1、針灸預處理對Alzheimer大鼠Wnt1表達的影響作者：周華 孔立紅 沈峰 曾曉玲 杜艷軍 陳邦國 王述菊 孫國杰【摘要】 目的 建立老年性癡呆（AD）大鼠模型，探討針灸預處理對AD模型大鼠Wnt1信號轉導通路的影響及防治AD的機制。方法 建立AD大鼠模型，隨機分為正常組、假手術組、模型組、預艾灸組、預電針組、預電針加灸組。通過實時定量PCR技術檢測Wnt1基因表達。結果 模型組大鼠海馬Wnt1信號異常減弱，與正常組和假手術組比較差異顯著（P0.01）。而預艾灸組、預電針組、預電針加灸組大鼠海馬Wnt1的信號均有不同程度的增強。結論 針灸防治AD的作用機制可能是通過調節Wnt信號轉導通路影響

2、學習記憶相關酶及蛋白在海馬區的表達而發揮作用。 【關鍵詞】 針灸；針刺預處理；老年性癡呆；Wnt1信號傳導通路 【Abstract】 Objective To establish rat models of AD to explore the predisposal on the rat models of senile dementia Wnt signal transduction pathway, and reveal the mechanism of acupuncture treatment of AD.Methods All the rats were divided into n

3、ormal, sham, model, premoxibustion, preelectro2 / 23acupuncture, preelectroacupuncture and moxibustion groups at random. Results Wnt1 gene singal expression was observed to weaken abnormally in model rats. There were significant difference between the model group and sham, normal groups (P0.01), whi

4、le the Wnt1 singal were reinforced in preelectroacupuncture, premoxibustion and preelectroacupuncture groups in different degree. Conclusions The adjusting mechanism of acupuncture to prevent and cure dementia is likely to regulate the Wnt signal transduction pathways and affect the relevant enzymes

5、 and proteins expression of learning and memory in the hippocampus. 【Key words】 Acupuncture; Acupuncture and moxibustion; Predisposal; Dementia; Wnt1阿爾茨海默病（Alzheimer Disease，AD）又稱為老年性癡呆，是一種主要表現為認知功能障礙、日常生活能力喪失及精神行為異常的神經系統退行性變性疾病，是嚴重危害老年人身心健康的重大疾病之一。針灸防治該病取得了滿意的療效，其作用機制尚未十分明確。本課題通過實時定量（RT）PCR技術檢測針灸預處

6、理對AD模型大鼠Wnt1信號轉導通路的影響，揭示針灸防治AD的作用機制。1 材料與方法1.1 實驗動物及分組2224月齡雄性清潔級（SD）大鼠30只，體重(480±20) g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，符合SD級實驗動物標準。隨機分為正常組、假手術組、模型組、預艾灸組、預電針組、預電針加灸組。1.2 試劑及主要儀器Trizol RNA抽提試劑；MMLV逆轉錄酶、TaqDNA聚合酶、dNTP、RNAsin；PCR引物及寡聚核苷酸；基因擴增儀；G6805型電針治療儀。1.3 動物模型制作和篩選大鼠稱重，用10%的水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術臺上

7、，腦立體定位儀固定頭部。顱頂區備皮，剝開皮下筋膜暴露頂骨，消毒手術區皮膚，無菌操作，在兩側冠狀縫后鉆出小孔，取出碎骨屑，保持硬腦膜的完整。按大鼠腦立體定位圖譜1選擇大鼠海馬區域進行注射。注射部位：前囟后3.5 mm，中線外側2.0 mm，硬腦膜下2.7 mm。每側用微量注射器分別注入聚集肽的淀粉樣蛋白（A）2535（0.1%的三氟乙酸將A2535稀釋成5 g /l，37孵育1 w） 1 l（5 g），5 min內注完，注射后留針5 min，以免拔針時藥物溢出。術后牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚，3 d內每日肌注青霉素G 10萬U防治感染。 將大鼠分別進行Morris水迷宮測試，剔除天生癡呆大鼠。篩

