1、高效液相色譜法1 簡述 高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵人裝有填充劑的色譜柱，對供試品進(jìn)行分離側(cè)定的色譜方法。注人的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)人檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。1.1 對儀器的一般要求 所用的儀器為高效液相色譜儀，由高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成，儀器應(yīng)按現(xiàn)行國家技術(shù)監(jiān)督局“液相色譜儀檢定規(guī)程”定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。色譜柱內(nèi)徑一般為3.94.6m，填充劑粒徑為310m。超高效液相色譜儀是適應(yīng)小粒徑（約2m）填充劑的耐超高壓、小進(jìn)樣量、低死體積、高靈敏度的高效液相色譜儀。1.1.1 色譜柱反相

2、色譜柱：以鍵合非極性基團(tuán)的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物符合硅膠和聚合物等；常見的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基鍵合硅膠等。正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團(tuán)的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反相色譜。離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。色譜柱的內(nèi)徑與長度，填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、載體表面基團(tuán)殘留量，填充的致密與均勻程度等均影響色譜

3、柱的性能，應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)來選擇合適的色譜柱。溫度會影響分離效果，品種正文中未指明色譜柱溫度時系指室溫，應(yīng)注意室溫變化的影響。為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的溫度，但一般不宜超過60。最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠(如氛基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等)也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑;分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑;對映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。 填充劑的性能(如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基

4、團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等)以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。孔徑在15nm(lnm=10Å)以下的填料適于分析分子量小于2000。的化合物，分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。 除另有規(guī)定外，分析柱的填充劑粒徑一般在310m之間。粒徑更小（約2m）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)徑約2mm)）。使用微徑柱時，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配;如有必要，色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時，應(yīng)以品種正文規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40，為改善分離效

5、果可適當(dāng)提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60。流動相的pH值應(yīng)控制在2-8之間.當(dāng)pH值大于8時，可使載體硅膠溶解;當(dāng)pH值小于2時，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用pH值大于8的流動相時，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機(jī)一無機(jī)雜化填充劑或非硅膠填充劑等;當(dāng)需使用pH值小于2的流動相時，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑，或有機(jī)一無機(jī)雜化填充劑等。1.1.2 檢測器 最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的

6、檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與待測溶液的量有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應(yīng)，結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)在蒸發(fā)光散射檢測器的響應(yīng)值幾乎僅與被測物質(zhì)的量有關(guān)。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)和示差折光檢測器的響應(yīng)值與待測溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器的響應(yīng)值與待測溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進(jìn)行計算時，一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外-可見分光檢測器，所用流動

7、相應(yīng)符合紫外一可見分光光度法(中國藥典2015年版四部通則0401)項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)性鹽組分的流動相。1.1.3 流動相 反相色譜系統(tǒng)的流動相常用甲醇一水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，用紫外末端波長檢測時，宜選用乙腈-水系統(tǒng)。流動相中應(yīng)盡可能不用緩沖鹽，如需用時應(yīng)盡可能使用低濃度緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時，流動相中有機(jī)溶劑一般不低于5%，否則易導(dǎo)致柱效下降、色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。正相色譜系統(tǒng)的流動相常用兩種或兩種以上的有機(jī)溶劑，如二氯甲烷和正己烷等。各品種項下規(guī)定的條

8、件除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、填充劑粒徑、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)供試品并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗的要求。其中，調(diào)整流動相組分比例時， 當(dāng)小比例組分的百分比例X小于等于33%時，允許改變范圍為0.7X1.3X；當(dāng)X大于33%時，允許改變范圍為X-10%X+10%。若需要用小粒徑（約2m）填充劑，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也應(yīng)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對其結(jié)果產(chǎn)生爭議時，應(yīng)以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。對于必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分

9、離要求的品種，可在該品種正文項下注明。1.2 系統(tǒng)適用性試驗色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、重復(fù)性和拖尾因子等五個參數(shù)。按各品種項下要求對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗，必要時，可對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，應(yīng)符合要求。2.1.1 色譜柱的理論板數(shù)(n) 用于評價色譜柱的效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì)，一般為待測組分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。 在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留

