1、實驗序號實驗名稱 質粒DNA的提取、酶切及其瓊脂糖凝膠電泳實驗時間是否小組合作是(V)否()一.實驗預習1.實驗目的:(1) 通過本次實驗學習和掌握堿裂解法提取質粒；(2) 通過本次實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA的方法和技術;2. 實驗原理：1) 質粒DNA的提取：(1) 關于質粒：質粒是一類存在于幾乎所有細菌中染色體之外(細胞質中)呈游離狀態(tài)的雙鏈、 閉環(huán)的DNA分子。質粒通常攜帶有染色體上所不存在的能夠表達產生抗生素、耐受重金屬等重要性狀的基因。細菌質粒的大小范圍從1kb至200kb以上不等，且 擁有自己的復制起始位點，可不依賴于染色體而進行獨立自主復制。 一些小的質 粒利用宿主細胞的

2、酶進行復制，而較大的質粒則自身攜有復制與編碼的有關酶。(2) 一般分離質粒DNA勺方法都包括3個步驟： 培養(yǎng)細菌，使質粒DNA大量擴增； 收集和裂解細菌； 分離和純化質粒DNA分離制備質粒DNA勺方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、 質粒分子大小、 堿基組成和結構等特點以及質粒 DNA勺用途進行選擇。(3) 堿裂解法提取大腸桿菌質粒DNA勺原理：堿裂解法提取質粒DNA1根據(jù)共價閉合環(huán)狀質粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學 上的差異來分離質粒DNA在pH值介于12.012.5這個狹窄的范圍內，線性的DNA雙螺旋結構解開而變性

3、， 盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相 互盤繞，仍會緊密地結合在一起。當加入 pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH至中 性時，共價閉合環(huán)狀的質粒DNA勺兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準 確；而線性的染色體DNA勺兩條互補鏈彼此已完全分開，因復性較緩慢且不準確 而相互纏繞形成不溶性網狀結構。而復性的質粒DNA恢復原來構型，保持可溶性 狀態(tài)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA蛋白質-SDS復合物等一起 沉淀下來而被除去，最后用酚氯仿可以抽提純化上清液中的質粒DNA2) 質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳：(1 )關于電泳技術：電泳常用于分離和純化那些分

4、子大小、電荷性狀或分個構象有所不同的生物 大分子一一尤其是蛋白質和核酸。正因為如此，電泳已成為生物化學和分子生物 學中應用最為廣泛的技術之一，其中在分子生物學實驗中最為常用的是瓊脂糖凝 膠電泳。瓊脂糖是一種海藻多糖，瓊脂糖膠分離范圍很大，但其分辨率卻相對較低。通過改變瓊脂糖凝膠的濃度，應用標準的電泳技術可以分離 200到50,000 bp大 小的DNA片斷。一般瓊脂糖膠濃度在0.5 %到4%之間，且瓊脂糖凝膠濃度越大， 凝膠就越硬。較高濃度的瓊脂糖膠有利于較小的 DNA片斷分離，而較低濃度的瓊 脂糖膠則可以分離較大的DNA片斷。(2) 瓊脂糖凝膠電泳條帶的觀察：通過觀察示蹤染料的遷移距離可以判

5、斷 DNA勺遷移距離。溴酚藍染料在瓊脂 糖凝膠的遷移速率大小與300和4000bp大小的雙鏈DNA片斷相同。當遷移足夠 距離后，就可以通過 Gelview染色來觀察DNA片斷。Gelview是一種熒光染料。 它可以在做膠時混入其中在電泳時進行染色， 也可以待電泳完成后將凝膠浸泡在 稀釋的Gelview溶液中進行染色。但必須將凝膠置于紫外透射儀中才可以對凝 膠中的DNA或 RNA進行觀察。(3) 質粒DNA勺瓊脂糖凝膠電泳分離：DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應，DNA分子在高于等電點的pH溶液環(huán)境中帶負電荷，在電場中向正極移動，由于磷酸骨架在結構 上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈

