1、重組質粒酶切鑒定及pcr實驗重組質粒的酶切鑒定及pcr實驗%1. 實驗目的1. 檢驗垂組質粒的插入片段的人小2. 學習pcr技術的使用%1. 實驗原理(-)重組質粒酶切鑒左將含有外源dna的轉化子的e. colidh5a菌株進行培養，并用試劑盒提取其質粒dna, 將所提取的dna川切puc19質粒的同一種限制性內切酶進行切割以驗證所插入的外源dna 的大小。(二)pcrpcr (polymerase chain reaction)即聚介酶鏈式反應是 1986 年由 kallis mullis 發 現。這項技術已廣泛地應用于分子生物學各個領域，它不僅可用于基因分離克隆和核酸序 列分析，還可用于突

2、變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態性的分析等方 而。木次實驗旨在通過學習和掌握pcr反應的基木原理和實驗技術，以驗證重紐質粒插入 片段大小。1. 聚合酶鏈式反應原理pcr是一種利用兩種與相反鏈雜交并附著于靶dna兩側的寡核苜酸引物，經酶促合成特 異的dna片段的體外方法。反應過程由高溫變性，低溫退火和適溫延伸等兒步反應組成一 個循環，然后反復進行，使tl的的dna得以迅速擴增。置待擴增dna于高溫下解鏈成為 單鏈dya模板，人工合成的兩個寡核昔酸引物在低溫條件下分別與冃的片段兩側的兩條鏈 互補結合，dna聚合酶在72°c將單核昔酸從引物3'端開始摻入，沿模板5&

3、#39;3'方向延 伸，合成dna新鏈。出于每一循環所產生的dna均能成為下一次循環的模板，所以pcr 產物以指數方式增加，經2530次周期z后，理論上可增加109倍，實際上可增加107 倍。pcr技術具冇操作簡便、省時、靈敏度高特異性強和対原始材料質量耍求低等優點，但 由于所用的taqdna聚合酶缺乏5'3'核酶外切酶活性，不能糾正反應中發生的錯誤核芹 酸摻入，估計每9000個核昔酸會導致一個摻入錯誤，但是錯誤摻入的堿基有終止鏈延伸 的作用傾向，使得錯誤不會擴大。2. pcr的反應動力學pcr技術類似于dna的天然復制過程，其特杲性依賴于與靶序列兩端互補的寡核昔酸引

4、物。pcr由變性一退火-延伸三個基本反應步驟構成：模板dna的變性：模板dya經加 熱至93°c左右一定時間后，使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使z成為 單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板dna與引物的退火（復性）：模板 dna經加熱變性成單鏈后，溫度降至55°c左右，弓i物與模板dna單鏈的互補序列配對結 合；引物的延伸：dna模板一引物結合物在taqdna聚合酗的作用下，以dntp為反應原 料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板dna鏈互補的半 保留復制鏈重復循壞變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制

5、鏈”，而11 這種新鏈又可成為下次循壞的模板。每完成一個循環需24分鐘，23小時就能將待擴 忖的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期（plateau）所需循環次數取決于樣晶中模板的拷 貝。pcr的三個反應步驟反復進行，使dna擴增量呈指數上升。反應最終的dna擴増量可用 y=（l+x）n計算。y代表dna片段擴增后的拷貝數,x表示平（y）均每次的擴增效率，n 代表循壞次數。平均擴增效率的理論值為100%,但在實際反應中平均效率達不到理論值。 反應初期，靶序列dna片段的增加呈指數形式，隨著pcr產物的逐漸積累，被擴增的dna 片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應”，這種效

6、應稱平 臺期數、pcr擴增效率及dna聚合酶pcr的種類和活性及非特異性產物的競爭等因素。大 多數情況下，平臺期的到來是不可避免的。3. pcr擴增產物可分為氏產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限泄在兩個引物鏈 5'端z間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由于引物所結合的模板 不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的d¥a為模 板，引物是從3,端開始延伸，其5,端是固定的，3'端則沒有固定的止點，長短不一， 這就是長產物片段。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，述要同新合成的鏈（即 長產物片段）結合。引物在