10、時間tR和峰寬(W)或半高峰寬(Wh/2 )，按n=16(tR/W)2或n=5.54 (tR/ Wh/2)2計算色譜柱的理論板數(shù)。tR、W、Wh/2可用時間或長度計（下同），但應(yīng)取相同單位。2.1.2 分離度(R) 用于評價待側(cè)組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo).可以通過測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標(biāo)性成分（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其他難分離物質(zhì)）的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當(dāng)?shù)姆椒ń到猓ㄟ^測定待測組分與某一降解產(chǎn)物的分離度，對色譜系統(tǒng)進(jìn)行評價與調(diào)整。無論是定性鑒別還是定量測定，均要求待測物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰或特定的雜

11、質(zhì)對照色譜峰及其他色譜峰與相鄰色譜峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。分離度的計算公式為 R=2(tR2一tR1)/(W1+W2) 或R=2(tR2一tR1)/1.70 (W1.h/2+W2.h/2)式中，tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tRl為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W1 、W2及W1.h/2 、W2.h/2 分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬。當(dāng)對測定結(jié)果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)(n)和分離度(R)均以峰寬(W)的計算結(jié)果為準(zhǔn)。2.1.3 重復(fù)性 用于評價連續(xù)進(jìn)樣后，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標(biāo)法時，通常取各品種項下的對照品溶液，

12、連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%；采用內(nèi)標(biāo)法時，通常配制相當(dāng)于80%. 100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣2次，計算平均校正因子。其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。2.1.4 拖尾因子（T）用于評價色譜峰的對稱性。拖尾因子計算公式為： T=W0.05h/2d1式中，W0.05h為5%峰高處的峰寬；d1為峰頂在5%峰高處橫坐標(biāo)平行線的投影點至峰前沿與此平行線交點的距離。以峰高作定量參數(shù)時，除另有規(guī)定外，峰高法定量時T應(yīng)在0. 951.05之間。以峰面積作定量參數(shù)時，一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積積分，

13、但嚴(yán)重拖尾會影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準(zhǔn)確性，此時應(yīng)在各品種正文項下對拖尾因子作出規(guī)定。2.1.5 靈敏度 用于評價色譜系統(tǒng)檢測微量物質(zhì)的能力，通常以信噪比(S/N)來表示。通過測定一系列不同濃度的供試品或?qū)φ掌啡芤簛頊y定信噪比。定量測定作業(yè)指導(dǎo)書指導(dǎo)書編號 TYFDC-SOP-FF-028高效液相色譜法第5頁 共10頁第二版 批準(zhǔn)李忠華初審吳雅凝起草郭欣時，信噪比應(yīng)不小于10；定性測定時，信噪比應(yīng)不小于3。系統(tǒng)適用性試驗中可以設(shè)置靈敏度實驗溶液來評價色譜系統(tǒng)的檢測能力。1.3 測定法1.3.1 內(nèi)標(biāo)法按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適

14、量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量進(jìn)樣，記錄色譜圖。測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子 校正因子(f)=(As/cs)/(AR/cR) 式中As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高; AR為對照品的峰面積或峰高; cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度; cR為對照品的濃度。 再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量 含量(cx)=f.Ax/(As/cs)式中，Ax為供試品峰面積或峰高；cx為供試品的濃度；As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；f為內(nèi)標(biāo)法校正因子。采用內(nèi)標(biāo)法，可避免因樣品前處理或進(jìn)樣體

15、積誤差對測定結(jié)果的影響。 1.3.2 外標(biāo)法按各品種項下的規(guī)定，精密稱(量)取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積或峰高)，按下式計算含量 含量(Cx)=CR(Ax/AR)式中各符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測定供試品中成分或雜質(zhì)含量時，以手動進(jìn)樣器定量環(huán)或自動進(jìn)樣器進(jìn)樣為宜。1.3.3 加校正因子的主成分自身對照法測定雜質(zhì)含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱(量)取待測物對照品和參比物質(zhì)對照品各適量，配作業(yè)指導(dǎo)書指導(dǎo)書編號 TYFDC-SOP-

