金蟬花孢子粉及野生金蟬花粗多糖抗腫瘤作用初步報告,Applied report of Cordyceps cicadae and polysaccharide of wild cordycepssobolifera on Anti-tumors,2011年3月18日 香港,一、前 言,Introduction,蟬花Cordyceps cicadae屬蟲生性藥用真菌，生于蟬蛹體上，是蟬在羽化前，接近地面約34cm處，被蟬擬青霉等麥角菌科( Claviceptaceae)真菌寄生的產物。,其藥用始載于南北朝劉宋時代的雷公炮炙論。唐慎微所著經史證類備急本草言 “蟬花味甘寒，無毒，主小兒天吊，驚癇，夜啼，心悸”。本草綱目中亦記載：“蟬花可治療驚癇，夜啼心悸，功同蟬蛻”。,醫家認為蟬花是:一種與冬蟲夏草相近的珍貴藥材。,1. 蟬花的分類,大蟬草 大蟬草又名金蟬花，其子座一般單生、2個或多個，不分枝，棒狀，褐色；寄生的蟬若蟲較大。小蟬花 麥角菌科蟲草屬真菌小蟬草寄生于蟬科慈姑（Platylenre Kaempferi Fabr）幼蟲的體內所抽出的子座及寄生幼蟲尸體的干燥復合體。,蟬生蟲草 其子座聚生至近叢生，從成蟲寄主的整個腹部長出，子囊殼斜埋在子座內。蟬擬青霉 蟬擬青霉又名雌蟬花，屬半知菌類或有絲分裂孢子真菌，其孢梗束自蟲體頭部叢聚成束長出，淺黃色，長 1.56.0cm，前端膨大，呈紡錘形。,2. 蟬花的藥理作用, 免疫調節作用 調節脂類代謝 滋補強壯，提升機體的營養狀況 抗疲勞，抗應激 解熱鎮痛催眠作用 降血糖作用 抗腫瘤作用,日本學者Ukai等從蟬花中分離出一種水溶性多糖即半乳甘露糖，它由D-甘露糖和 D-半乳糖構成，二者比例4：3。當劑量為20mg/kg時，對小鼠S180肉瘤的抑制率為47。 蟬花粗提物能選擇性殺傷 G2/M期細胞，顯著抑制肺癌細胞株 PAA細胞生長。,一定濃度的蟬擬青霉多糖能使人外周血單個核細胞的增殖率升高，較高濃度多糖能抑制白血病細胞株U937、 K562的增殖，同時蟬擬青霉多糖能提高外周血單個核細胞表達 nTNF-、nIFN-。,Materials and Methods,二、材料與方法,1. 藥品 人工培養金蟬花孢子粉（孢子粉），批號：101201 野生金蟬花粗多糖（粗多糖），批號：110128 均由上海泛亞生命科學研究院提供 人工培養金蟬花孢子粉醇提物由蘇州中藥研究所植化室制備。 人工培養金蟬花孢子粉醇提物、野生金蟬花粗多糖 均用DMSO溶解后配成100mg/ml（DMSO含量5），4保存。,2. 實驗用腫瘤細胞（由中國科學院上海細胞庫供應）,3. 主要試劑： DMEM（高糖）、MEM及1640培養基，批號：1361834，Hyclone 產品。 胎牛血清（FBS），Hyclone 產品。 四氮唑藍 (MTT)、胰酶、二甲基亞砜（DMSO）、RNA酶（Rnase）、 碘化丙錠(Propidium Iodide，PI)，均為Sigma產品。 戊二醛、鋨酸等制作電鏡樣本所需試劑，由蘇州大學電鏡室提供。 Annexin V/PI 雙染試劑盒：Biouniquer Technology Co. LTD Wright-giemsa染色試劑盒：蘇州金萊生物科技有限公司。,4. 主要儀器設備 CO2 培養箱，Napco 5410 型，Napco 公司，美國。 醫用凈化工作臺，YJ-1450 B 型，吳江市設備凈化總廠。 倒置顯微鏡，CKX41，OLYMPUS 公司，日本。 酶聯免疫檢測儀，DG5032 型，南京華東電子集團醫療裝備有限公司。 流式細胞儀，EPICS XL 型，Beckman-Coulter 公司，美國。 熒光顯微鏡，IX71 型，OLYMPUS 公司，日本。 高速低溫離心機，5417R 型，Effendorf 公司，德國。 透射電子顯微鏡，H-600 型，Hitachi 公司，日本。 掃描電子顯微鏡，S-4700型，日立公司，日本。,三、實 驗 結 果,Results,（一）四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測結果,Fig. 1-1A. The inhibited rates of Cordyceps cicadae were detected by MTT assay （n=6）,表1-1A 金蟬花孢子粉對9株腫瘤細胞生長抑制率的影響 （n=6）,*P0.05, *P0.01 vs control group,*P0.05, *P0.01 vs control group,表1-1B 金蟬花孢子粉對11株腫瘤細胞生長抑制率的影響（n=6）,表1-2A 野生金蟬花粗多糖對9株腫瘤細胞生長抑制率的影響 （n=6）,Tab. 1-2A. The inhibited rates of Cordyceps cicadae polysaccharide were detected by MTT assay. （n=6）,*P0.05, *P0.01 vs control group,*P0.05, *P0.01 vs control group,表1-2B 野生金蟬花粗多糖對11株腫瘤細胞生長抑制率的影響（n=6）,（二） 瑞氏吉姆薩（Wright-giemsa）染色結果,Fig. 2-1 Effect of on SW1990 (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,圖2-1 金蟬花對人胰腺癌SW1990細胞形態學的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖組；G：5-氟尿嘧啶）,I,A control,B 50g/ml,C 100g/ml,D 250g/ml,I 100g/ml,F 1mg/ml,G 5-Fu(5),H 