7、與新鏈結合時，曲于新鏈模板的5,端序列是固定的，這就等 于這次延伸的片段3,端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序 列以內、形成長短一致的短產物片段。短產物片段是按指數倍數增加，而長產物片段則以 算術倍數增加，兒乎可以忽略不讓。這使得pcr的反應產物不需要再純化，就能保證足夠 純dna片段供分析與檢測用。%1. 實驗材料及儀器1. 實驗材料：prc擴增儀，瓊脂糖凝膠電泳設備，移液器，0.2ml薄壁pcr管，凝膠成 像儀,模板puc19重組質粒（插入片段125bp和564bp）,寡核昔酸引物（上游引物 m13f,下游引物 m13r） , taqdna 聚合酶（takara,

8、-20°c貯存），dntps （takara, -20°c 貯存）,10xpcr反應緩沖液（takara, -20°c貯存）高速離心機，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，量筒，移液槍，冰盒，槍尖， eppendorf管，微量移液器，手套，記號筆，tae電泳緩沖液（10x）,瓊脂糖，浣化乙錠 （eb）, dna 相對分子質量標準物 d7a marker k/hindlll, dl5000%1. 實驗步驟（一）垂組質粒的酶切、電泳檢測1. 對于電泳顯示插入片段在2.0kb以上的重組質粒，采用hindhi酶切進行驗證。大片段或高產量的重組質粒推薦的反應體系（10卩1

9、體系）如輕彈混勻后，短暫離心，于37°c孵育2吐后，保存于-20°c,備電泳檢測。2. 酶切產物電泳檢測取酶切產物10ul,加入2ul 6x±樣緩沖液，混勻后取6ul點樣。取重組質粒10 ul,加入2 ul 6x上樣緩沖液，混勻后取6 ul點樣。以入 dna/iiindiii為marker。100v恒壓電泳約40mino電泳結朿eb染色lomin,水洗后紫外燈 下觀察實驗結果。（二）重組質粒的pcr驗證/pcr擴增日的基因對于電泳顯示插入片段在2. okb以下的重組質粒，采用pcr進行驗證。引物此次重組 用到的載體是puc19,限制性內切酶為hind iii,所以

10、選擇hind iii酶切位點兩側一定距離 的序列制作引物。由于載體puc19上兩引物間序列的長度是150bp,所以pcr擴增產物的長度（bp） =150+ 插入片段的長度。下圖所示為puc19部分序列，即引物來源：m13f（-47）:ecor iaaaacgacggccagtcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcllind iii 互補 鏈）1.反應體系的建立除了此反應體系z外，還要做三個反應體系：其他組分不變，只將編號6的組分換成共 用564bp模板，puc19質粒（作為模板對照）,ddh2（）（作為陰性對照）。振蕩混勻，然 后短暫離心。

11、2. 反應程序的設定（1）預變性：讓dna雙鏈充分解離，然后第一次退火過程時候引物可以盡量多的結合到模版上血這主要是為了保險起見，使模板dna的二級結構充分打開。（2）變性：通過加熱使da雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈dna。（3）復性：當溫度突然降低時由于模板分子結構較引物要復雜的多，而且反應體系中引物dna量人人多于模板dna,使引物和其互補的模板在局部形成朵交鏈，而模 板dna雙鏈之間兀補的機會較少。（4）延伸：在dna聚合酶和4種脫氧核糖核菇三磷酸底物及鎂離子存在的條件下，57 的聚合酶催化以引物為起始點的dna鏈延伸反應。（5）終延伸：循壞完成后使pcr反應完全以提高擴增產量，在