16、FF-028高效液相色譜法第6頁 共10頁第二版 批準(zhǔn)李忠華初審吳雅凝起草郭欣制待測物校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按下式計算待測物的校正因子。校正因子(f)=(cA/AA)/(cB/AB) 式中cA為待測物的濃度；AA為待測物的峰面積或峰高;；cB為參比物質(zhì)的濃度;；AB為參比物質(zhì)的峰面積或峰高。也可精密稱（量）取主成分對照品和雜質(zhì)對照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，繪制主成分濃度和雜質(zhì)濃度對其峰面積的回歸曲線，以主成分回歸直線斜率與雜質(zhì)回歸直線斜率的比計算校正因子。校正因子可直接載人各品種項下，用于校正雜質(zhì)的實測峰面積。需作校正計算的雜質(zhì)，通常以主成分為參比，采用

17、相對保留時間定位，其數(shù)值一并載人各品種項下。測定雜質(zhì)含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤海鳛閷φ杖芤海M(jìn)樣，記錄色譜圖，必要時，調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍（以噪聲水平可接受為限）使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量程的10%-25%。除另有規(guī)定外，通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)小于10%；含量在0.5%2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于2%。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進(jìn)樣，除另有規(guī)定外，供試品溶液的記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖各雜

18、質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，計算各雜質(zhì)含量。1.3.4 不加校正因子的主成分自身對照法測定雜質(zhì)含量時，若無法獲得待測雜質(zhì)的校正因子，或校正因子可以忽略，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述1.3.3法配制對照溶液、進(jìn)樣調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍和計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進(jìn)樣。除另有規(guī)定外，供試品溶液的記錄時間應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算雜質(zhì)含量。作業(yè)指導(dǎo)書指導(dǎo)書編號 TYFDC-SOP-FF-028高效液相色譜法第7頁 共10頁第二版 批準(zhǔn)李忠

19、華初審吳雅凝起草郭欣1.3.5 面積歸一化法按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量進(jìn)樣，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質(zhì)檢查時，由于儀器響應(yīng)的線性限制，峰面積歸一化法一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。4 注意事項4.1 流動相的制備與保存 用高純度的試劑配制流動相.必要時照紫外一可見分光光度法進(jìn)行溶劑檢查，應(yīng)符合要求;水應(yīng)為新鮮制備的高純水，可用超純水器制得或用重蒸餾水。凡規(guī)定pH值的流動相，應(yīng)使用精密pH計進(jìn)行調(diào)節(jié)、除另有規(guī)定外，偏差一般不超過±0.2pH單位。配制好的流動相應(yīng)通過適宜的0.45m（或0.22m

20、 ）濾膜濾過，以除去雜質(zhì)微粒。流動相用前必須脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作、色譜柱的分離效率、檢測器的靈敏度以及基線穩(wěn)定性等。流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯等容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙睛等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致流動相受污染。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，以防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶人流動相引起pH值變化，對分離或分析結(jié)果帶來誤差。磷酸鹽、醋酸鹽緩沖液容易發(fā)霉變質(zhì)，應(yīng)盡量新鮮配制使用。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。4.2 溶液的配制與保存除另有規(guī)定外，采用規(guī)定溶劑配制對照品溶液和供試品溶液，定量測定時，對照

21、品溶液和供試品溶液均應(yīng)分別配制兩份。供試品溶液在注人液相色譜儀前，一般應(yīng)經(jīng)適宜的0.45m（或0.22m）濾膜濾過，以減少對色譜系統(tǒng)產(chǎn)生污染或影響色譜分離。應(yīng)根據(jù)試驗要求和供試品的穩(wěn)定性，設(shè)置待測溶液的貯存條件（如溫度、遮光等）。4.3 色譜柱的使用.與保存根據(jù)實驗要求和流動相的pH值范圍，參照色譜柱說明書，選用適宜的色譜柱。安裝色譜柱時應(yīng)使流動相流路的方向與色譜柱標(biāo)簽上箭頭所示方向一致。除另有規(guī)定外，不宜反向使用，否則會導(dǎo)致色譜柱柱效明顯作業(yè)指導(dǎo)書指導(dǎo)書編號 TYFDC-SOP-FF-028高效液相色譜法第8頁 共10頁第二版 批準(zhǔn)李忠華初審吳雅凝起草郭欣降低，無法恢復(fù)。進(jìn)樣前，色譜柱應(yīng)用流

