.,疫苗如何制備,梁靜茹羅飛羅亞輝張萌,.,疫苗主要指將病原微生物（細菌、病毒、真菌、立克次氏體、支原體、衣原體等）及其代謝產物，經過人工減毒、滅火或利用基因工程等方法制成的用于預防傳染病的免疫佐劑，例如流感疫苗、乙肝疫苗、霍亂疫苗等。,.,疫苗的產生,天花（Smallpox）由天花病毒引起的一種烈性傳染病天花病毒：呈磚形，能對抗干燥和低溫，在痂皮、塵土和被服上可生存數月至一年半之久臨床表現：主要為嚴重毒血癥狀、皮膚成批依次出現斑疹、丘疹、皰疹、膿皰，最后結痂、脫痂，遺留痘疤。傳播途徑：飛沫吸入或直接接觸。特點：發展迅速，未免疫人群感染后15-20天內致死率高達30。,.,疫苗的產生,天花的防治中國宋真宗時期（998-1023年）：人痘法，吸入天花病人痂粉預防天花。明朝隆慶年間（1567-1572年）：痘衣法、痘漿法、旱痘法和水苗法等多種接種方法出現。清朝順治死于天花，得過天花的康熙繼位人痘法的缺點：有時也會引起嚴重的天花,.,疫苗的產生,天花的防治歐洲1721年，人痘接種法傳入英國1796年，英國醫生E.Jenner利用牛痘防治天花1798年，醫學界正式承認“疫苗接種確實是一種行之有效的免疫方法”。細胞培養法獲得天花病毒牛痘苗,.,Jenner是牛痘的發明者，但Jenner并不清楚為什么牛痘能夠預防天花。1870年，法國科學家Pasteur在對雞霍亂病的研究中發現，將雞霍亂弧菌連續培養幾代，可以將細菌的毒力降到最低，給雞接種這種減毒細菌后，可使雞獲得對霍亂的免疫力，從而發明了第一個細菌減毒活疫苗雞霍亂疫苗。Pasteur將此歸納為對動物接種什么細菌疫苗就可以使其不受該細菌感染的免疫接種原理，從而奠定了疫苗的理論基礎。因此，人們把法國科學家Pasteur稱為疫苗之父。,.,疫苗的產生,疫苗之父-法國免疫學家LouisPasteur雞霍亂弧菌減毒株（第一個細菌減毒活疫苗）,.,疫苗及其技術的發展簡史,減毒活疫苗制備第一次疫苗革命基因重組疫苗技術第二次疫苗革命反向疫苗學技術第三次疫苗革命,.,減毒活疫苗制備（卡介苗）第一次疫苗革命,Calmette和Guerin將一株從母牛分離到的牛型結核桿菌在含有公牛膽汁的培養基上連續培養230代，經過13年后獲得了減毒的卡介苗（BCG），這種菌苗首先使敏感動物豚鼠不再感染結核桿菌。卡介苗于1921年首次給一名新生兒經口服途徑進行免疫，嬰兒服用疫苗后無任何副反應。這名嬰兒在其母親死于肺結核病后雖與患有結核病的外祖母一起生活，與結核桿菌有密切接觸，但是在他的一生中卻沒有患結核病。由于卡介苗既安全又有效，到了20世紀20年代末，在法國已有5萬嬰兒服用了卡介苗。此后，卡介苗的使用由口服改成皮內注射。從1928年開始，卡介苗在全世界廣泛使用，至今已在182個國家和地區對40多億的兒童接種了卡介苗。,.,人為處理使病原微生物失去毒力或降低毒力,用無毒卡介菌（結核菌）人工接種進行初次感染，經過巨噬細胞的加工處理，將其抗原信息傳遞給免疫活性細胞，使T細胞分化增殖，形成致敏淋巴細胞，當機體再遇到結核菌感染時，巨噬細胞和致敏淋巴細胞迅速被激活，執行免疫功能，引起特異性免疫反應。,.,基因重組疫苗技術第二次疫苗革命,1986年應用基因工程制備的乙型肝炎表面抗原獲得成功，并正式作為乙肝疫苗用于臨床，成為最具典型意義的第二次疫苗革命的產物。最初的乙肝疫苗是從乙肝表面抗原陽性的攜帶者血漿中提取的，這對接種乙肝疫苗的健康人群來講其危險性是顯而易見的。將乙肝表面抗原的基因克隆到酵母菌等真核細胞中，其表達的抗原分子具有和血源疫苗一樣的結構和免疫原性。用基因重組制備乙肝疫苗，生產簡單、快速、成本低。乙肝基因重組疫苗不僅安全、效果好，而且可以源源不斷地供應臨床，不必像乙肝血源那樣擔心陽性血漿的來源和供應問題。