6、DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以相同 的速度向正極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效 應，即DNA分子本身的構型和大小。具有不同分子質量或者不同構型的 DNA分子 泳動速率不一樣，可以進行分離。未切割的質粒DNA在其泳道上也許會出現(xiàn)幾個條帶，之所以這樣是由于質粒 DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移距離是由其分子構象及其堿基對大小所決定的。質粒DNA以下列三種主要構象中的任何一種形式存在： 超螺旋DNA盡管質粒通常以開環(huán)的形式進行描述，然而在細菌細胞內DNA鏈即是盤繞在 組蛋白周圍形成一種致密的結構。 這就是所謂超螺旋結構，由于其結構致密，它 在凝膠中的泳動速度最快。

7、線性DNA當DNA損傷在DNA雙鏈相對應的兩條鏈上同時產生切口時，就會出現(xiàn)線性質 粒DNA這種DNA勺泳動速率介于超螺旋與切口質粒 DNA之間。 開環(huán)DNA在質粒DNA復制過程中，拓撲異構酶I會在DNA雙螺旋中的一條鏈中引入一 個切口，解開質粒的超螺旋。在質粒分離過程中由于物理剪切和酶的切割作用同 樣也會在超螺旋質粒中引入切口從而產生松散的開環(huán)結構。這種形式的質粒遷移速率最慢，其“松散”的分子形式阻礙了它在瓊脂糖凝膠中的運動。3. 實驗器材：(1) 實驗儀器(apparatus ):恒溫 培養(yǎng)箱 (Constant temperature incubator )、恒 溫搖床 (Constant

8、 temperature shaking table )、高速離心機(High speed centrifuge )、漩渦振 蕩器(Vortex mixer )、超凈工作臺(Bechtop)、高壓滅菌鍋(Autoclave )、微 量加樣器(Pipettes )、燒杯(beaker )、量筒 (graduated cylinder )、玻璃 棒(stir bar)、微波爐 (microwave)、天平(Pan balanee )、電泳梳子 (comb)、 電泳槽 (electrophoresis tank )、電泳器 (Electro-phoresis System )、紫 夕卜燈(Ultra

9、violet transilluminator)3) 、材料與試劑(Reagents)： 溶液 I (Solution I):50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羥基甲基氨基甲烷(Tris ) Tris-HCI (pH8.0); 10mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA pH8.0溶液I可成批配制，每瓶約100ml, 10磅高壓蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4C。 溶液U( Solutionn):新鮮配制，等體積混合0.2mol/L NaOH (臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋);1% SDS (可用10% 貯存液稀釋配制)注意：SDS易產生氣泡，不要劇烈攪拌。 溶液III(Solu

10、tion 叭100mL)：加上后混勻會形成絮狀沉淀60mL 5mol/L KAc ，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O(該溶液鉀離子濃度為3mol/L，醋酸根離子濃度為5mol/L ) TE液緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0); 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 70%乙醇； 平衡酚：氯仿1 : 1:將量取25 ml Tris-HCl(pH8.0)平衡苯酚，加入24 ml氯仿和1 ml異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4C保存。 LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl 15gpH 7.0 瓊脂糖(Agarose); 1 liter (升)

11、 5XTBE備用溶液(stock solution ):54g tris base ，27.5g 硼酸(boric acid )，20ml 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0; 6 X凝膠加樣緩沖液：0.25% 溴酚藍(bromophenol blue )，40% 蔗糖(sucrose in water );另外還有的試劑是：胰 RNA酶、DNA Marker、硼酸、Gelview試劑(2) 實驗材料：含有pUC19質粒的大腸桿菌等。4. 實驗方法步驟及注意事項1)實驗方法步驟第一部分：質粒DNA的提取及酶切(1) 取1.4 ml含pUC19這里的大腸桿菌培養(yǎng)物于1.5 ml微量離

12、心管中，4 000 r/min離心2分鐘，吸去上清液，并使細胞沉淀盡可能干燥；(2) 加100 7溶液I懸浮細菌沉淀，充分混和均勻，室溫放置10 min ;(3) 加200 Jl溶液n (新鮮配制)，蓋緊管口，輕緩上下4-6次顛倒離心管 以混合內容物。將離心管靜置冰上 5 min (使溶液變透明，粘稠)；(4) 加200叫溶液川(事先冰上預冷)，蓋緊離心管口后上下輕緩顛倒 4-6 次，置冰上15 min (溶液出現(xiàn)白色沉淀)；(5) 12 000 rpm離心15 min，轉移上清液至另一離心管(棄沉淀);(6) 向上清液中加入等體積的酚：氯仿(1: 1),反復混勻，12 000 rpm離心 5