12、用普通taq酶進行pcr擴增時在產物末端加a尾的作用，對以直接用于ta克隆的進行3. pcr產物檢測：1%的瓊脂糖凝膠電泳:20u1pcr產物中加3. oul 10x±樣緩沖液,混合均勻，取5ul點 樣。以dl2000plus為marker。100v恒壓電泳約40mino電泳結朿eb染色lomin,水洗后 紫外燈下觀察實驗結果。%1. 實驗結果及分析（一）重組質粒的酶切電泳結果將重組質粒酶切z后進行凝膠電泳，紫外成像如圖1.圖1第1-5組重組質粒酶切凝膠電泳成像圖從左到右各泳道分別為：第 1 泳道：x dna/hindiii；第 2-19 泳道：第 1-5 組重組與酶切質粒（rl,

13、rl/hindlll, r2, r2/hindiii）；第 20 泳道:puc19/hindiii；第 21 泳道:x dna/hindtito我所在的組別是第1組，樣品在第2-5泳道。第2、3泳道分別為重組質粒1和重組質粒1的酶切，具體分析見圖2 o第4、5泳道分別為重組質粒2和重組質粒2的酶切，具體分析見圖3。如圖2所示。泳道1為x dna/hinditt,泳道20為puc19/hindtii,泳道2為本組巫 組質粒樣品1,泳道3為重組質粒的酶切。帯（1）大小在5000-6000bp左右，與第2泳 道中的重組質粒位置近似，因此帶（1）可以理解為未被酶切開的重組質粒；帶（2）人小 4000左

14、右，與第2泳道中重組質粒前面的那條帶近似，但卻變得喑了，可以判斷為未被酶切的重組質粒，也說明泳道2中扱前而的那條帶為外源dna重組質粒。帶（3）人小與酶 切puc19質粒大小和似，可以判斷為重組質粒酶切后的質粒載體；而帶（4）大小在564bp左右,為酶切開的入dna片段。圖2巫組質粒1酶切對比如圖3所示。泳道為入dna/iiindiii,泳道20為puc19/hindiii,泳道4為本組重 組質粒樣品2,泳道5為重組質粒的酶切。帶（2）大小4000左右，與第4泳道屮的重組質粒位置近似，因此帶（2）可以理解為 未被酶切開的重組質粒；帶（3）大小與酶切puc19質粒人小和似，可以判斷為重組質粒 酶

15、切后的質粒載體；而帶（4）大小在2322 bp左右，為酶切開的入dna片段。泳道4中，在重組質粒上方又出現了一條帶（1）,人小在4316bp左右，對能為酶切開 而沒有連接上的入dna片段。圖3重組質粒2酶切對比（二）重組質粒的pcr驗證結果1. 瓊脂糖電泳展示的克隆片段的pcr擴增結果如下圖：圖4笫1-5組重組質粒的pcr驗證結果從左到右各泳道點樣如下表所示：從圖中可以看出，第8泳道沒有條帶，這是由于第3組的同學操作失誤，忘記加564bp 模板造成的。我所在的組別是第1組，即泳道2、3 o泳道2為564bp模板，泳道3為木組樣品中的2號樣品。具體分析如下：圖5 pcr擴增冃的基因結果圖圖6本組

16、重組質粒2及酶切圖圖5中,泳道1為dl2000plus,泳道2為模板564bp,泳道3為本組提取的兩個樣品中 的一個重組質粒2。泳道9是以puc19質粒代替模板pcr擴增產物，泳道10是以 ddh20代替模板pcr擴增產物°泳道2為564bp模板pcr產物，顯示的條帶大小為 750bp左右，因為兩引物間序列的長度是150bp,所以泳道2顯示的條帶結果較為理想。 泳道3為本紐所捉重紐質粒2,其酶切圖如圖6所示。其中泳道1為x dna/hindiii,泳 道4、5分別為重組質粒及其酶切條帶。泳道5中的帶（4）為酶切后的x dna片段，大 小為2322bp0將此條帶進行pcr擴增后，得到的