,.,基因重組技術研究相關基因和蛋白質產物,.,反向疫苗學技術第三次疫苗革命,2000年6月26日美國Celera公司等宣布人類基因組測序的完成，標志著人類進入了后基因組時代。隨著這個時代的到來，生物科學從基因組學到蛋白質組學的新的研究模式已經初步形成，疫苗研究也開始改變過去從表型分析入手的思維方式，而是從全基因水平來篩選具有保護性免疫反應的候選抗原。這種以基因組為基礎的疫苗發展策略，有人稱之為反向疫苗學。反向疫苗學技術主要包括三個技術步驟：基因組信息分析結合基因芯片篩選候選疫苗成分高通量基因重組表達候選疫苗蛋白成分免疫保護性檢測,.,疫苗,組成作用原理類型與特點,.,組成,疫苗的組成：具有免疫保護性的抗原如蛋白質、多肽、多糖或核糖等與免疫佐劑混合制備而成。抗原是指能刺激機體產生免疫反應的物質。佐劑是指非特異性地增強免疫應答或改變免疫應答類型的物質，可先與抗原或與抗原一起注入機體。佐劑增強免疫應答的機制是：通過改變抗原的物理性狀，延長抗原在機體內保留時間；刺激單核巨噬細胞對抗原的遞呈能力；刺激淋巴細胞分化，增加擴大免疫應答的能力。,.,當機體通過注射或口服等途徑接種疫苗后，疫苗中的抗原分子就會發揮免疫原性作用，刺激機體免疫系統產生高效價特異性的免疫保護物質，如特異性抗體、免疫細胞及細胞因子等，當機體再次接觸到相同病原菌抗原時，機體的免疫系統便會依循其免疫記憶，迅速制造出更多的保護物質來阻斷病原菌的入侵，從而使機體獲得針對病原體特異性的免疫力，使其免受侵害而得到保護。,作用原理,.,類型與特點,減毒活疫苗滅活疫苗亞單位疫苗聯合疫苗核酸疫苗治療性疫苗,.,減毒活疫苗,通過一定方法使病原體的致病性減弱或喪失后獲得的由完整微生物組成的疫苗制品特點：能引發機體感染但不發生臨床癥狀，但其免疫原性可引發機體免疫反應，刺激機體產生特異性的記憶B細胞和記憶T細胞，起到獲得長期或終生保護的作用。,.,減毒活疫苗,優點：接種次數少，反應小，免疫效果好（體液免疫、細胞免疫、黏膜免疫），成本低缺點：穩定性差，有毒力返祖現象，污染環境，免疫缺陷者不能接種,.,滅活疫苗,將病原體經培養增殖、滅活、純化處理后獲得的保留病原體幾乎全部組分的疫苗制品。特點：失去了病原體的感染性，但保留了較強的免疫原性和較好的安全性,.,滅活疫苗,優點：穩定性好，反應小，免疫缺陷者也可接種缺點：需多次接種，免疫效果較差（體液免疫），需要量大,.,亞單位疫苗,利用微生物的某種表面結構成分制成的能誘發機體產生抗體的疫苗制品。分類：純化亞單位疫苗：單個蛋白或寡糖組成、佐劑合成肽亞單位疫苗：抗病毒/腫瘤/細菌、寄生蟲感染基因工程亞單位疫苗,.,類型與特點,.,聯合疫苗,兩種或兩種以上抗原物理混合后制成的疫苗制劑。多聯疫苗（multi-combinedvaccine）：預防不同病原微生物引起的傳染病（例：百白破）多價疫苗（multivalentvaccine）：預防由同一病原微生物不同亞型引起的傳染病（例：23價肺炎多糖疫苗）,.,核酸疫苗,也稱基因疫苗（geneticvaccine），包括DNA疫苗和RNA疫苗。由抗原的編碼基因和載體組成，導入機體細胞后可通過宿主細胞的轉錄系統表達蛋白抗原，誘導宿主產生細胞和體液免疫應答的疫苗制劑。,.,治療性疫苗,在已感染病原微生物或已患有某些疾病的機體中，通過誘導特異性的免疫應答，達到治療或防止疾病惡化的疫苗制品。最早的治療性疫苗：狂犬病疫苗,.,疫苗的制備方法,滅活全毒疫苗流感全病毒滅活疫苗減毒活疫苗皮內注射用卡介苗基因工程重組亞單位疫苗重組乙型肝炎疫苗生化提取亞單位組分疫苗吸附破傷風疫苗治療性疫苗前列腺癌疫苗Sipuleucel-T,.,疫苗生產的一般流程,.,滅活全毒疫苗流感全病毒滅活疫苗,本品系用世界衛生組織（WHO）推薦的并經國家食品藥品監督管理局批準的流感病毒株，分別接種雞胚，經培養、收獲病毒液，病毒滅活、濃縮和純化后制成。