5 抗體庫技術,通過DNA重組技術克隆全套抗體可變區基因,并在原核系統表達有功能的抗體分子片段,這種全套抗體基因表達文庫稱為抗體庫 -沈倍奮:重組抗體在蛋白質組學研究中的應用 -細胞與分子免疫學雜志(Chin J Cell Mol Immunol)2003, 19(2):105-106,抗體庫技術的主導思想，是 將某種動物的所有抗體可變區基因克隆在質粒或噬菌體中表達 利用不同的抗原篩選出攜帶特異抗體基因的克隆，從而獲得相應的特異性抗體,基因工程抗體技術，是繼雜交瘤單克隆抗體技術以后抗體領域的又一次革命 “噬菌體抗體庫技術“又被譽為這次革命中的革命,該技術的最大優勢在于可以使人們繞過雜交瘤和免疫而建立天然全套噬菌體抗體展示文庫， 從庫中容易地篩選出任一感興趣的抗體,抗體庫技術包括的主要過程：,克隆出抗體全套可變區基因 與有關載體連接 導入受體菌系統 利用受體菌蛋白合成分泌等條件，將這些基因表達在細菌、噬菌體等表面 進行篩選與擴增，建立抗體庫,本章內容,5.1 初期的抗體庫 5.2 噬菌體抗體庫技術 5.3 大容量抗體庫 5.4 抗體庫技術的應用,5.1.1 背景 5.1.2 初期的抗體庫,5.1 初期的抗體庫,DNA重組技術的發展和抗體基因結構的闡明，促進了80年代初基因工程抗體的發展 基因工程抗體，極大地改善了抗體的性能和擴展了抗體的應用范圍,5.1.1 背景,抗體庫技術，通過DNA重組技術，克隆全套抗體可變區基因，在原核系統表達有功能的抗體分子片段（即抗體庫），從中篩選特異性抗體的基因。,兩項關鍵技術： PCR：用一組引物，擴增出全套免疫球蛋白的可變區基因 以大腸桿菌(或噬菌體)直接表達有功能活性的抗體分子片段,噬菌體展示技術（phage display）應用到抗體的表達與克隆,5.1.2 初期的抗體庫,Ward 等:,大腸桿菌表達出VH段,21 /2，000個克隆 與溶酶體特異性結合的克隆,PCR擴增出VH基因,脾細胞DNA,溶菌酶免疫小鼠,1989年 Huse 等， 在Science上發表了完整的抗體庫工作：,用逆轉錄-PCR技術從淋巴細胞克隆出抗體輕鏈基因庫（repertoire）和重鏈Fd段基因庫 Repertoire 所有的節目,將輕鏈和重鏈基因分別組建到噬菌體表達載體中，得到輕鏈基因庫和重鏈Fd段基因庫 通過DNA重組技術將輕鏈基因和Fd段基因隨機配對重組于一個表達載體中，形成組合抗體（基因）庫 P109,感染大腸桿菌，噬菌體形成噬菌斑 相應噬菌體載體上的鏈基因和Fd段基因得到表達，形成有功能的Fab段，釋放于噬菌斑內,將噬菌斑轉印到硝酸纖維素膜上 用標記的抗原篩選產生特異性抗體的克隆，得到其Fab段的基因， 建立了完整的抗體庫技術,較細胞融合雜交瘤技術的優越性：,1. 省去了細胞融合的步驟 2. 擴大了容量， 106 以上個克隆 3. 直接得到抗體的基因，不丟失，便于進一步構建抗體 4. 利用原核表達系統的優勢 5.可制備難于制備的抗體,5.2 噬菌體抗體庫技術,噬菌體展示技術 （phage display technology）的應用,5.2.1 噬菌體展示技術,將肽段的基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中 與噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白 呈現于噬菌體表面,特點：將特定分子的基因型和表型 統一在同一病毒顆粒內,5.2.1.1絲狀噬菌體,M13 fd f1,復制型DNA被用來做基因克隆的載體 基因組為單鏈環狀DNA 基因中有一段基因間隔區（intragenic region）,含有病毒合成的起始和終止信號，以及子代噬菌體生成組裝的信號,基因組共編碼10種蛋白質，包括結構蛋白和DNA 合成和子代噬菌體的包裝釋放所需蛋白 管狀蛋白外殼，蛋白（2 700-3 000個）， 蛋白質 和，蛋白質和,噬菌體對大腸桿菌的感染：,1.