17、條帶即為圖5屮的泳道三所示條帶，此條 帶在2000bp-3000bp之間，基本與插入片段的大小和符。泳道9以puc19質粒代替模板 pcr擴增產物作為模板對照。顯示的較明顯的條帶在100bp-250bpz間,應為150bp的引物序列，是fl的擴增片段，泳道9中無其他朵帶，結果較為理想。泳道10以ddh2o代替 模板pcr擴增產物作為陰性対照，但出現了彌散性條帶，推測可能是引物設計中，出現引 物白身配對結合的情況導致的引物二聚體。2. 克隆片段的定量讓算量取dnamarker dl2000plus條帶的遷移距離（如表1所示）。以遷移距離為橫坐標， dna大小的對數為縱坐標，繪制曲線（如圖7所示）

18、。測得圖4中第2、3泳道所示條帶的遷移距離分別為3.51cm和2. 40cm。根據標準曲線 （r2二0. 9785）計算出片段大小分別為660bp和2511bpo實際片段大小應分別為714bp和 2472bp,誤差分別為7. 6%和1. 6%。3.83.63.43.23.0lg（bp）2. 82.62.42.22.01.8migration distance/cm圖1克隆片段大小與電泳遷移距離六.注意事項1. 限制性內切酶的酶切反應屬于微量操作技術，無論是dna樣品還是酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性并確保樣品和酶全部加入反應體系；2. 酶切反應的所有塑料制甜（eppendorf管、

19、吸頭等）必須是新的，并經過高溫滅菌， 操作時打開使用，操作過程不要求無菌，但要注意手和空氣小雜酶的污染，因此要求環境 干凈，戴手套操作，盡量減少走動，縮短eppendorf管的開蓋時間。3. 注意酶切加樣的順序，一般先加重蒸水，其次加緩沖液和dna,最后加酶。前幾步要 把樣品加到管底的側壁上，加完后用力將其甩到管底，而酶液要在加入前從-20°c冰箱取 出，酶管放置在冰上，収酶液時洗頭應從表面吸取，防止出于插入過深而使吸頭外壁沾染 過多的酶液，取出的酶液應立即加入反應混合也得液血以下，并充分混勻。酶液使用完畢 后立即放回冰箱，防止酶的失活。4. tm值(解鏈溫度)=4(g+c)+2(a

20、+t),復性溫度二tm值-(510°c),本實驗兩個引物的 tm分別為64.7°c, 57.9°c,選用退火溫度為58°c,這是因為在tm值允許范圍內，選擇 較高的復性溫度可人人減少引物和模板間的非特異性結合，提高pcr反應的特異性。5. pcr管的蓋子一定要蓋緊，以防蒸干。七.分析與討論(%1) pcr反應的要索在pcr反應體系中主要存在5類物質,即引物、酶、dntp、模板和mg2+。1. 引物引物是pcr特杲性反應的關鍵，pcr產物的特杲性取決于引物與模板dna互補的程度。 理論上，只要知道任何一段模板dna序列，就能按其設計互補的寡核甘酸鏈做引物，

21、利用 pcr就可將模板dna在體外人量擴增。設計引物應遵循以卜-原則：(1) 引物長度：引物長度根據統計學計算，長約17個堿基的寡核甘酸序列在:基因組中可能出現的機率的為1次。因此，引物長度一般最低不少于16個核昔酸，而 最高不超過30個核葫酸。典型的引物18到24個核苗長。引物需要足夠長，保證序列獨 特性，并降低序列存在丁非tl的序列位點的可能性。但是長度大于24核苻的引物并不意 味著更高的特異性。校長的序列可能會與錯謀配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序 列雜交慢，從而降低了產量。(2) 引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特左條件下可擴增長至10kb的片段。(3) 引物堿基：(g+

22、c)含量以40-60%為宜，(g+c)太少擴增效果不佳，(g+c)過多易出現非特異條帶。a、t、g、c最好隨機分布，避免5個以上的嚟吟或卩密噪核苻酸 的成串排列。(4) 避免引物內部出現二級結構，尤其是發夾結構。兩個引物之間不應發生互補，特別是在引物3,端，即使無法避免，其3,端互補堿基也不應大于2個堿基，否 則易生成引物二聚體，產生非特升的擴增條帶。（5）引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免兇末端堿基不配對而導致pcr失敗。（6）引物中有或能加上合適的酶切位點。被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。（7）引物的特異性：引物

