1、 生菜組織培養(yǎng)技術(shù)論文學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院 專(zhuān)業(yè): 2013級(jí)生物科學(xué)學(xué)號(hào): 201312200501003姓名: 方來(lái) 前言：生菜（Romaine Lettuce）屬菊科萵苣屬，為一年生或二年生草本作物，因其生長(zhǎng)快、栽培容易、產(chǎn)量高、鮮食口感好而廣受歡迎。生菜中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，其中富含B族維生素和維生素C、E等，含水量很高，而且最突出的特點(diǎn)就是超級(jí)低脂。生菜此外富含膳食纖維以及多種礦物質(zhì)生菜，對(duì)于人的消化系統(tǒng)大有裨益。它也可以促進(jìn)胃腸道的血液循環(huán)，對(duì)于脂肪、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，能夠起到幫助消化的作用。另外對(duì)于膽汁的形成也有促進(jìn)作用，并且可以為血液消毒。生菜的子葉、葉片離體培養(yǎng)容易，再生率和

2、轉(zhuǎn)化率較高，我們選擇生菜作為研究植物組織培養(yǎng)技術(shù)的材料，為進(jìn)一步研究生菜的生理效應(yīng)做基礎(chǔ)。1. 材料與方法實(shí)驗(yàn)材料：生菜種子 試劑：MS培養(yǎng)基 2,4-D 6-BA NAA實(shí)驗(yàn)方法生菜種子的消毒種子在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)生芽外植體誘導(dǎo)愈傷組織分化成完整植株 種子的消毒 培養(yǎng)75 %的酒精表面消毒30s，無(wú)菌水沖洗2次，再用0.1%升汞消毒8min，無(wú)菌水沖洗46次1。將消過(guò)毒的種子在無(wú)菌條件下接種到MS固體培養(yǎng)基中，放入45冰箱中催種24 h，再放入溫度為25，每日光照16h，光照強(qiáng)度為 2000 lx 的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，12 d 后種子萌發(fā)2。 外植體誘導(dǎo)愈傷組織摘要：選用較粗壯的莖和肥碩的葉作為

3、外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同激素的配比，經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)、芽分化、生根 3 個(gè)步驟的離體培養(yǎng)，建立生菜快速、高頻再生體系，進(jìn)行組織培養(yǎng)技術(shù)的研究。利用植物激素6-BA、NAA、不同濃度配比對(duì)愈傷組織作用不同，從而研究何種濃度配比下愈傷組織誘導(dǎo)生成芽的概率大小。預(yù)計(jì)最佳誘導(dǎo)外植體分化培養(yǎng)基為 MS+0.15 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA，出愈率達(dá)到 100 %，出芽率達(dá)到 87 %。待真葉長(zhǎng)出后10 d，取無(wú)菌真葉作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加6.5 g/L 瓊脂粉，30 g/L 的蔗糖，0.15mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA2，調(diào)P

4、H至6.8左右（配制500ml），分裝到30管中。真葉或莖段切成約0.5 cm×0.5 cm 大小，接種到培養(yǎng)基中，放入25光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時(shí)觀察，統(tǒng)計(jì)外植體誘導(dǎo)成為愈傷組織的成功率（出愈率）出愈率（%）= 產(chǎn)生愈傷組織塊數(shù) / 外植體總數(shù)（30塊）繼代培養(yǎng)以1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加30 g/L 的蔗糖，6.5 g/L 瓊脂粉，加入0.5mg的活性炭，0.15 mg/L 6-BA，設(shè)置NAA的濃度梯度分別為0.1，0.2，0.3 mg/L三組，每組10管。把愈傷組織轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上，定時(shí)觀察、拍照。出芽率（%）= 出芽塊數(shù) / 外植體總數(shù)（30塊）2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分

5、析2.1 結(jié)果（1）外植體誘導(dǎo)成為愈傷組織的出愈率=100%（2）愈傷組織誘導(dǎo)成植株 失敗不同濃度激素配比在繼代培養(yǎng)中對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)成植株的影響處理6-BA mg/LNAA mg/L愈傷組織數(shù)（塊）出芽塊數(shù)（塊）出芽率（%）10.150.130？20.150.230？30.150.330？愈傷組織沒(méi)有分化成芽實(shí)驗(yàn)失敗分析：（1）可能由于實(shí)驗(yàn)后期有細(xì)菌進(jìn)入污染培養(yǎng)基；（2）愈傷組織發(fā)生褐變（3）在配制培養(yǎng)基時(shí)，未加抑菌劑 單一殺菌劑抑某種材料的所有病原菌是無(wú)效的，必須是幾種殺菌劑聯(lián)合使用才有效，而且對(duì)不同的材料，殺菌劑種類(lèi)和濃度極不一致3。 褐變的因素：1）溫度過(guò)高或光照過(guò)強(qiáng), 都可以提高PPO

6、的活性，從而加速被培養(yǎng)組織的褐變2）由于接種后轉(zhuǎn)瓶周期時(shí)間長(zhǎng)，傷口周?chē)e累酚類(lèi)物質(zhì)過(guò)多所造成的3）CO2濃度過(guò)高也會(huì)促進(jìn)褐變4被污染的培養(yǎng)基可能原因：操作時(shí)不小心帶入真菌孢子討論：生菜的愈傷組織的誘導(dǎo)主要是植物激素的作用。誘導(dǎo)愈傷組織生芽的因素可能與激素配比不同，由于本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程、由于實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)、或外植體消毒不徹底、CO2濃度過(guò)高、溫度或光照過(guò)強(qiáng)、愈傷組織到系帶培養(yǎng)的轉(zhuǎn)瓶周期較長(zhǎng)4、或其它一些原因，導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)失敗，出芽率不能確定。參考文獻(xiàn)：1 黃遠(yuǎn)新, 王曉雯, 林吶. 植物莖尖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)實(shí)踐 西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院 重慶 400716 生物學(xué)通報(bào) 2013年 第48卷 第9期2 李靜, 許彬, 李文露等. 生菜組織培養(yǎng)再生體系的建立 昆明 農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用 第3期 2013年 6502013 王志成, 劉