50g/ml,J 250g/ml,K 500g/ml,L 1mg/ml,E 500g/ml,孢子粉,粗多糖,圖2-2 金蟬花對人宮頸癌Hela細胞形態學的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：蟬花粗多糖組；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-2 Effect of on Hela (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,孢子粉,粗多糖,圖2-3 金蟬花對人回盲腸癌ccl-244細胞形態學的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖組；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-3 Effect of on ccl-244 (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,粗多糖,孢子粉,圖2-4 金蟬花對人橫紋肌肉瘤RD細胞形態學的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖組；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-4 Effect of on RD (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,孢子粉,粗多糖,圖2-5 金蟬花對人膠質瘤LN229細胞形態學的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖組；G：環磷酰胺）,Fig. 2-5 Effect of on LN229 (Light microscope 200) A: control group; H-L: Cordyceps cicadae for 48h respectively; G-K: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:100 M Cy.,粗多糖,孢子粉,圖2-6 金蟬花對人胃癌HGC-27細胞形態學的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖組；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-6 Effect of on HGC-27 (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,孢子粉,粗多糖,上述結果表明：人工培養金蟬花孢子粉和野生金蟬花粗多糖對體外培養的人胃癌HGC27、人白血病K562和PBL985/GPD、人橫紋肌肉瘤RD、人宮頸癌Siha、Hela、人胰腺癌SW1990、人膠質瘤LN229及人回盲腸癌ccl-244細胞等腫瘤細胞的增殖有一定的抑制作用。,（三） 流式細胞儀（PI單染）檢測結果,G1期： DNA合成前期,S期：DNA合成期,G2期：DNA合成后期,M期：有絲分裂期，DNA的復制,Cell Cycle,圖3-1 金 蟬花對人胰腺癌SW1990細胞周期的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.3-1 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of SW1990 treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,圖3-2 金蟬花對人白血病K562細胞周期的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶 ）,Fig.3-2 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of K562 treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide;D: 5 M 5-Fu.,圖3-3 金蟬花對人宮頸癌Hela細胞周期的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.3-3 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of Hela treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,表3-1 金蟬花對人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宮頸癌Hela細胞周期的影響,Tab.3-1 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of SW1990、K562 and Hela treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide.,流式細胞儀（PI單染）檢測結果表明： 金蟬花孢子粉醇提物和野生蟬花粗多糖可使人胰腺癌SW1990及人白血病K562細胞周期阻滯在G2期； 金蟬花孢子粉醇提物可使人宮頸癌Hela細胞周期阻滯在G1期。,腫瘤細胞死亡有哪幾種形式？,腫瘤細胞死亡的主要形式： 壞死（necrosis） 凋亡（apoptosis） 壞死性凋亡（necroptosis ） 自噬（autophagy）,（四） 流式細胞儀（Annexin V/PI雙染）檢測結果,金蟬花能否誘導腫瘤細胞凋亡？