通過蛋白質對細菌表面性菌毛的識別感染細菌 2.感染后其基因組DNA 進入細菌 3.DNA 轉變為雙鏈DNA 4.在噬菌體蛋白的作用下，復制大量單鏈DNA 5.與細胞膜上的噬菌體外殼蛋白組裝成完整噬菌體。,用于噬菌體展示的基因和蛋白,蛋白：50個氨基酸，中央一段疏水，可先鑲嵌在細菌內膜上；可多價表達。 當外源蛋白的基因與基因融合，就會在噬菌體表面表達,蛋白：406個氨基酸，在感染的細菌內，羧基端固定在內膜上，氨基端朝向質周腔 每個噬菌體有3-5個副本，氨基端與大腸桿菌的性毛結合，介導感染；羧基端與子代噬菌體的釋放有關 可低價表達外源蛋白，有利于高親和性配體的篩選,5.2.1.2 噬菌體展示技術的選擇功能,篩選過程：,Propagation 增殖,優越性： 簡便易行 篩選能力強 可直接得到特異克隆編碼DNA,5.2.2 噬菌體抗體庫,將多樣性可變基因組裝到表達載體內，表達到噬菌體表面得到多樣性噬菌體抗體的集合，即噬菌體抗體庫（phage antibody library） 通過吸附-洗脫-擴增的富集過程，可有效地從噬菌體抗體庫中篩選到特異性抗體的可變區基因,5.2.2.1 噬菌體抗體,1. 噬菌體抗體表達的分子片段 表達 Fab時，將輕鏈基因和Fd基因組合在同一個表達載體內，或不同載體導入同一個大腸桿菌細胞內，一個基因與外殼蛋白形成的融合蛋白鏈固定在細胞內膜上，另一鏈分泌到質周腔，二者可形成有活性的抗體,表達ScFv時，通過重疊延伸拼接法（replicing overlap extension, ROE）用PCR直接將輕鏈和重鏈可變區基因組合在一起；構建ScFv時用可變區3端做引物，不受重鏈同種型的限制，有更好的多樣性。,重疊延伸PCR技術(gene splicing by overlap extension PCR,簡稱SOE PCR)由于采用具有互補末端的引物,使PCR產物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段重疊拼接起來. 此技術利用PCR技術能夠在體外進行有效的基因重組,而且不需要內切酶消化和連接酶處理,表達dsFV： 將可變區與基因融合，可在噬菌體表面表達出dsFv,表達 Diabody:與基因融合，可在噬菌體表面表達出雙鏈抗體,2. 噬菌體抗體的表達載體 絲狀噬菌體載體 將抗體基因克隆在基因5端前導序列的下游，融合蛋白可表達,噬粒為基礎載體 質粒含有絲狀噬菌體基因間隔區 在絲狀噬菌體蛋白存在時，介導噬菌體DNA的復制、包裝和釋放，產生子代噬菌體顆粒。,噬粒 (phagemid或phasmid) 是由質粒載體和單鏈噬菌體載體構建成的 它們既有質粒的復制起點，又有噬菌體的復制起點 在大腸桿菌細胞里，可以按正常的雙鏈質粒分子進行復制，生成雙鏈DNA,當宿主細胞受到輔助噬菌體感染后，噬粒載體便按單鏈噬菌體的方式進行復制，然后由輔助噬菌體提供的外殼蛋白包裝成噬菌體顆粒 輔助噬菌體是一類自身DNA復制效率極低的突變型，但可為宿主細胞的質粒DNA提供復制和包裝所需的蛋白酶和外殼蛋白,用輔助病毒超感染，輔助病毒提供所有的絲狀噬菌體蛋白，將噬粒DNA 以單鏈的形式包裝在噬菌體外殼蛋白內，形成病毒顆粒，可以感染大腸桿菌，但不產生（輔助噬菌體）子代噬菌體。