13、min,取上清液移至另一離心管中；(7) 加2倍體積無水乙醇，振蕩混勻，靜置10 min, 12000 rpm離心5-10 min。 棄上清液，將離心管倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。(8) 加200 M 70 %乙醇洗滌沉淀物，12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉 淀在室溫下晾干(或在50C- 60r的烘箱中也可)。(9) 沉淀加20卩l(xiāng) TE,反復吹打使質粒DNA充分溶解，20C保存。第二部分：質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳I .凝膠的制備(Preparation of the gel )(1)制備1 %瓊脂糖凝膠：稱取0.5g瓊脂糖，放人錐形瓶中，加入 50mL的0.5

14、X TBE緩沖液，放入 微波爐加熱至完全溶化，則為0.5 %瓊脂糖凝膠液(由于蒸發(fā)作用，溶解前在容 量瓶上作一個記號，溶解后用三蒸水補足)；(2 )制膠器的安裝： 取多功能制膠器，洗凈，晾干； 將多功能制膠器放置于一水平位置，選擇12X 6cm制膠架，然后選擇1.5mm18teeth的梳子(最大加樣量25卩l(xiāng) ； 將所選擇規(guī)格的梳子插入制膠架的定位槽中；(3) 將熔化的瓊脂糖凝膠液轉入 Gelview專用的三角瓶中，然后加入Gelview 5 11 ；(4) 將冷到60C左右的瓊脂糖凝膠液三緩倒入所選擇的制膠槽內，直至有機 玻璃板上形成一層均勻的膠面(注意不要形成氣泡)；(5) 待膠凝固后(3

15、0-60min)，輕輕拔掉梳子，將凝膠盤從制膠槽中取出，放入 電泳槽內；(6) 加入電泳緩沖液(0.5 X)至電泳槽中；n .加樣(Loading DNA samples):用移液槍緩慢將DNA羊品及其經過酶切的質粒DNA羊品垂直加入加樣孔直至 開口下方(記錄點樣順序，以便作為對照和分析)，各加樣量如下：DNA samples : 1511酶切的 DNA羊品：311Loading buffer: 211 DNA markers : 611(DNA samples與 Loading buffer 總共加入 2011)IH .電泳(Gel):(1) 接通電泳槽與電泳儀的電源(注意正負極，DNA片段

16、從負極向正極移動)。 保持電壓120V ；(2) 當溴酚藍染料移動到凝膠總長度一半處時，停止電泳；IV . Gel Interpretation(凝膠圖像解釋)：將電泳后的凝膠放在紫外燈的照射下進行 DNA電泳條帶的觀察，并用凝膠電 泳成像系統(tǒng)進行拍照、分析。2)注意事項(1)加溶液I后，必須要將菌體懸浮徹底，不得有塊狀或大顆粒狀呈現(xiàn)，是質 粒dnA提取的首要關鍵;(2) TAE和TBE均為常用的緩沖液。TBE比TAE有相對高的緩沖能力。(3) 加樣染料溴酚藍可與長度約為0.5 kb的DNA一起遷移，可用于指示遷移 率最高的片段。(4) DNA的遷移速率取決于以下因素： DNA勺分子大小一分子

17、量越小，遷移越快。 瓊脂糖濃度一濃度越低，遷移越快。 DNA勺構象一環(huán)狀的或帶切口環(huán)狀的 DNA通常比線狀的DNAJ移要快。 兩個電極之間單位厘米的電壓一一電壓越高，遷移越快。(5) 如果DNA條帶不夠窄且不夠均勻，可能是內以下原因所引起： DNA過載 電壓過高加樣孔破損凝膠中有氣泡(6) 在紫外燈下觀察凝膠電泳所得結果應該戴上防護眼鏡，因為紫外線對眼睛 有傷害作用；二實驗內容1 實驗現(xiàn)象與結果：將電泳后的凝膠放在紫外燈的照射下觀察到的和用凝膠電泳成像系統(tǒng)進行拍照得到的DNA電泳條帶圖如下所示意：marker 112233圖注：x:代表經過酶切的質粒 DNA樣品的電泳條帶；x :代表未經過酶切