,圖4-1 金 蟬花對人胰腺癌SW1990細胞凋亡的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.4-1 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in SW1990 after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,3.85%,43.77%,12.11%,5.31%,A,B,C,D,左上象：死亡細胞,左下象：活細胞,右上象：晚期凋亡細胞,右下象：早期凋亡細胞,圖4-2 金蟬花對人白血病K562細胞凋亡的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.4-2 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in K562 after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,Fig.4-3 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in Hela after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,圖4-3 金蟬花對人宮頸癌Hela細胞凋亡的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,表4-1 金蟬花對人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宮頸癌Hela細胞凋亡的影響,Tab.4-1 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in SW1990、K562 and Hela after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h.,流式細胞儀（Annexin V/PI雙染）初步觀察結果: 金蟬花孢子粉作用人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宮頸癌Hela細胞48小時后，凋亡率分別為43.17%、52.59%和 86.75% ； 蟬花粗多糖作用人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宮頸癌Hela細胞48小時后，凋亡率分別為12.11%、33.35%、 57.5% 。,（五） 電鏡觀察結果,核大，核型不規則，有切跡，核質比值大，核仁明顯，細胞器豐富。（18000）,給藥前人胰腺癌細胞,胞核內核膜旁異染色質邊集，細胞膜溶解消失，線粒體腫脹，內質網擴張 ，呈壞死性凋亡。（12000）,孢子粉（1mg/ml）,圖 5-1. 透射電鏡觀察金蟬花對人胰腺癌SW1990及人宮頸癌Hela細胞超微結構的影響,胞核變小，核漿比值減小，核仁減小，異染色質增多，沿核膜邊集，呈早期凋亡形態 （22500） 。,核膜旁異染色質邊集，胞漿內空泡變性，可見自噬小體（18000） 。,人胰腺癌細胞粗多糖組（1mg/ml）,人胰腺癌細胞粗多糖組（1mg/ml）,核型不整，核膜有切跡，核漿比值大，雙核仁，細胞表面有微絨毛（9000）。,給藥前人宮頸癌Hela細胞（1mg/ml）,核小，核異染色質邊集在核膜旁，未見核仁 （22500）。,人宮頸癌Hela細胞孢子粉組（1mg/ml）,人宮頸癌Hela細胞孢子粉組（1mg/ml）,核膜旁異染色質邊集，可見自噬小體，脂質空泡（30000）。.,核膜旁異染色質邊集，胞質內線粒體腫脹，內質網擴張，細胞膜破損，呈壞死性凋亡（ 9000 ）,人宮頸癌Hela細胞粗多糖組（1mg/ml）,透射電鏡觀察結果表明： 1. 金蟬花孢子粉和粗多糖可誘導人胰腺癌SW1990、人宮頸癌Hela細胞和人胰腺癌SW1990細胞凋亡。 2. 金蟬花孢子粉和粗多糖可誘導人胰腺癌SW1990及人宮頸癌Hela細胞壞死性凋亡。 3. 金蟬花孢子粉和粗多糖可誘導人胰腺癌SW1990及人宮頸癌Hela細胞自噬。,金蟬花孢子粉和粗多糖對腫瘤細胞形態和 腫瘤細胞膜有什么影響呢？,細胞分裂末期，其中數對子細胞逐步分開，子細胞呈橢圓形（1000）。,給藥前人胰腺癌SW1990細胞,細胞呈不規則梭形，表面不平，有細長突起，較多微絨毛結構（ 1000）。,圖5-2 掃描電鏡觀察人胰腺癌SW1990及人宮頸癌Hela細胞表面結構,人胰腺癌SW1990孢子粉組（1mg/ml）,細胞變形，微絨毛減少，細胞表面塌陷，伴穿孔改變（1000）。,細胞變形，懸浮，表面塌陷，有裂縫，穿孔，微絨毛減少或消失，伴穿孔改變（ 800 ）。,人胰腺癌SW1990粗多糖組（1mg/ml）,給藥前人宮頸癌hela細胞,細胞表面密布微絨毛，邊緣有突起（1500）,細胞變形明顯，細胞膜表面有穿孔（1500）。,人宮頸癌hela細胞孢子粉組（1mg/ml）,細胞變細長，類似神經細胞樣形態改變，細胞膜表面微絨毛減少（ 3000 ）。,人宮頸癌hela細胞粗多糖組（1mg/ml）,細胞變形，細胞膜缺損，有穿孔（1000）。,細胞變形，微絨毛減少，穿孔明顯（3000）。,掃描電鏡初步觀察結果： 金蟬花孢子粉和粗多糖可使人胰腺癌SW1990及人宮頸癌Hela細胞變形，細胞膜發生穿孔、空洞等改變，破壞細胞膜的完整性。,綜上所述，我們從腫瘤細胞的形態、細胞膜結構、細胞內亞微結構、細胞增殖動力學及細胞死亡途徑等方面初步觀察了金蟬花的抗腫瘤作用。 我們在初步的實驗研究中有什