,噬粒載體中插入抗體分子片段與基因或基因 融合蛋白將嵌在細菌內膜 輔助病毒感染細菌后 融合蛋白與野生型的蛋白或蛋白共同組裝到生成的噬菌體表面,3噬菌體抗體的價 在篩選低親和力噬菌體抗體時可選用多價的噬菌體抗體 篩選高親和力噬菌體抗體時應選用單價的噬菌體抗體,蛋白，2 700個亞基，多于10肽會影響蛋白功能，不能用噬菌體載體表達蛋白-抗體融合分子 噬粒做表達載體，來源于輔助病毒的野生型蛋白和蛋白-抗體融合蛋白共同組裝到噬菌體表面，各自的表達數目取決于兩者的相對數量 每一個噬菌體表面可表達24個左右的抗體分子,基因(蛋白 )： 用噬菌體載體產生多價抗體分子 用噬粒表達，所產生的噬菌體抗體顆粒中10%表達有抗體分子片段，單價,4 膜型和可溶性抗體分子的表達 膜型表達,可溶性抗體分子的產生：,在表達載體中基因或的兩端設計兩個適當的限制性內切酶位點，以除去外殼蛋白的基因,在抗體基因和外殼蛋白基因之間設計一個琥珀密碼子（TAG）： a 在含有琥珀抑制基因的宿主菌中，可翻譯為酪氨酸、色氨酸等，表達為抗體-外殼蛋白融合分子 b 在無抑制基因的宿主菌中則UAG為終止密碼子，抗體分子表達為可溶性蛋白,5.2.2.2 抗體庫篩選技術,1. 用于篩選的抗原 能夠將結合與非結合形式的噬菌體分離開的方法均可用于篩選 a 可溶性抗原包被于酶標板（聚苯乙烯） b 將抗原固定化到瓊脂糖微珠上，親和柱層析,C 生物素-抗原+ 抗體庫 生物素-抗原-抗體+ 磁珠-鏈親和素 磁珠-鏈親和素-生物素-抗原-抗體 磁場 特異性抗體分離,復雜抗原-細胞，可獲得與天然狀態下膜分子結合的抗體。 體內篩選，抗體從尾靜脈注入小鼠體內，2hr后取胸腺，回收結合的噬菌體抗體。,2. 回收與篩選策略 （1）結合抗體的回收 酸堿洗脫，最常用 Genenase 酶切部位的引入,.（2）利用特異性增加回收率 減差法：P114,anti-CD55 single-chain Fv 抗原遮蔽法:：遮蔽優勢抗原，篩選缺乏選擇優勢的抗體 路標選擇法（pathfinder selection） P115,（3）功能性篩選 抗體酶催化噬菌體抗體與固相基質產生共價結合,（4）選擇型感染 （selectively infective phage,SIP）,利用噬菌體蛋白的結構功能特點，使只有和特定抗原結合的噬菌體抗體能感染細菌得到擴展。 蛋白3各功能區： 氨基端N1：68Aa,與噬菌體傳入病毒有關 中間N2：131Aa,涉及與細菌表面菌毛的結合 羧基端CT：149Aa,含有穿膜錨定區，參與病毒顆粒的形成。 只有具備N1和N2的噬菌體才有充分的感染力。,原理： 構建抗體基因-蛋白 CT基因，噬菌體不能感染細菌 抗原-蛋白 N1和N2融合蛋白 選擇性感染回收特異性抗體 P117,5.3 大容量抗體庫,5.3.1 總抗體庫的容量 5.3.2 總抗體庫的多樣性 自學 相關概念： 庫容 親和力10-7-10-8/mol/L,解離常數,5.4 抗體庫技術的應用,5.4.1 制備人源抗體 5.4.1.1 從免疫后個體制備人源抗體 5.4.1.2 不經免疫制備人源抗體,5.4.2 應用抗體庫技術改良抗體性能 5.4.2.1 改善ScFv接頭的性能 5.4.