23、應-與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量：毎條引物的濃度0. 1lumol或10-loopmol,以最低引物量產生所需要的結果為 好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，月增加引物z間形成二聚體的機會。木次實驗所使用的上下游引物m13f、m13r分別與pucl9多克隆位點兩端的24bp長度的 序列配對。其引物序列分別為（5 -3' ） : m13f/ cgc cag ggt ttt ccc agt cac gac； m13r/agc gga taa caa ttt cac aca gga。puc19 載體上兩引物之間的長度為 150bp,因 此目的擴增的片段長度=（多克隆位

24、點插入片段長度+150bp）。上下游引物的tm值分別為 64.7c和57.9c,相差達到6. 7°c，基本符合引物設計要求。2. 聚介酶及其濃度taq dya聚合酶是從棲熱水牛菌中提純的天然酶或是大腸菌合成的基因工程酶3。木次 實驗催化pcr反應的酶量為0.05 u/ul,如果聚合酶的濃度過高可引起非特界性擴增，濃 度過低則合成產物量減少。3. dntp的質量與濃度dntp的質量與濃度和pcr擴增效率有密切關系，在pcr反應中，dntp應為50 200umol/l （本次實驗為200umol/l） 。 4種dntp的濃度應相等,如其中任何一種濃度不 同于其它幾種時（偏高或偏低），就會

25、引起錯配。如果4種dntp濃度過低會降低pcr產物 的產量，而dntp濃度過高則會與mg2+結合，使游離的晦2+濃度降低。4. 模板模板的量與純化程度，是pcr成敗與否的關鍵環節2，提取的核酸町直接作為模板用 于pcr反應。模板的量應適屮（木實驗為0.4 ng/ul）,。如果模板的量過低會降低pcr 產物的產量，而模板的量過高則會與mg2+結合，使游2+離的驅濃度降低。另外，模板純化程度過低會產生非目的擴增產物。5. mg2+血2+濃度對pcr擴增的特異性和產量有顯著的彩響，在pcr反應中，mg2+濃度過高， 反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低taq dna聚合酶的活性，使反應產物

26、 減少。（二）pcr反應條件的選擇pcr反應條件為溫度、吋間和循壞次數。1溫度與時間設置基于pcr原理三步驟而設置變性、退火、延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點 法，雙鏈dna在9095°c變性，再迅速冷卻至4060°c,引物退火并結合到靶序列上， 然后快速升溫至7075°c,在taq dna聚合酶的作用下，使引物沿模板延伸。對于較短 靶基因（長度為100300bp時）對采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可 合二為一，一般采用94°c變性，65°c左右退火與延伸。（1）變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致pcr失敗的最主

27、要原因。一般 情況卜，9394°clnhn足以使模板dna變性，若低于93°c則需延長時間，但溫度不能過 高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或pcr產物完全變性，就 會導致pcr失敗。（2）退火溫度與時間：退火溫度是影響pcr特異性的較重要因索。變性后溫度快速冷 卻至40°c60°c,可使引物和模板發生結合。由于模板dna比引物復朵得多，引物和模 板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的 長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核廿酸，（g+c）含量約50% 的引物，55°

28、;c為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助 選擇合適的溫度：tm 值（解鏈溫度）=4（g+c） +2 （a+t）復性溫度二tm值-（510°c）在tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高pcr反應的特異性。復性時間一般為3060s,足以使引物與模板之間完全結合。（3）延伸溫度與時間：taq dna聚合酶的生物學活性：7080°c 150bp /s酶分子70°c 60bp/s酶分子55°c 24bp/s*酶分子高于90°c時，dna介成兒乎不能進行。pcr反應的延伸溫度一般選擇在7075°cz 間,常用溫度為72°c,過高的延伸溫度不