8、選方法：以15只3月齡青年大鼠為受試對象。第1天讓大鼠自由游泳4次，每次2 min以適應水中環境。從第2天起，每日上午和下午分別進行4次水迷宮實驗，記錄逃避潛伏期的長短，每次每只大鼠測試時間為2 min，2 min內未找到終點者以2 min計算，4 d實驗結束后，得出青年大鼠平均逃避潛伏期。再取30只24月齡老年大鼠，時間及方法同前，并計算出每只老年大鼠的平均逃避潛伏期，分別以青年大鼠平均逃避潛伏期均值+2倍標準差值為下限、+1倍標準差值為上限作為評定標準，將老年大鼠進行篩選，選出合格大鼠24只，每組各4只。取雙側海馬，液氮中保存，備用。1.4 處理方法正常組：不進行任何處理，作為實驗對照組。

9、假手術組：顱內注射等量生理鹽水，手術方法及注藥方法同模型組。模型組：造模成功后，不進行任何治療。預電針組：對正常大鼠先施予電針刺激。根據華興邦提供的大鼠穴位定位和針刺方法，取大鼠“百會”（頂骨正中）、“腎俞”（第2腰椎下兩旁），百會向前平刺35 mm，腎俞穴稍向內斜刺5 mm，接上海產G6805型電針治療儀，百會接負極，腎俞接正極，左右側腎俞每日交替使用。選用連續波、頻率2 Hz，以針柄輕微抖動為度，留針20 min，1次/d，6 d為1個療程，療程間休息1 d，共3個療程。電針結束當日即開始給大鼠腦室內注射A2535，造模完畢7 d后繼續電針治療7 d。預艾灸組：正常大鼠造模前先給予艾灸刺激

10、。艾灸方法：采用美容艾條（直徑約0.6 cm），取穴同預電針組，于“百會”和一側“腎俞”上方23 cm處用自制固定支架懸灸，左右側腎俞每日交替使用，使穴位表皮溫度在43±1，持續20 min，1次/d，6 d為1個療程，療程間休息1 d，共3個療程；施灸結束當日即開始給大鼠腦內注射A2535，造模完畢7 d后繼續艾灸治療7 d。預電針加灸組：對正常大鼠先施予預電針組與預艾灸組相同治療方法，電針和艾灸各10 min，可同時進行。治療結束當日即開始給大鼠腦室內注射A2535，造模完畢7 d后繼續電針加灸治療7 d。1.5 標本采集每組中各取4只大鼠，以10%水合氯醛腹腔麻醉（300 mg

11、/kg），斷頭取腦，迅速在冰盤上剝離腦膜，除去嗅球、延髓和小腦，分離雙側海馬，置于冰箱-80凍存備用。1.6 用RTPCR檢測腦組織Wnt1表達1.6.1 引物的設計通過NCBI查找大鼠Wnt1基因序列，應用Primer Primers軟件進行引物設計。同樣設計actin為內參照，由武漢谷歌生物科技有限公司合成。 Wnt1引物序列(擴增產物為306 bp)：上游：5GAGGTGAAAGGGCAAGGAAAG3，下游：5 GCTGGCAGACAAGAGGAGTGA3，內參照actin引物序列(擴增產物為150 bp)；上游：5GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3，下游：5GACTCA

12、TCGTACTCCTGCTTGCTG3。1.6.2 嵌合熒光（SG）法進行RTPCR檢測1.6.2.1 腦組織總RNA的提取迅速取出大腦海馬部位的腦組織100 mg，加入1 ml Trizol，冰浴勻漿碾碎，使組織細胞充分溶解，移至1.5 ml EP管中；加入氯仿200 l用力振搖15 s，靜置5 min，12 000 r/min離心15 min(4)，分層后，取上清轉移至新的1.5 ml EP管；加-20預冷的等體積異丙醇，混勻，靜置10 min，12 000 r/min離心10 min (4)；棄上清，加預冷的75%乙醇用焦碳酸二乙酯（DEPC）配制1 ml吹起沉淀，7 500 r/min