用于預防本株病毒引起的流行性感冒,.,流感病毒,甲型流感病毒最容易發生變異（抗原轉變、抗原漂移）世界性流感大流行：甲型流感病毒出現新亞型或舊亞型重現引起甲型流感病毒根據H(hemagglutinin，血凝素)和N(neuraminidase，神經氨酸酶)抗原不同分為許多亞型，H有17個亞型（H1H17），N有10個亞型（N1N10）。H1、H5、H7亞型為高致病性,.,流感病毒,乙型流感病毒（InfluenzaBvirus）抗原變異很慢局限性流行，對人類致病性較低丙型流感病毒（InfluenzaCvirus）抗原穩定致病力較弱，主要侵犯幼兒和免疫力低下的人群，只引起人類不明顯的或輕微的上呼吸道感染,.,流感全病毒滅活疫苗,（一）制備方法1.生產用原材料雞胚是分離各類病毒的較為理想的材料,.,（1）雞胚毒種傳代和制備：來源于SPF（SpecificpathogenFree）雞群疫苗生產：來源于封閉式房舍內飼養的健康雞群、9-11日齡無畸形、血管清晰、活動（2）毒種WHO推薦并提供的甲型和乙型流感病毒株,.,2.毒種種子批的建立及檢定符合“生物制品生產檢定用菌毒種管理規程”規定,.,2.毒種種子批的建立及檢定建立：以毒種為基礎傳代（5代以內得成品疫苗）檢定：血凝素型別鑒定試驗血凝抑制試驗單向免疫擴散試驗病毒滴度：雞胚半數感染劑量法血凝滴度：血凝法無菌檢查、支原體檢查外源性禽白血病病毒、禽腺病毒檢測：ELISA保存：凍干毒種-20以下，液體毒種-60以下,.,3.單價原液的制備各流感病毒工作種子批分別接種（尿囊腔），33-35培養48-72h病毒收獲（尿囊液）收獲液檢定微生物限度：菌數105CFU/ml，沙門氏菌為陰性血凝滴度收獲液合并,.,3.單價原液的制備病毒滅活（甲醛200g/ml）、驗證及內毒素含量測定濃縮（超濾）、純化（柱色譜法、蔗糖密度區帶離心）及過濾除菌（硫柳汞）單價原液保存（2-8）,.,4.半成品的制備對單價原液根據相同血凝素含量進行配制：15-18g/劑補加硫柳汞5.成品的制備半成品分批、分裝及凍干后包裝：0.5-1.0ml/劑，含各型流感病毒株血凝素為15g/劑,.,（二）檢定要求1.單價原液的檢定鑒別試驗：血凝抑制試驗、單向免疫擴散試驗病毒滅活驗證試驗：雞胚存活率、血凝試驗血凝素含量檢測：單向免疫擴散試驗,.,2.半成品的檢定游離甲醛含量50g/劑硫柳汞含量50g/劑血凝素含量：配制量的80%-120%無菌檢查,.,3.成品的檢定鑒別：單向免疫擴散試驗外觀：乳白色液體，無異物pH值：6.8-8.0硫柳汞含量50g/劑蛋白質含量200g/劑血凝素含量：配制量的80%-120%卵清蛋白含量250ng/劑抗生素殘留量50ng/劑,.,.,血凝抑制實驗,一種測定抗原或抗體的技術血凝現象：有血凝素的病毒能凝集人或動物紅細胞血凝抑制試驗：血凝現象被相應抗體抑制,.,單向免疫擴散實驗,將一定量抗體混于瓊脂凝膠中制成瓊脂板，在適當位置打孔后將抗原加入孔中，抗原擴散過程中與板中抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環沉淀環直徑或面積與抗原濃度呈正相關用標準抗原或國際參考蛋白制成標準曲線，即定量檢測未知標本的抗原濃度,.,酶聯免疫吸附測定,將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行的反應用于檢測特異性抗原和抗體特點：快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等分類：間接法、夾心法、競