( 10. Conc lu2 T L L sion sA

33、ll o f th e com pounds are iso la ted from the m arin e bacterium P antoea a gg lom erans fo r th e f irst ti e m . K ey w ords: m arin e bacteriu m; P antoea agglom erans; cyc lo 2dip eptide; che ical constituen; structure m t id entifica tio n (上接第 344頁 Opti m ization on the preparation of doxorub

34、icin2 loaded album in nanoparticles using central composite design2response surface m ethodology L I L ei , CHEN D a2w ei , ZHAO X iu2li , HU H ai2yang , Q IAO M ing2x i , YANG Chun2rong m a cy, Jiam usi U niversity, Jiam usi 154000 C hina , Abstract Ob jective T o opt i ize the preparation o f dox

35、orub icin 2lo aded a lbu in nanopartic les using re2 : m m sponse surface m eth odo lo gy ( RS . M ethods A lbum in nanoparticles w ere prepared th rough a deso lvat io n M m ethod and opt i ized in the a id o f centra l com posite desig n. A lb u in concentra tio n(X 1: Q, g L m m # 1 of doxo rubic

36、 in (X 2: Q, g L # 2 - 1 -1 1 1 1 1 1 2 ( 11Schoo l o f P ha r acy, Shenyang Pharm a ceutica l U niversity, Shenyang 110016 C hina; 21Schoo l o f P ha r2 m , , am oun t , pH va lues(X 3 , and theore tica l deg ree o f cro sslink in g o f album in(X 4, % w ere selected as independent v aria bles and nanoparticle size zeta po ten tia, drug lo ading and encapsulat io n , , l eff ic ie ncy a s response variables A