13、離心5 min(4)；倒棄上清，濾紙吸干，晾515 min，溶于DEPC(10 l)中；紫外分光光度法分析核酸的純度及定性分析，RNA放入-80冰箱中。1.6.2.2 總RNA逆轉錄成cDNA冰上取3 l RNA，1 l RTPCR混合液，8 l DEPC，總計12 l，70孵育5 min，0冰水浴立刻終止；4 l 5×反應液，1 l核糖核酸抑制劑，2 l 10 mmol/L脫氧核苷三磷酸底物，總計19 l，37孵育5 min；加Revert AidTMMMMuLv Reverse Tanscriptase (200 U/l) 1 l，42孵育20 min，99 5 min，45 m

14、in，反應物-20保存。1.6.2.3 PCR擴增34 l ddH20，5 l 10×Taq液，3 l 25 mmol/L MgCl2，1 l 10 mmol/L脫氧核苷三磷酸底物，1 l上游引物，1 l下游引物，4 l cDNA，1 l Taq DNA聚合酶，總體積為50 l。反應條件：95預變性1 min，95變性15 s，60退火15 s，共40個循環，72延伸45 s，熒光收集。以擴增倍數作為比較的依據，CT=CT目的基因CTactin，CT =CT實驗CT對照，擴增倍數=2CT。1.6.2.4 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳8 l PCR產物與1 l上樣緩沖液混勻加樣，1.5%瓊

15、脂糖凝膠電泳，100 mV 2030 min，溴化乙啶(EB)顯色。1.7 統計學處理 所有數據應用SPSS13.0軟件統計包處理。實驗結果以x±s表示，組間比較采用t檢驗。2 結 果 擴增倍數模型組(0.55±0.16)比正常組(1.0±0.33)和假手術組(0.95±0.36)顯著降低，有極顯著性差異（P0.01），預電針組(0.78±0.24)、預艾灸組(0.81±0.18)、預電針加灸組(0.93±0.20)與模型組比較均有極顯著性差異（P0.01），證實預電針、預艾灸、預電針加灸對于預防癡呆的發生發展具有明顯的影響

16、。預電針加灸組與預電針組和預艾灸組比較，有顯著性差異（P0.05），證實針灸結合預處理效果最佳。3 討 論 Wnt基因是從小鼠乳腺癌中克隆的一種原癌基因，Wnt1蛋白是控制細胞生長、增殖的關鍵分泌信號分子,可傳遞細胞間相互調控信息，是19個已知Wnt基因中的第一個成員。有研究證實,干細胞和細胞外基質的相互作用也需要Wnt信號途徑的參與24。Wnt信號系統是一個在細胞水平調節的信號系統，在細胞的分化、增殖以及腫瘤的發生、發展等過程中發揮著重要的作用。Wnt信號途徑由Wnt特異性跨膜受體卷曲蛋白（Frrizled）、散亂蛋白（dishevelled）、糖原合成酶激酶3（GSK3）、軸蛋白（Axin

17、）、大腸腺瘤樣息肉基因（APC）、連環蛋白（catenin）、T細胞因子/淋巴樣增強因子（Tcf/Lef）及其他一些基因的表達產物共同構成。其中catenin是正向調節因素，GSK3、Axin、APC等是負向調節因素，位于catenin的上游。 當細胞表面無Wnt信號時，胞漿內的catenin與GSK3、APC、Axin三者結合形成一種多蛋白調節復合物，此復合物能促進GSK3對catenin的磷酸化及降解；同時胞漿內高水平的GSK3可以反饋刺激負性調節分子GSK3、Axin、APC等的表達，使胞漿內游離的catenin蛋白水平維持在一個非常低的濃度，而不能進入細胞核調控相應基因表達。caten