18、的質粒 DNA樣品的電泳條帶(x相同的互為對照組)marker:DNA 相對分子質量標準物。pUC19質粒DNA標準參照條帶圖像:2 對實驗現(xiàn)象、實驗結果的分析及其結論：（1）對實驗現(xiàn)象的分析及其結論：從上述所示的 DNA電泳條帶圖可以看出： 不管在DNA Sample中還是在經過酶切處理后的DNA羊品中均具有電泳遷移 速率處于中間的線性質粒 DNA而在此次試驗中出現(xiàn)線性質粒 DNA是因為pUc質 粒DNA在提取的過程中DNA雙鏈在相對應的兩條鏈上同時產生切口。這說明質粒制備過程個出現(xiàn)線性 DNA說明存在核酸酶污染或實驗操作有問 題。可能在其中混有少量的蛋白質（圖中，位置在marker組最后一

19、電泳條帶后方的很可能就是蛋白質組分），或者在實驗的提取過程中加入溶液U所經歷的時 間過長，在堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂，從而使提取的質粒DNA羊品 混入了基因組DNA但是其中各組也存在超螺旋 DNA（與 marker組對照，電泳速率最快，跑在 最前面的）。標號為1、2和3組的電泳條帶存在開環(huán)質粒 DNA（與marker組的 最后一條帶相比較，同在一條水平線上且較亮的一條條紋即為開環(huán)質粒DNA，而且只出現(xiàn)在未經過酶切的質粒 DNASample中，這說明在此次實驗過程中酶切 是徹底的。從總體上觀察，所有電泳條帶的亮度并不高，可能是提取的質粒DNA量較少 （濃度過低）或電泳前加樣量過少所致

20、。（2）對實驗分析及其結論：溶液I的作用：懸浮大腸桿菌菌體，而且加溶液I后，必須要將菌體懸浮徹底， 不得有塊狀或大顆粒狀呈現(xiàn)，是質粒DNA提取的首要關鍵。且其中含有的溶霉菌 可以水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的B -1,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。另外葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會很快沉積到管子的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA! Ca2+和 Mg+等二價金屬離子的螯合劑，在溶液I中加入EDTA是要把大腸桿菌細胞中 的二價金屬離子都螯合掉，從而起到抑制 DNase對DNA的降解和抑制微生物生 長的作用。另外也可保證溶菌酶活性。溶液U的作用

21、：提供堿性條件，在NaOHW SDS的共同作用下使大腸桿菌瞬間裂解，并變性 核DNA當細胞懸浮于NaOH和十二烷基酸鈉（SDS溶液中使，在高pH （堿性環(huán) 境）的作用下細胞發(fā)生裂解，此外蛋白質和染色體DNA發(fā)生變性與細胞碎片一起 沉淀下來。這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer （雙層膜）結構向micelle （微囊） 結構的相變化。新配制的溶液U避免作為最佳溶解細胞的試劑一NaOH接觸空氣中的CQ過久而減弱了堿性。用不新鮮的 0.4 MNaOH即便有SDS也無法有效溶 解大腸桿菌。因此必須使用新鮮的 0.4 M NaOH試劑進行配制。 溶液川的作用：該溶液所含有的高濃度鉀離子與溶液體系中的十二

22、烷基硫酸鈉（即SDS與NaOH所形成的可溶性物質）發(fā)生反應形成十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate,PDS ），從而將與之結合的絕大部分大腸桿菌蛋白質以及很長的 基因組DNA-起沉淀沉淀，與質粒分離開來；另外溶液川所含有的醋酸是為了中 和NaOH因為長時間的堿性條件會打斷 DNA基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是 50- 100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDS共沉淀，這樣就跟質粒 DNA共存 了。而且在整個質粒DNA勺提取過程中，沉淀DNA寸用無水乙醇及在高鹽、低溫 條件下進行都是為了用化學或物理手段將基因組DNA分子和蛋白質發(fā)生變性、在體系中的溶解度降低，較充分的分離提純出實驗所需的質粒DNA 酚氯仿抽提DNA體系后出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因：加入苯酚/氯仿/異戊醇，是為了進一步變性和沉淀蛋白。A. 水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；B. 酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大