1、實驗一ctab法提取植物基因組 dna實驗目的：學習從植物組織中（幼葉）提取基因組dna的基本原理和方法。實驗原理：采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由于植物細胞勻漿含有多種酶 類（尤其是氧化酶類），其對dna的抽提產生不利的影響，所以在抽提緩沖液中 需加入抗氧化劑或強還原劑（如巰基乙醇）以降低這些酶類的活性。在液氮中研 磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。ctab(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨)，是一 種陽離子去污劑，可溶解細胞膜并與核酸形成復合物。該復合物在高鹽的溶液中（0.7mol/l nacl）是可溶的，

2、通過有機溶劑抽提， 去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀（ctab能溶于乙醇）即可使核酸 分離出來。ctab溶液在低于15度時會形成沉淀洗出，因此再將其加入冰冷的植物材料 中之前必須預熱（65度），且離心溫度不要低于15度。實驗步驟：1、 取幼嫩的植物葉片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，轉入1.5ml離心管內。加 入等體積的65預熱的dna提取緩沖液置于65 的恒溫水浴搖床上1-2h(1.5h)。2、 加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，輕輕上下顛倒5分鐘，靜置5分鐘， 之后于12000rpm離心10分鐘。3、 吸取上層水相，重復步驟2一次。4、 吸取上層水相，加入預冷2/3體積的異丙醇，

3、輕緩顛倒2分鐘并置-20冰 箱內10min，待dna沉淀后于12000rpm離心收集，收集的dna于70% 乙醇中洗2-3 次。將棄去乙醇風干后的dna加適量水使其溶解。5、 待dna完全溶解后加入1-2l不含rnaasea（10mg/ml），37保溫1h以除 去dna中的rna。6、 于eppendorf管中加入1ml氯仿：異戊醇（24：1）輕輕上下顛倒10分鐘后 10000rpm離心10分鐘。7、 吸取上層水相并先后加入 1/10體積的 3m 醋酸鈉及 2 倍總體積的預冷的無 水乙醇，接著置于 -20冰箱，10分鐘后 10000rpm 離心10分鐘，棄去無水乙醇， 加入70乙醇洗滌2-3次

4、，風干，最后將dna溶于適量（200-500l） te中。28、待dna完全溶解后進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳，檢查 dna 的質量并據已知 的dna 分子量標準估計其濃度。調整濃度后的dna置于-20備用。實驗試劑：1、1m tris-hcl（ph8.0）121.1g tris溶于800ml無菌水中，加濃hcl調ph 到8.0，定容至1l，高壓滅菌。 2、0.5m edta（ph8.0）186.1g edta-na2h o溶于800ml無菌水中，需用磁力攪拌器劇烈攪動，用 naoh調ph值到8.0（約20g），定容至1l，高壓滅菌。3、3.5m nacl204.75g nacl溶于1l無菌水中

5、，高壓滅菌。4、10% ctab溶液10gctab溶于80ml無菌水中，定容至100ml，高壓滅菌。5、dna提取液（500ml）3.5m nacltris-hcledta10% ctabwater200ml50ml50ml100ml100ml6、 氯仿-異戊醇（24:1體積比）7、 rnaasea8、 異丙醇9、 無水乙醇10、 3m醋酸鈉11、 1te緩沖液實驗儀器：液氮罐、 1.5ml 離心管、 1.5ml離心管架、恒溫水浴搖床、槍及槍頭（ 1ml 和 200ul）、離心機（轉速可調至4000rpm和10000rpm）、剪刀注意事項（1） 葉片磨得越細越好。（2） 移液器的使用。（3） 由于植物細胞中含