18、in的磷酸化需要GSK3、APC、Axin三者的共同作用：catenin雖是GSK3的底物，但不能直接被磷酸化，需與APC結合，而catenin與APC必須依靠GSK3對APC的磷酸化，正好APC也是GSK3的底物5。Axin作為支架蛋白能促進GSK3對catenin的磷酸化作用，但GSK3同樣使Axin自身發生磷酸化。磷酸化的Axin不僅增加了它與catenin的親和性6，也增強了其穩定性而有利于促進catenin的磷酸化與降解7。反之，當細胞接受到Wnt信號后，通過DVL的磷酸化抑制了與Axin結合的GSK3活性。GSK3活性的抑制，降低了對APC的磷酸化，使之與catenin間失去親和力

19、；也降低對catenin的磷酸化，阻斷了catenin的降解，這樣catenin就從復合物中分離，得以在胞漿內積累并可以轉移到核內與轉錄因子結合，進而誘導靶基因轉錄。 與腦的學習和記憶等高級功能有關的大腦皮層、海馬和內嗅皮層是AD病理過程中最易受損害的部位，而Wnt在這些腦區都有較高表達。Wnt信號異常減弱引起GSK3活性增加,可使tau蛋白磷酸化及微管去穩定、catenin過度降解和神經元死亡。Wnt系統失?？赡芘c其AD相關的病理變化有關，這包括神經突起的病理改變，磷酸化tau蛋白相關的神經元纖維纏節的形成，神經元丟失以及A堆積形成老年斑8。近年來研究發現，在精神紊亂患者的大腦中，已經檢測到

20、了Wnt1的表達9。AD腦內Wnt信號通路中的GSK3活性異常增高10， 提示Wnt信號系統異常減弱。Garrido11研究發現GSK3增多、catenin蛋白缺失參與了AD 神經毒性物質的形成，抑制GSK3的活性、提高細胞核中catenin蛋白的水平能減少神經毒性物質的產生。Wang等12研究發現，鼠的dishevelled1和dishevelled2的過度表達將抑制由GSK3調控的tau蛋白磷酸化。這些均提示Wnt信號系統失調可能參與了AD相關的病理變化。因此，探討在Wnt信號及其調節分子在AD病理過程中的調節機制，設法阻止GSK3的異常升高、catenin蛋白的過度磷酸化，抑制tau蛋白

21、異常磷酸化，對預防和延緩神經細胞的退行性變性、改善學習記憶功能具有重要意義。 從實驗結果可以看出，Wnt可能參與了AD相關的病理變化，在正常大鼠中Wnt信號相對較強，而模型組中Wnt信號明顯減弱。經過預處理的各組大鼠Wnt表達比模型組明顯增強，證實預處理可預防腦損傷，對AD大鼠的學習和記憶功能具有明顯的保護作用，而針灸預處理對AD的防治作用可能是通過調節Wnt信號系統相關酶GSK3、PP2A的活性，調節相關蛋白catenin、Axin的表達實現的?！緟⒖嘉墨I】 1 Paxino S.The rat brain in stereotaxic coordinates compact third e

22、ditionM.New York: Academic Press,2005：8.2 Bijur GN,Jope RS.Glycogen synthase kinase3 beta is highly activated in nuclei and mitochondriaJ.Neuroreport,2003;14(18):24159.3 Calderone A,Jover T,Noh KM,et al.Ischemic insults depress the gene silencer REST in neurons destined to dieJ.J Neurosci，2003;23(6)

23、:211221.4 Caricasole A,Copani A,Caruso A,et al.The Wnt pathway,cellcycle activation and betaamyloid:novel therapeutic strategies in Alzheimers diseaseJ?Trends Pharmacol Sci,2003;24(5):2338.5 張 平.Wnt信號轉導及其生物效應J.中國生物化學與分子生物學報，2001；17(4):4159.6 Hamada F,Tomoyasu Y,Takatsu Y,et al.Negative regulation of wingless signaling by Daxin，a Drosophila homolog of axinJ.Science,1999；283(5408)：1739