22、動相充分沖洗平衡。經(jīng)色譜系統(tǒng)適用性試驗測試，應(yīng)符合要求。色譜柱在使用過程中，應(yīng)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動。溫度的突然變化或者機(jī)械震動都會影響柱內(nèi)固定相的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流動相流速時應(yīng)該緩慢進(jìn)行。試驗結(jié)束后，可按色譜柱的使用說明書，對色譜柱進(jìn)行沖洗和保存。一般來講，對于反相色譜柱，如使用緩沖液或含鹽溶液作為流動相，在試驗結(jié)束后，應(yīng)用10倍柱體積 0（如150mm柱長，約15mL）的低濃度的甲醇/乙睛一水溶液（10%-20%）沖洗，使色譜柱內(nèi)的鹽完全溶解洗脫出，再用較高濃度的甲醇/乙睛一水溶液（50%）沖洗，最后用高濃度的甲醇/乙臘一水溶液（8

23、0%-100%）沖洗，使色譜柱中的強(qiáng)吸附物質(zhì)沖洗出來。如色譜柱需長期保存，反相柱可以貯存于甲醇或乙睛中，正相柱可以貯存于經(jīng)脫水處理后的正己烷中，離子交換柱可以貯存于含5%甲醇或含0.05疊氮化鈉的水中，并將色譜柱的兩端密封。以免于燥，室溫保存。4.4 流動相的調(diào)整為滿足色譜系統(tǒng)適用性要求，試驗中有時需要調(diào)整流動相組分的比例。在調(diào)整流動相組分比例時，當(dāng)小比例組分的百分比例X小于等于33%時，允許改變范圍為0.7X1.3X；當(dāng)X大于33%時，允許改變范圍為X-10%X+10%。下面舉例說明。4.4.1 二元流動相系統(tǒng)。例1兩組分比例為50:50按上述原則，X=50%，33%該流動相比例調(diào)節(jié)的范圍是

24、X-10%X+10%，即40:60至60:40。例2兩組分比例為2:98，X=2%，33%按上述原則，2%的允許改變范圍為0.7X1.3X，即1.42.6故該流動相比例調(diào)節(jié)的范圍是1.4:98. 6至2.6:97.4 。4.4.2 三元流動相系統(tǒng)例3三組分比例為60:35:5按上述原則，可每次調(diào)節(jié)流動相系統(tǒng)中比例較低的兩個組分。對35%的組分，其流動相比例調(diào)節(jié)的范圍是X-10%X+10%，即25%-45%，則流動相系統(tǒng)比例的調(diào)節(jié)范圍是50:45:5至70:25:5。作業(yè)指導(dǎo)書指導(dǎo)書編號 TYFDC-SOP-FF-028高效液相色譜法第9頁 共10頁第二版 批準(zhǔn)李忠華初審吳雅凝起草郭欣對于5%的

25、組分，其允許改變范圍為0.7X1.3X，即3.5%6.5%，則流動相系統(tǒng)比例的調(diào)節(jié)范圍是58.5:35:6.5至61.5:35:3.5。4.5 雜質(zhì)檢查時色譜參數(shù)的設(shè)置在進(jìn)行雜質(zhì)檢查時，選擇適宜的檢測靈敏度和設(shè)定適宜的積分參數(shù)非常重要。國內(nèi)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，通常制備與雜質(zhì)限度相當(dāng)濃度的對照溶液，用以調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使對照溶液的主成分色譜峰的峰高達(dá)滿量程的10%5%，再進(jìn)行供試品溶液的測定，以峰面積計算單個雜質(zhì)量和總雜質(zhì)量。目前國內(nèi)色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)大致有積分儀和色譜工作站兩種類型，對于傳統(tǒng)的積分儀，由于記錄儀的滿量程是固定的，因此檢測靈敏度的調(diào)節(jié)通常是調(diào)節(jié)檢測器的靈敏度使色譜峰高達(dá)到記錄儀滿量程的某個范圍;而對于色譜工作站，由于記錄標(biāo)尺的滿刻度是可調(diào)的，所以通常是調(diào)節(jié)滿刻度的設(shè)定值，使色譜峰的量程占滿刻度的某個范圍。 無論使用的是積分儀，或者是色譜工作站，如質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒有明確規(guī)定峰面積的取舍限值，或沒有設(shè)定靈敏度測試溶液，則在實際檢驗中，實驗者通常根據(jù)以往經(jīng)驗設(shè)定積分參數(shù)和小峰面積